この作品は、PTR に健康の国民の協会 (R01 NS084941)、(ADHS16-162406) アリゾナ州医学研究委員会からの補助金によって支えられました。ワシントン州は、過去の国家機関の健康研修助成金 (T32 HL007249) 博士前期予定からサポート受けています。

下記すべての手続機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) によって承認されているし、国立衛生研究所 (NIH) と動物研究に準拠: In Vivo実験 (到着) ガイドラインを報告します。プロトコルの手順のフローは、図 1に描かれています。
1. セットアップ手順について
<ol><li>脳微小血管バッファー (BMB) を準備します。54.66 g D-マンニトール、1.90 g グリコールエーテルジアミン四酢酸、および 1.46 g 2-amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (すなわち、トリス) ベースをきれいなビーカーに計量して起動します。1.0 L の脱イオン水を追加します。磁性攪拌器を使用して BMB バッファーのコンポーネントをミックスします。ソリューションが完全に混合されて、一度 7.4 1.0 M HCl を使用してに pH を調整します。</li>
	<li>動物の麻酔前に 26% デキストラン (75,000 MW) ソリューション (w/v) を準備します。次の手順で説明するように、デキストラン ソリューションを準備します。 注: それがデキストランは緩衝水溶液で分解する約 1.5-2 時間を取ることができるので、早めにこのソリューションを準備する重要です。<ol>
<li>きれいなビーカーに粉末デキストラン (100 mL バッファーあたり 26 g) を重量を量る。</li>
		<li>BMB の適切な量を測定し、独立した、きれいなビーカーに分注します。</li>
		<li>BMB を粉末デキストランを含むビーカーにゆっくりと注ぐ。手動で BMB ガラス攪拌棒を使用しての注入中に粉末のデキストランをミックスします。</li>
		<li>使用してすぐに前 1.0 M HCl で 7.4 に pH を調整します。 注: 12 個別 Sprague-dawley ラット脳微小血管の典型的な分離 (男性または女性; 生後 3 か月; 200-250 g 各) デキストラン溶液 (すなわち、BMB の 200 mL で 52 g デキストラン) 200 mL が必要です。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. ラット脳組織の抽出
<ol><li>(50 mg/kg; 2.5 mL/kg i. p.) ケタミン ・ キシラジンを使用してラットの麻酔希望の実験的治療 (10 mg/mL; 2.5 mL/kg I、p.)。それぞれケタミン ・ キシラジンの 20 mg/mL と 4.0 mg/mL の最終濃度 0.9% 生理食塩水で希釈します。斬罪に IACUC ガイドラインに従って削ったギロチンを使用して動物を安楽死します。男性と女性の両方の Sprague-dawley ラットの同じ手順を使用します。</li>
	<li>外科はさみを使用して単一横カットすることによってラット頭蓋骨から皮膚を切除します。</li>
	<li>Rongeurs を使用して、慎重に頭蓋骨プレートを削除し、脳を公開します。</li>
	<li>ヘラを使って脳を削除します。大脳を外し、BMB の 5 mL を含む 50 mL の円錐管に隔離した脳細胞の場所します。プロテアーゼ阻害剤を使用する前にすぐに BMB のバッファーの 1.0 mL あたりカクテルの 1.0 μ L を追加します。</li>
</ol>3. 脳処理
<ol><li>きれいなペトリ皿に 50 mL の円錐管から脳組織を転送します。</li>
	<li>12.5 cm 径フィルター紙上大脳皮質に接着された疎外髄膜を削除する脳をロールバック鉗子を使用して、優しく。優しくフィルター ペーパーに対して脳組織を押しながら再び組織のロールします。この手順中に頻繁にろ紙をオンにします。</li>
	<li>鉗子による大脳半球から脈絡叢を区切ります。 注: 脈絡叢は、大脳の脳室の表面にローカライズされた明確な膜質の組織として表示されます。</li>
	<li>優しく脳組織を平らにし、残りの髄膜と鉗子による嗅球を削除します。</li>
	<li>冷えたグラスのモルタルに皮質の脳組織を配置します。モルタルに BMB 含むプロテアーゼ阻害剤カクテルの 5.0 mL を追加します。</li>
	<li>頭上式の電力ホモジナイザーを使用して、3,700 rpm ストローク上下 15 を使用して脳組織をホモジナイズしてください。10 mL の乳鉢と乳棒組織グラインダーを使用して均質化を実行します。それぞれの個々 のサンプルの均質化、間 70% のエタノールを使用して杵をクリーンアップします。 注: 均質化ペースの面で一貫しているべきストロークと大きさ。</li>
	<li>ラベル付き遠沈管に磨砕液を注ぐ。</li>
</ol>4. 遠心分離の手順
<ol><li>脳のホモジネートを含む各ラベル付き遠心管に 26% デキストラン溶液 8.0 mL を追加します。</li>
	<li>2 回チューブを反転し、徹底的に渦サンプル。脳ホモジネート液の 26% デキストランの徹底的な混合できるように複数のアングルを使用して各サンプルのボルテックスを実施します。</li>
	<li>4 ° C で 15 分間 5,000 × gで遠心分離機サンプル 注: いくつかの分析に便利です脳実質、脳微小循環を比較します。脳実質におけるタンパク質発現の評価すべき必要、この遠心分離のステップ (すなわち、脳実質分数) から清収集でき将来の使用に備えて-80 ° C で保存します。</li>
	<li>真空吸引装置を使用して上清を除去し、パスツール ピペットをガラスです。 注: ペレットを邪魔しないように注意する必要があります。そうでなければ、その大幅このプロシージャから蛋白質収量を低下させるが、収集した脳微小循環の量が削減されます。</li>
	<li>BMB 含むプロテアーゼ阻害剤のカクテル (すなわち、1.0 μ L プロテアーゼ抑制剤のカクテル BMB バッファーの 1.0 mL あたり) 5.0 mL にペレットを再懸濁します。渦ように徹底した混合ペレット。</li>
	<li>各遠心管と渦このプロトコルの手順 4.1 4.2 で説明されているように 26% デキストランの 8.0 mL を追加します。</li>
	<li>4 ° C で 15 分間 5,000 × gで遠心分離機サンプル</li>
	<li>真空フラスコ、ガラス ピペットを使用して、上清を吸引、脳微小血管を含むそのペレットが中断されないことを確認します。 注: 管壁に付着した余分な材料微小血管が含まれていないとする必要がありますが丁寧に掃除して削除します。</li>
	<li>手順 4.5 4.8 追加を 2 回。</li>
	<li>一度 4 デキストラン遠心分離手順が完了、各ペレットとサンプルを再懸濁しますに渦に BMB の 5.0 mL を追加します。 注: 4.10 のステップが完了した後、タンパク質局在の解析の全体の微小血管を収集できます。これは、再浮遊微小ペレットの分注 50 μ L を取り、ガラス顕微鏡スライドの上に塗りつけによって実現できます。微小血管が冷たいエタノールで固定後に追加 10 分スライドは 4 ° c までのイメージングに必要な格納できる暖房のブロック上で 10 分間 95 ° C で熱固定になります。</li>
</ol>5. 遠心合計脳微小血管膜のサンプルを準備するには
<ol><li>冷えたグラス ホモジナイザーにサンプルを転送します。</li>
	<li>頭上式の電力ホモジナイザーを使用して、3,000 rpm で 8-10 上下のストロークを使用して脳組織をホモジナイズしてください。均質化は、10 mL の乳鉢と乳棒組織グラインダーを使用して行われています。次のそれぞれの個別のサンプルの均質化 70% エタノールを使用して杵をクリーンアップします。</li>
	<li>超遠心機チューブをきれいにするサンプルを転送します。数し、それぞれの個々 のチューブの重量を量る。超遠心機のローターに読み込む前にチューブのペアし、のバランスします。 注: すべての重さと遠心チューブの組み合わせ実施しなければならないキャップと上管重量の正確な測定を確保します。</li>
	<li>4 ° C で 1 時間 150,000 × gで遠心分離機サンプル</li>
	<li>上清を吸引真空フラスコとガラス パスツール ピペットを使用して中空糸膜ペレットを妨害しないように気を使っています。</li>
	<li>ペレットのサイズに基づいては脱イオン水と BMB の 1:1 (v/v) 比で構成されるストレージ バッファーの適切なボリュームを追加します。通常、ペレットはストレージ バッファーの 400-500 μ L で再停止されます。プロテアーゼ阻害剤カクテルをストレージ バッファーの 1.0 mL あたり 1.0 μ L の割合でストレージ バッファーに追加します。</li>
	<li>渦サンプル ストレージ バッファーでペレットを再懸濁します。</li>
	<li>ガラス パスツール ピペットを使用すると、ラベル付きの 1.5 mL 遠心チューブに中空糸膜サンプルを転送します。</li>
	<li>針を通して渡すサンプルは、サンプルが完全に混合し、細胞凝集体が存在しないことを確保するため 5 x を注射器します。</li>
	<li>-80 ° c まで解析に必要なサンプルを格納します。 注: 各微小血管膜サンプルのタンパク質含量は、ブラッドフォード法を使って測定します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rolfe, D. F., Brown, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+energy+utilization+and+molecular+origin+of+standard+metabolic+rate+in+mammals.">Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals.</a> Physiol Rev. 77 (3), 731-758 (1997).</li><li>Brzica, H., Abdullahi, W., Ibbotson, K., Ronaldson, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Transporters+in+Central+Nervous+System+Drug+Delivery+and+Blood-Brain+Barrier+Protection:+Relevance+to+Treatment+of+Stroke.">Role of Transporters in Central Nervous System Drug Delivery and Blood-Brain Barrier Protection: Relevance to Treatment of Stroke.</a> J Cent Nerv Syst Dis. 9, 1179573517693802 (2017).</li><li>Ronaldson, P. T., Davis, T. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+inflammatory+hyperalgesia+modulates+morphine+delivery+to+the+brain:+a+role+for+P-glycoprotein.">Peripheral inflammatory hyperalgesia modulates morphine delivery to the brain: a role for P-glycoprotein.</a> J Neurochem. 102 (5), 1677-1690 (2007).</li><li>Ronaldson, P. T., Finch, J. D., Demarco, K. M., Quigley, C. E., Davis, T. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia/reoxygenation+stress+signals+an+increase+in+organic+anion+transporting+polypeptide+1a4+(Oatp1a4)+at+the+blood-brain+barrier:+relevance+to+CNS+drug+delivery.">Hypoxia/reoxygenation stress signals an increase in organic anion transporting polypeptide 1a4 (Oatp1a4) at the blood-brain barrier: relevance to CNS drug delivery.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 34 (4), 699-707 (2014).</li><li>Tome, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P-glycoprotein+traffics+from+the+nucleus+to+the+plasma+membrane+in+rat+brain+endothelium+during+inflammatory+pain.">P-glycoprotein traffics from the nucleus to the plasma membrane in rat brain endothelium during inflammatory pain.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 36 (11), 1913-1928 (2016).</li><li>Slosky, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetaminophen+modulates+P-glycoprotein+functional+expression+at+the+blood-brain+barrier+by+a+constitutive+androstane+receptor-dependent+mechanism.">Acetaminophen modulates P-glycoprotein functional expression at the blood-brain barrier by a constitutive androstane receptor-dependent mechanism.</a> Mol Pharmacol. 84 (5), 774-786 (2013).</li><li>Artus, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Wnt/planar+cell+polarity+signaling+pathway+contributes+to+the+integrity+of+tight+junctions+in+brain+endothelial+cells.">The Wnt/planar cell polarity signaling pathway contributes to the integrity of tight junctions in brain endothelial cells.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 34 (3), 433-440 (2014).</li><li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+exposure+to+ethanol+downregulates+tight+junction+proteins+through+the+protein+kinase+Calpha+signaling+pathway+in+human+cerebral+microvascular+endothelial+cells.">Long-term exposure to ethanol downregulates tight junction proteins through the protein kinase Calpha signaling pathway in human cerebral microvascular endothelial cells.</a> Exp Ther Med. 14 (5), 4789-4796 (2017).</li><li>Abdullahi, W., Brzica, H., Ibbotson, K., Davis, T. P., Ronaldson, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+morphogenetic+protein-9+increases+the+functional+expression+of+organic+anion+transporting+polypeptide+1a4+at+the+blood-brain+barrier+via+the+activin+receptor-like+kinase-1+receptor.">Bone morphogenetic protein-9 increases the functional expression of organic anion transporting polypeptide 1a4 at the blood-brain barrier via the activin receptor-like kinase-1 receptor.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 37 (7), 2340-2345 (2017).</li><li>Mesev, E. V., Miller, D. S., Cannon, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ceramide+1-Phosphate+Increases+P-Glycoprotein+Transport+Activity+at+the+Blood-Brain+Barrier+via+Prostaglandin+E2+Signaling.">Ceramide 1-Phosphate Increases P-Glycoprotein Transport Activity at the Blood-Brain Barrier via Prostaglandin E2 Signaling.</a> Mol Pharmacol. 91 (4), 373-382 (2017).</li><li>Betz, A. L., Csejtey, J., Goldstein, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hexose+transport+and+phosphorylation+by+capillaries+isolated+from+rat+brain.">Hexose transport and phosphorylation by capillaries isolated from rat brain.</a> Am J Physiol. 236 (1), C96-C102 (1979).</li><li>Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. M., Decleves, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+drug+transporters+at+the+blood-brain+barrier+using+an+optimized+isolated+rat+brain+microvessel+strategy.">Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy.</a> Brain Res. 1134 (1), 1-11 (2007).</li><li>McCaffrey, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+junctions+contain+oligomeric+protein+assembly+critical+for+maintaining+blood-brain+barrier+integrity+in+vivo.">Tight junctions contain oligomeric protein assembly critical for maintaining blood-brain barrier integrity in vivo.</a> J Neurochem. 103 (6), 2540-2555 (2007).</li><li>Brzica, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+liver+and+kidney+expression+of+sulfate+anion+transporter+sat-1+in+rats+exhibits+male-dominant+gender+differences.">The liver and kidney expression of sulfate anion transporter sat-1 in rats exhibits male-dominant gender differences.</a> Pflugers Arch. 457 (6), 1381-1392 (2009).</li><li>Ronaldson, P. T., Bendayan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+viral+envelope+glycoprotein+gp120+produces+oxidative+stress+and+regulates+the+functional+expression+of+multidrug+resistance+protein-1+(Mrp1)+in+glial+cells.">HIV-1 viral envelope glycoprotein gp120 produces oxidative stress and regulates the functional expression of multidrug resistance protein-1 (Mrp1) in glial cells.</a> J Neurochem. 106 (3), 1298-1313 (2008).</li><li>Pustylnikov, S., Sagar, D., Jain, P., Khan, Z. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+C-type+lectins-mediated+host-pathogen+interactions+with+dextran.">Targeting the C-type lectins-mediated host-pathogen interactions with dextran.</a> J Pharm Pharm Sci. 17 (3), 371-392 (2014).</li><li>Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development,+maintenance+and+disruption+of+the+blood-brain+barrier.">Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier.</a> Nat Med. 19 (12), 1584-1596 (2013).</li><li>Abdullahi, W., Davis, T. P., Ronaldson, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Expression+of+P-glycoprotein+and+Organic+Anion+Transporting+Polypeptides+at+the+Blood-Brain+Barrier:+Understanding+Transport+Mechanisms+for+Improved+CNS+Drug+Delivery?.">Functional Expression of P-glycoprotein and Organic Anion Transporting Polypeptides at the Blood-Brain Barrier: Understanding Transport Mechanisms for Improved CNS Drug Delivery?.</a> AAPS J. 19 (4), 931-939 (2017).</li></ol>

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この記事では新鮮なラット脳組織から分離された微小血管からの膜蛋白質のサンプルの準備のシンプルで効果的な方法を説明します。文献13,20,21,22で孤立した血管からラット脳微小血管の分離および/または膜の準備世代のためのいくつかの方法が報告されています。,24. ...

血液脳関門 (BBB) は、中枢神経系 (CNS) と全身循環間のインターフェイスに存在して、脳のホメオスタシスの維持に重要な役割を果たしています。具体的には、正確にコントロール溶質濃度1中枢神経系のかなり代謝要求を満たすために脳組織に必要なこれらの栄養素を効率よく供給して脳細胞外液中に BBB の機能。これらの役割は、微小血管内皮細胞のレベルに主に存在する、BBB は脳実質に潜在的に有害物質ができませんを確保しながらアクセスするいくつかの物質を有効に離散のメカニズムを持つ必要がありますを意味します。蓄積されます。確かに、脳微小血管内皮細胞は穴あきではなく、非選択的透過性2の欠如を保証する限られた pinocytosis を展示します。脳微小血管内皮細胞が物理的な隣接する血管内皮細胞間の「封印」と大きく脳に血液媒介物質の傍細胞拡散を制限するフォームに動作するタイトのジャンクションと adherens ジャンクション蛋白質を表現するさらに、実質。確かに、内因性および外因性物質の選択的な透磁率は、吸収と排出トランスポーター3の機能発現を必要とします。全体的に、タイトな接合、アドヘレンスジャンクション、トランスポーターは、BBB のユニークなバリア性を維持するためにコンサートで動作します。
BBB は生理学的、病態生理学的、および薬理学的刺激に応答する動的な障壁であります。たとえば、低酸素/再酸素化ストレスの増加傍細胞透過性このような血管マーカーに関連付けられている (すなわち、オクルディン、ギャップ occluden 1 (ZO-1))、重要なタイト結合タンパク質の発現を調節するのに示されています。ショ糖4,5,6。外傷性脳損傷7末梢炎症性疼痛8,9設定で bbb と同様の観測が行われました。これらの同じ病気の BBB10、11,12,13,14トランスポート メカニズムを調節することがまた。確かに、低酸素/再酸素化障害を高める有機アニオン輸送ポリペプチド 1a4 の機能発現 (Oatp1a4)、BBB でつながることができる特定ファミリートランスポーターの輸送基質の血液-脳輸送に大幅に増加するなどタウロコール酸とアトルバスタチンとの13。薬物療法自体は、脳の薬の効果の両方の深遠な変更および薬物-薬物相互作用の基礎を形成することができますメカニズムによって BBB プロパティを変更することも。たとえば、脳微小血管内皮細胞におけるアセトアミノフェン ターゲット核内受容体シグナル機構重要な排出トランスポーター P 糖タンパク質 (P ・ gp) の発現を増加し、時間依存性鎮痛を変更オピオイド鎮痛薬と確立された P gp は輸送基板15モルヒネによって与えられました。BBB の変更、病気や薬によって誘発されることができますの徹底的な理解は、これらの変更を制御する特定の規制メカニズムの同定と解析にも必要です。確かに、離散のシグナル伝達経路はタイト結合蛋白質16,17 , トランスポーター15,の分子の発現を制御する脳微小血管内皮細胞で確認されている18,19。一緒に取られて、これらの観察は、複雑な分子経路が健康および病気のトランスポーターの BBB のタイトな接合の規制に関与していることを示します。
BBB の研究で重要な課題は、微小血管に由来する実験動物及びその後膜サンプルの脳組織からの分離のためのシンプルで効果的なメソッドの絶対要件です。これらのサンプルは、脳微小血管内皮細胞の濃縮し、他の細胞型の存在の限定、両方準備されなければなりません。過去数年間、齧歯動物の脳から血管の隔離のための複数の方法論は、科学文献13,20,21,22で報告されています。ここでは、シンプルで堅牢な再現可能な方法ラット脳から微小血管の分離および蛋白質の表現の分析に使用することができます内皮膜濃縮試料の調製をについて説明します。この微小血管の隔離のプロトコルの利点は、個々 の実験動物から十分な蛋白質収量と高品質のサンプル準備を取得する機能です。これにより、間動物可変性蛋白質の表現の検討。このプロトコルのような進歩は、BBB で蛋白質の変更の本当の大きさの推定過剰 (または過少評価) を回避できますので BBB 研究の堅牢性を大幅に改善が。また、デキストランの遠心分離手順で複数の包含は、ニューロンなど不要な細胞成分の除去を促進しながら実験サンプルの微小血管についての改良濃縮できます。

<table><tbody><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#P8340</td><td>Component of brain microvessel buffer</td></tr><tr><td>D-mannitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#M4125</td><td>Component of brain microvessel buffer</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#E3889</td><td>Component of brain microvessel buffer</td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#T1503</td><td>Component of brain microvessel buffer</td></tr><tr><td>Dextran (MW 75,000)</td><td>Spectrum Chemical Mftg Corp</td><td>#DE125</td><td>Dextran used in centrifugation steps to separate microvessels from brain parenchyma</td></tr><tr><td>Zetamine</td><td>MWI Animal Health</td><td>#501072</td><td>General anesthetic</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Western Medical Supply</td><td>#5530</td><td>General anesthetic</td></tr><tr><td>0.9% saline solution</td><td>Western Medical Supply</td><td>N/A</td><td>General anesthetic diluent</td></tr><tr><td>Filter Paper (12.5 cm diameter)</td><td>VWR</td><td>#28320-100</td><td>Used for removal of meninges from brain tissue</td></tr><tr><td>Centrifuge Tubes</td><td>Sarstedt</td><td>#60.540.386</td><td>Disposable tubes used for dextran centrifugation steps</td></tr><tr><td>Pierce&amp;trade; Coomassie Plus (Bradford) Assay</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#23236</td><td>Measurement of protein concentration in membrane preparations</td></tr><tr><td>Wheaton Overhead Power Homogenizer</td><td>DWK Life Sciences</td><td>#903475</td><td>Required for homogenization of samples</td></tr><tr><td>10.0ml glass mortar and pestle tissue grinder</td><td>DWK Life Sciences</td><td>#358039</td><td>Required for homogenization of samples</td></tr><tr><td>Hydrochloric Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#H1758</td><td>Required for pH adjustment of buffers</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#23210</td><td>Protein standard for Bradford Assay</td></tr><tr><td>Standard Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>#91100-12</td><td>Used for dissection of brain tissue</td></tr><tr><td>Friedman-Pearson Rongeurs</td><td>Fine Science Tools</td><td>#16020-14</td><td>Used for opening skull to isolate brain</td></tr><tr><td>50 ml conical centrifuge tubes</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#352070</td><td>Used for collection of brain tissue following isolation</td></tr><tr><td>Glass Pasteur Pipets</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#13-678-20C</td><td>Used for aspiration of cellular debris following dextran spins</td></tr><tr><td>Ethanol, anhydrous</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#459836</td><td>Used for cleaning tissue grinder; diluted to 70% with distilled water</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge tubes</td><td>Beckman-Coulter</td><td>#41121703</td><td>Used for ultracentrifugation of samples</td></tr></tbody></table>

a simple and reproducible method to prepare membrane samples from freshly isolated rat brain microvessels

血液脳関門 (BBB) は、様々 な病態生理学的および薬理学的刺激に応答する動的なバリア組織です。これらの刺激の結果としてそのような変更大幅脳への薬物送達を調節でき、延長によって、病気の原因のかなりの挑戦中枢神経系の治療に (CNS)。薬物治療学に影響を与える多くの BBB 変更は、ローカライズは、内皮細胞のレベルで表現するタンパク質を含みます。確かに、健康および病気の BBB の生理学的な知識は、これらの膜タンパク質の研究に大きな関心を呼んでいます。基本的な科学研究の観点から、これは単純なが堅牢で再現性のある実験動物から採取した脳組織から血管の分離法のための要件を意味します。新鮮単離血管から膜サンプルを準備するためにサンプル準備が血管内皮細胞に富むが、単位 (すなわち、アストロ サイト、ミクログリア、ニューロンの他の細胞型の存在下で限定が肝要です。ペリサイト)。付加的な利点は、個々 の動物から実験群におけるタンパク質発現の真の変動を捕捉するためにサンプルを準備する機能です。本稿では、ラット脳微小血管の分離と膜試料の調製に利用されるメソッドに関する詳細情報が提供されます。派生した、サンプルの微小血管濃縮サンプル バッファーのデキストランをふくむ 4 遠心分離手順を使用して実現されます。このプロトコルは、特定のアプリケーションの他の所で簡単に対応できます。生理学的、病態生理学的、および薬理学的刺激への BBB 対応の理解を助けることができる大きくタンパク質解析実験から堅牢な実験データを生成するため、このプロトコルから生成されるサンプルを示されています。

ラット脳微小血管の分離と微小血管膜試料の準備のための実験の流れは図 1に示します。ここに示す手順を使用して、ラットの脳からそのまま微小血管の正常な分離を示す (図 2 a)。これらの血管は、デキストランと膜サンプル (すなわち、完了ステップ 4.10) を準備する遠心を開始する前にすぐに遠心分離が完了できた。こ?...

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A Simple and Reproducible Method to Prepare Membrane Samples from Freshly Isolated Rat Brain Microvessels

ここでは、ラット脳微小血管の分離膜試料の調製の方法を説明します。このプロトコルには、個々 の動物から得られる許容可能なタンパク質試料濃縮微小血管を生産の明確な利点があります。サンプルは、脳微小血管内皮細胞で堅牢なタンパク質解析に使用できます。

新鮮単離ラット脳微小循環から膜のサンプルを準備するシンプルで再現性のある方法

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic barrier tissue that responds to various pathophysiological and pharmacological stimuli. Such changes resulting ...

a-simple-reproducible-method-to-prepare-membrane-samples-from-freshly

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.1K ビュー.  University of Arizona, Tucson. ここでは、ラット脳微小血管の分離膜試料の調製の方法を説明します。このプロトコルには、個々 の動物から得られる許容可能なタンパク質試料濃縮微小血管を生産の明確な利点があります。サンプルは、脳微小血管内皮細胞で堅牢なタンパク質解析に使用できます。

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Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and characterize a highly reproducible rat syngeneic in vitro model of the BBB using co-cultures of primary rat brain endothelial cells (RBEC) and astrocytes to study receptors involved in transcytosis across the endothelial cell monolayer. Astrocytes were isolated by mechanical dissection following trypsin digestion and were frozen for later co-culture. RBEC were isolated from 5-week-old rat cortices. The brains were cleaned of meninges and white matter, and mechanically dissociated following enzymatic digestion. Thereafter, the tissue homogenate was centrifuged in bovine serum albumin to separate vessel fragments from nervous tissue. The vessel fragments underwent a second enzymatic digestion to free endothelial cells from their extracellular matrix. The remaining contaminating cells such as pericytes were further eliminated by plating the microvessel fragments in puromycin-containing medium. They were then passaged onto filters for co-culture with astrocytes grown on the bottom of the wells. RBEC expressed high levels of tight junction (TJ) proteins such as occludin, claudin-5 and ZO-1 with a typical localization at the cell borders. The transendothelial electrical resistance (TEER) of brain endothelial monolayers, indicating the tightness of TJs reached 300 ohm&#183;cm2 on average. The endothelial permeability coefficients (Pe) for lucifer yellow (LY) was highly reproducible with an average of 0.26 &#177;&#160;0.11 x 10-3 cm/min. Brain endothelial cells organized in monolayers expressed the efflux transporter P-glycoprotein (P-gp), showed a polarized transport of rhodamine 123, a ligand for P-gp, and showed specific transport of transferrin-Cy3 and DiILDL across the endothelial cell monolayer. In conclusion, we provide a protocol for setting up an in vitro BBB model that is highly reproducible due to the quality assurance methods, and that is suitable for research on BBB transporters and receptors.

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The aim of the present study was to validate the reproducibility of an in vitro BBB model involving a rat syngeneic co-culture of endothelial cells and astrocytes. The endothelial cell monolayer presented high TEER and low LY permeability. Expression of specific TJ proteins, functional responses to inflammation and functionality of transporters and receptors were assessed.

設定アップ<em&gt;体外</emラット血液脳関門の&gt;モデル（BBB）：BBB不透過性および受容体媒介輸送に注力

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

医学

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant cell type in the brain, neurons are the most widely studied of these cell types given their direct role in impacting behaviors. Other cell types in the brain also impact neuronal function and behavior via the signaling molecules they produce. Neuroscientists must understand the interactions between the cell types in the brain to better understand how these interactions impact neural function and disease. To date, the most common method of analyzing protein or gene expression utilizes the homogenization of whole tissue samples, usually with blood, and without regard for cell type. This approach is an informative approach for examining general changes in gene or protein expression that may influence neural function and behavior; however, this method of analysis does not lend itself to a greater understanding of cell-type-specific gene expression and the effect of cell-to-cell communication on neural function. Analysis of behavioral epigenetics has been an area of growing focus which examines how modifications of the deoxyribonucleic acid (DNA) structure impact long-term gene expression and behavior; however, this information may only be relevant if analyzed in a cell-type-specific manner given the differential lineage and thus epigenetic markers that may be present on certain genes of individual neural cell types. The Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) technique described below provides a simple and effective way to isolate individual neural cells for the subsequent analysis of gene expression, protein expression, or epigenetic modifications of DNA. This technique can also be modified to isolate more specific neural cell types in the brain for subsequent cell-type-specific analysis.

The goal of this protocol is to use the fluorescence activated cell sorting (FACS) technique to sort specific types of neural cells for subsequent analysis of cell-type-specific gene expression, epigenetic markers, and or protein expression.

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

神経科学

Purification of Mouse Brain Vessels

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and immune cells between the brain and the blood. Moreover, the huge neuronal metabolic demand requires a moment-to-moment regulation of blood flow. Notably, abnormalities of these regulations are etiological hallmarks of most brain pathologies; including glioblastoma, stroke, edema, epilepsy, degenerative diseases (ex: Parkinson&#8217;s disease, Alzheimer&#8217;s disease), brain tumors, as well as inflammatory conditions such as multiple sclerosis, meningitis and sepsis-induced brain dysfunctions. Thus, understanding the signaling events modulating the cerebrovascular physiology is a major challenge. Much insight into the cellular and molecular properties of the various cell types that compose the cerebrovascular system can be gained from primary culture or cell sorting from freshly dissociated brain tissue. However, properties such as cell polarity, morphology and intercellular relationships are not maintained in such preparations. The protocol that we describe here is designed to purify brain vessel fragments, whilst maintaining structural integrity. We show that isolated vessels consist of endothelial cells sealed by tight junctions that are surrounded by a continuous basal lamina. Pericytes, smooth muscle cells as well as the perivascular astrocyte endfeet membranes remain attached to the endothelial layer. Finally, we describe how to perform immunostaining experiments on purified brain vessels.

We describe a protocol allowing the purification of the mouse brain's vascular compartment. Isolated brain vessels include endothelial cells linked by tight junctions and surrounded by a continuous basal lamina, pericytes, vascular smooth muscle cells, as well as perivascular astroglial membranes.

マウス脳血管の精製

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

Preparation of Newborn Rat Brain Tissue for Ultrastructural Morphometric Analysis of Synaptic Vesicle Distribution at Nerve Terminals

Our laboratory and many others have exploited the high resolving power of transmission electron microscopy to study the morphology and spatial organization of synaptic vesicles. In order to obtain high-quality electron micrographs that can yield the degree of morphological detail necessary for quantitative analysis of pre-synaptic vesicle distribution, optimal specimen preparation is critical. Chemical fixation is the first step in the process of specimen preparation, and of utmost importance to preserve fine ultrastructure. Vascular fixation with a glutaraldehyde-formaldehyde solution, followed by treatment of vibratome-sectioned specimens with osmium tetroxide, stabilizes the maximum number of molecules, especially proteins and lipids, and results in superior conservation of ultrastructure. Tissue is then processed with counterstaining, sequential dehydration and resin-embedding. En bloc staining with uranyl acetate (i.e., staining of vibratome-sectioned tissue before resin embedding) enhances endogenous contrast and stabilizes cell components against extraction during specimen processing. Contrast can be further increased by applying uranyl acetate as a post-stain on ultrathin sections. Double-staining of ultrathin sections with lead citrate after uranyl acetate treatment also improves image resolution, by intensifying electron-opacity of nucleic acid-containing structures through selective binding of lead to uranyl acetate. Transmission electron microscopy is a powerful tool for characterization of the morphological details of synaptic vesicles and quantification of their size and spatial organization in the terminal bouton. However, because it uses fixed tissue, transmission electron microscopy can only provide indirect information regarding living or evolving processes. Therefore, other techniques should be considered when the main objective is to study dynamic or functional aspects of synaptic vesicle trafficking and exocytosis.

We describe procedures for processing newborn rat brain tissue to obtain high-resolution electron micrographs for morphometric analysis of synaptic vesicle distribution at nerve terminals. The micrographs obtained with these methods can also be used to study the morphology of a number of other cellular components and their dimensional structural relationships.

Ultrastructural のための新生ラット脳組織の調製 Morphometric 神経末端におけるシナプス小胞分布の解析

Our laboratory and many others have exploited the high resolving power of transmission electron microscopy to study the morphology and spatial ...

Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the lumen of blood vessels and command changes in vascular diameter as needed to meet the metabolic demand of neurons. Primary endothelial-dependent signaling pathways of hyperpolarization of membrane potential (Vm) and nitric oxide typically operate in parallel to mediate vasodilation and thereby increase blood flow. Although integral to coordinating vasodilation over several millimeters of vascular length, components of endothelium-derived hyperpolarization (EDH) have been historically difficult to measure. These components of EDH entail intracellular Ca2+ [Ca2+]i increases and subsequent activation of small- and intermediate conductance Ca2+-activated K+ (SKCa/IKCa) channels.
Here, we present a simplified illustration of the isolation of fresh endothelium from mouse cerebral arteries; simultaneous measurements of endothelial [Ca2+]i and Vm using Fura-2 photometry and intracellular sharp electrodes, respectively; and a continuous superfusion of salt solutions and pharmacological agents under physiological conditions (pH 7.4, 37 &#176;C). Posterior cerebral arteries from the Circle of Willis are removed free of the posterior communicating and the basilar arteries. Enzymatic digestion of cleaned posterior cerebral arterial segments and subsequent trituration facilitates removal of adventitia, perivascular nerves, and smooth muscle cells. Resulting posterior cerebral arterial endothelial &#34;tubes&#34; are then secured under a microscope and examined using a camera, photomultiplier tube, and one to two electrometers while under continuous superfusion. Collectively, this method can simultaneously measure changes in endothelial [Ca2+]i and Vm in discrete cellular locations, in addition to the spreading of EDH through gap junctions up to millimeter distances along the intact endothelium. This method is expected to yield a high-throughput analysis of the cerebral endothelial functions underlying mechanisms of blood flow regulation in the normal and diseased brain.

Demonstrated here are protocols for (1) freshly isolating intact cerebral endothelial "tubes" and (2) simultaneous measurements of endothelial calcium and membrane potential during endothelium-derived hyperpolarization. Further, these methods allow for pharmacological tuning of endothelial cell calcium and electrical signaling as individual or interactive experimental variables.

細胞内カルシウムと新鮮な分離とそのままマウス脳血管内皮細胞の膜電位の同時計測

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the ...

生物学

A High Output Method to Isolate Cerebral Pericytes from Mouse

In recent years, cerebral pericytes have become the focus of extensive research in vascular biology and pathology. The importance of pericytes in blood brain barrier formation and physiology is now demonstrated but its molecular basis remains largely unknown. As the pathophysiological role of cerebral pericytes in neurological disorders is intriguing and of great importance, the in vitro models are not only sufficiently appropriate but also able to incorporate different techniques for these studies. Several methods have been proposed as in vitro models for the extraction of cerebral pericytes, although an antibiotic-free protocol with high output is desirable. Most importantly, a method that has increased output per extraction reduces the usage of more animals.
Here, we propose a simple and efficient method for extracting cerebral pericytes with sufficiently high output. The mouse brain tissue homogenate is mixed with a BSA-dextran solution for the separation of the tissue debris and microvascular pellet. We propose a three-step separation followed by filtration to obtain a microvessel rich filtrate. With this method, the quantity of microvascular fragments obtained from 10 mice is sufficient to seed 9 wells (9.6 cm2 each) of a 6-well plate. Most interestingly with this protocol, the user can obtain 27 pericyte rich wells (9.6 cm2 each) in passage 2. The purity of the pericyte cultures are confirmed with the expression of classical pericyte markers: NG2, PDGFR-&#946; and CD146. This method demonstrates an efficient and feasible in vitro tool for physiological and pathophysiological studies on pericytes.

We present a protocol for the extraction of murine cerebral pericytes. Based on an antibiotic-free enrichment oriented pericyte extraction, this protocol is a valuable tool for in vitro studies providing high purity and high yield, thus decreasing the number of experimental animals used.

マウスから脳ペリサイトを分離する高出力法

In recent years, cerebral pericytes have become the focus of extensive research in vascular biology and pathology. The importance of pericytes in blood ...

Endothelial Cell Culture from Rat Brain Microvessels: A Procedure to Isolate and Culture Endothelial Cells from Microvessels of Rat Brain

Source: Molino, Y. et al. <a href="https://www.jove.com/v/51278/setting-up-an-vitro-model-rat-blood-brain-barrier-bbb-focus-on-bbb">Setting-up an&#160;In Vitro&#160;Model of Rat Blood-Brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport.</a> J. Vis. Exp.&#160;(2014)
This video presents the isolation of microvessels from a rat brain using a combination of density gradient centrifugation and enzymatic digestion mehods. The isolated microvessels can be cultured in a culture flask pre-coated with collagen and fibronectin matrix to obtain endothelial cell colonies.

ラット脳微小血管からの内皮細胞培養:ラット脳の微小血管から内皮細胞を単離および培養する手順

Source: Molino, Y. et al. Setting-up an&#160;In Vitro&#160;Model of Rat Blood-Brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

がん研究

神経系のがん

試験管研究

Isolation and Culture of Microglia from Rat Brains using Serum-Free Media

Source: Collins, H. Y., et al., <a href="https://app.jove.com/v/57122">Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium.</a> J. Vis. Exp. (2018)
This video demonstrates a method for isolating and culturing microglia from rat brains. It entails separating microglia from other neuronal and non-neuronal cells using plates coated with a monoclonal antibody specific to microglia.

無血清培地を用いたラット脳からのミクログリアの単離と培養

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Prepare a Petri Dish for CD11b ...

神経細胞培養技術

一次神経細胞培養

Isolating Mouse Brain Vessels: A Protocol to Isolate Intact Vessels from Murine Brain Sample

Source: Boulay, A. C. et al. <a href="https://www.jove.com/video/53208" target="_blank">Purification of Mouse Brain Vessels.</a> J. Vis. Exp. (2015)
This video demonstrates the isolation of intact vessels from a mouse&#39;s brain that constitute the blood-brain barrier (BBB) along with neurons and glial cells. The isolated vessels can be used as an in vitro model to study their role in maintaining brain homeostasis.

マウス脳血管の単離:マウス脳サンプルから無傷の血管を単離するためのプロトコル

Source: Boulay, A. C. et al. Purification of Mouse Brain Vessels. J. Vis. Exp. (2015)
This video demonstrates the isolation of intact vessels from a ...

体内研究

Obtaining a Single-Cell Suspension from Frozen Rat Brain Tissue

Source: Rubio, F. J., et. al. <a href="https://app.jove.com/v/54358">Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue.</a> J. Vis. Exp. (2016)
This video demonstrates the dissociation of frozen rat brain tissue into a single-cell suspension using enzymatic digestion and mechanical trituration. The prepared cells are fixed and permeabilized with ethanol for downstream applications like flow cytometry or gene expression analysis.

Source: Rubio, F. J., et. al. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat ...