そこで、私たちの原稿の方法の目的は、ヒトとマウスのシステムを用いて骨髄細胞のシグナル経路の比較分析を提供することです。これは、選択されたパターン認識受容体の下流に関与するシグナル経路を定義するのに役立ちます。したがって、このメソッドは実装が簡単です。
これは、シグナル伝達機構の解明に不可欠な一次細胞製剤および検証された基準化合物に依存しています。この手順を実証するのは、ラティバ・トゥイールとアデリーン・ウンテライナー、それぞれ私たちのグループの科学者と研究員です。ラミナーフローフードでは、無菌のハサミ、1リットルのビーカー、ビニール袋をセットしました。
以前に入手したバフィーコートをビーカーに入れ、はさみを使用して慎重に開きます。25 mm ピペットを使用して、EDTA の 2 ミリモルを添加した PBS の 100 ml を追加します。ゆっくりと上下にピペットで混ぜます。
そして、希釈したバフィーコートの25mlを、それぞれ15mlの多糖ベースの密度勾配で予め充填された6つの50ml円錐遠心管に移す。チューブを800gで20分間遠心分離し、その密度に基づいて細胞を分離できるように、休憩なしで適度な加速を行います。遠心分離後、赤血球と顆粒球を含むペレット、血漿で作られた上層、および末梢血単核細胞を含む白い環が見える。
PBMCリングを収穫し、新しい50 mlの管にそれらを移すために10 mlのピペットを使用してください。PBSとEDTAでトップアップ。テキスト プロトコルで説明されているように、遠心時間と速度を減少させる 3 つの連続したのスケーションを実行します。
最後の洗浄後、25mlの氷冷ライシスバッファーでペレットを再懸濁し、浸透圧で赤血球を分解します。溶液が明らかになるまで室温でインキュベートする。その後、25mlの分離バッファーを加え、反応を停止します。
遠心分離機を150gで8分間洗浄し、溶液を洗浄する。上清を注ぎ、分離バッファーでペレットを再懸濁します。細胞を数えた後、1ウェルあたり12,500細胞まで培養培地で希釈する。
384ウェルプレートの各ウェルにこの細胞懸濁液の30 mlを配布します。次に、各ウェルに4倍の濃縮化合物溶液の15マイクロリットルを加え、1時間5%の二酸化炭素で摂氏37度でプレートを前キューバベートします。必要に応じて、 LPS を 1 ml あたり 1 ng の最終濃度に追加するか、または 1ml あたり 100 mcg の最終濃度に Zymosan を枯渇させた。
その後、5%の二酸化炭素で摂氏37度で一晩プレートをインキュベートします。翌日は、分泌されたTNFアルファレベルを測定するために上清の10マイクロリットルを取る。シリアル希釈を開始するには、MLT-827ストック溶液を培地で希釈し、一度に8マイクロモルの濃度に達します。
0.08%DMSOの培地を使用して、6ステップ1:5シリアル希釈を行います。単回投与試験の準備のために、MLT-827、AFN700、および化合物11ストック溶液を培地で希釈し、一度に4マイクロモル濃度に達する。まず、枯渇したZymosanの10mgに無菌内毒素フリー水2mlを加えます。
このストック溶液を均質化するボルテックス。溶液をアリコートし、その後、摂氏20度でアリコートを保存します。本研究では、ヒトPBMCsおよびマウス脾臓細胞は、枯渇したZymosan、デクチン-1アゴニスト、またはリポ多糖(TL4アゴニスト)のいずれかで刺激される。
上清中のNTNFα放出は、20時間後に測定される。ヒトとマウスの両方のアッセイにおいて、MLT-827化合物は、Dectin-1経路によって駆動されるTNFアルファ産生を選択的にブロックするが、TLR4経路によってはブロックしない。LPSで刺激された単球では、TNFアルファの産生はほぼ完全にAFN700によって除化されるが、それはTLR4経路のNF-κB活性への依存性およびSIC活性への依存性と一致するCpd11に敏感ではない。
対照的に、Dectin-1およびMODが駆動するTNFアルファ産生は、MLT-827、AFN700、およびCpd11に対する感受性を示す。これは、Dectin-1経路におけるSIC CBMシグナル伝達カスケードの関与に関するさらなる証拠を提供する。IL-1 β、IL-6、およびIL-23の産生は、3つの阻害剤にも敏感であり、TNFアルファに類似した調節機構を示す。
しかし、IL-8の産生に見られる限られた効果は、このサイトカインが明確な調節メカニズムを有することを示唆している。トレハロース-ジベヘン酸濃度を1ml当たり50mcg以上に上げると、MLT-827のブロッキング効果に応じてMALT1パラカスパーゼ活性に依存していたTNFアルファ、IL-6、IL-1ベータの産生が可能です。同様の結果は、デクチン-1を刺激するために枯渇したZymosanの濃度を増加させるとモッズに挑戦したときに見られました。
この方法により、パラカスパーゼMALT1がC型レクチン様受容体シグナル伝達を選択的に調節することを示すことを可能にした。それは、よく特徴付け参照化合物を使用することが不可欠です。ストックソリューションの希釈手順に注意してください。
これは、限られた溶解性を有する化合物にとって重要である。
