著者らは、 安定的にラットスラック-Bタンパク質を発現する HEK293細胞の寛大な寄付のためのエール大学の博士フレッドSigworthの研究室で博士襄陽ヤンに感謝しています。さらに著者らは、ビデオ紹介に表示スラックの低 ​​温電子顕微鏡相同性モデル博士Sigworthに感謝しています。この研究は、LKKにNIHの助成DH067517とNS073943によってサポートされていました

1。細胞培養（フレミングとカツマレク18より） <ol><li>このアッセイにおける使用の前に2より大きく10未満の継代のための適切なメディアでの培養細胞。安定的にラットスラック-Bタンパク質を発現する非トランスフェクトHEK-293細胞およびHEK-293細胞を、リーボビッツL-15培地、10％熱不活化ウシ胎児血清および抗生物質を補充した半分のダルベッコ変法イーグル培地および半分で増殖させる。 500μg/ mlのジェネテシン（G418）を安定的にスラックチャネルの発現のために選択することスラック-Bを発現するHEK-293細胞に添加する。 0.25％トリプシン-EDTA溶液で皿から解離して70％〜90％のコンフルエンスで継代細胞。 </li></ol> 2。フィブロネクチンおよび卵白アルブミンを用いたTiO 2の 384ウェル光学バイオプレートの細胞外マトリックス（ECM）コーティング<ol><li>フィブロネクチンECM混合物およびオボブロッキング溶液の調製<ol><li> fibronectのワーキング溶液を調製します20.0 mlのPBS中のフィブロネクチンの5μg/ mlの終濃度でリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中。 1.0 mg / mlのストック濃度から、200倍希釈のために20.0ミリリットルのPBSに100μLを加える。フィブロネクチンの使用液を調製後、等分し-20℃で保存することができます。 </li><li>滅菌水中熱不活性化オボアルブミンの5％原液を準備します。 5％の溶液と無菌組織培養グレードの水にオボアルブミンを希釈し、60℃で30分間熱不活性化室温および滅菌フィルター溶液に溶液を冷却。 4℃で5％のオボアルブミン溶液及びストアを分取</li><li> PBSに5％の原液を希釈することにより、オボアルブミンの2％ワーキング溶液を調製する。例えば、30.0ミリリットルの最終容量のPBS 18.0ミリリットルに5％卵白アルブミン原液を12.0ミリリットルを追加。 </li></ol></li><li> 384ウェル光学バイオセンサープレートコーティング<ol><li> 20.0μL/ウェルとTiO 2のプレートを水和15分間の滅菌組織培養グレードの水。以下の手順では、16チャンネルピペッターを用いて行われるべきである。 </li><li>ウェルあたり50.0μlのPBSで洗浄プレート1X。 </li><li>各ウェルにフィブロネクチン作業溶液の20.0μLを加え、ECMを作成するために、室温で2時間インキュベートする。 </li><li>ウェルあたり50.0μlのPBSで洗浄プレート1X。 </li><li>各ウェルにオボアルブミン作業溶液の40.0μlを加え、プレートをブロックするために4℃で一晩インキュベートする。 </li><li>ウェルあたり50.0μlのPBSでプレート3回洗浄します。 ECMコーティングされたプレートは、最大48時間、4℃で保存することができる。 </li></ol></li></ol> 3。 384ウェル光学バイオプレートに細胞を播種<ol><li>細胞から増殖培地を除去して、プレートから細胞を取り除くために、トリプシンを追加します。細胞を収集し、1分間の千×gで遠心する。増殖培地中のトリプシンのメディア再懸濁細胞を除去。 </li><li>血球計数器または自動化を使用してセルカウンター、細胞の濃度を決定する。 </li><li>インキュベーション中の蒸発の影響を最小限に抑えるために、ウェル当たり増殖培地の50.0μlを用い説明する。細胞は、成長培地の50.0100μlの容量でウェル当たりの細胞の所望の数を達成するために希釈されるべきである。これらの実験のために、1,000細胞/ウェルを、バイオセンサー上にプレーティングした。 </li><li>播種した細胞は、空気/ 5％CO 2下、37℃で増殖培地中で一晩インキュベートすることを可能にする。 </li></ol> 4。 RWG光バイオアッセイのためのバイオセンサーと化合物プレートの調製<ol><li>インキュベーターからプレートを取り外して、細胞から増殖培地を除去します。細胞はハンクス平衡塩溶液（HBSS）で1×洗浄します。各ウェルにHBSSの25.0を添加する。 </li><li> BINDスキャナーでバイオセンサープレートを置き、細胞を1〜2時間室温に平衡化させる。 </li><li>関心のあるリガンドは広告元となる別々の化合物プレートを準備しますアッセイ中にバイオセンサープレートにDED。これらのアッセイについては、化合物を含有する溶液の25.0μlを50.0μlの総容積のためのバイオセンサープレートに各ウェルに添加した。このように、溶液中の化合物を、2×所望の最終濃度で調製した。 </li></ol> 5。 RWG光バイオアッセイを実施<ol><li>ウェルBINDスキャンソフトウェアを用いて各々の中心1.5ミリメートルのために3.75ミクロン/ピクセルの最大解像度を用いてウェルA1-P12（SBS 384ウェルプレートの半分）用のスキャナシステムを用いてベースライン測定値を取る。このベースラインスキャンは約30分かかります。 </li><li>井戸A1-P12のために各ウェルに化合物溶液の25.0を添加する。 </li><li>ウェルA13-p24のベースライン測定を行う。 </li><li>ウェルA13-P24のために各ウェルに化合物溶液の25.0を添加する。 </li><li>井戸A1-P12のためのポスト化合物添加の測定を行い、ウェルのA13-P24のために繰り返します。 </li></ol> 6。 ABINDビューを用いたアッセイデータのnalysis <ol><li> Windowsでのベースライン測定のためのBINDアッセイデータを開き、セル選択を可能にするために「グリッド·エディタ」ボタンをクリックしてください。ソフトウェアは、ユーザによって定義された関心のあるメトリックを計算する。 </li><li> 「セルファインダー」と「ベースライナー」機能が含まれ、「プラグイン」を開きます。 「セルファインダー」に設定されたパラメータの細胞は、バイオセンサーのバックグラウンドと区別されるようにします。 </li><li>ベースライン測定のための「セル·ファインダー」は、データを含むセルのマップファイルをエクスポートします。 </li><li>繰り返します、ポスト化合物添加·データの6.1から6.2を繰り返します。 </li><li> 「ベースライナー」プラグインを開いて、ベースライン測定からセルマップをインポートします。ソフトウェアは、背景とポスト複合データ間のPWVのシフトを計算します。 </li><li>細胞に対するPWVの平均シフトの出力は、「Δセル平均」を選択します。データはその後、Microsoft Excのにエクスポートすることができますさらなる分析のためのEL。 </li></ol>

<ol>
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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+mental+retardation+protein+controls+gating+of+the+sodium-activated+potassium+channel.">Fragile X mental retardation protein controls gating of the sodium-activated potassium channel.</a> 13, 819-821 (2010).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+neuronal+excitability+by+interaction+of+fragile+X+mental+retardation+protein+with+slack+potassium+channels.">Regulation of neuronal excitability by interaction of fragile X mental retardation protein with slack potassium channels.</a> J. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+diacylglycerol+degradation+to+M1+muscarinic+receptors+by+beta-arrestins.">Targeting of diacylglycerol degradation to M1 muscarinic receptors by beta-arrestins.</a> Science. 315, 663-666 (2007).</li><li>Zhang, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays.">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).</li><li>Gribbon, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+real-life+high-throughput+screening+data.">Evaluating real-life high-throughput screening data.</a> J. Biomol. Screen. 10, 99-107 (2005).</li></ol>

スティーブンM. Shamahは、X-BODY Biosciences社の従業員である。

Z素数（Z &#39;）因子は、ハイスループットスクリーニングアッセイ20の品質を定量化するための一般的な統計的方法であり、このアッセイにおけるGPCRアゴニストのスクリーニングは、SBS互換性のある384ウェルアッセイにおいて発生したため、優れを提供このアッセイ21の堅牢性と妥当性の尺度。 1のAZ &#39;の値は、存在しない標準偏差を持つデータポイントの数が無限で、理論...

その生理学的に適切なコンテキストで、生きた細胞を調べると、細胞標的の生物学的機能を理解することが重要です。しかしながら、このような免疫共沈降アッセイなどのチャネルおよび調節細胞質タンパク質との相互作用を調べるアッセイは、一般に生細胞における相互作用の時間経過にほとんど情報を提供する。現在のセルベースアッセイの大多数は、このような関心の蛍光タグ付けされたタンパク質の転座などの特定の細胞事象を測定する。これらのアッセイは、潜在的に、タンパク質の挙動を変化させ、標的の生理学的な関連性を減少させることができ、目的のタンパク質の修飾を必要とする。 、システムの操作を必要と細胞活性の連続的な測定を提供し、彼らの最も生理学的に関連する状態4にある細胞の研究を許可していない非侵襲的な細胞ベースのアッセイ、。 光学バイオセンサを製造するように設計されているセンサ表面に結合された光の特性の測定可能な変化。表面プラズモン共鳴（SPR）と共振波長格子（RWG）技術を含むエバネッセント波を利用する光学バイオセンサは、主にセンサー表面上に固定化されたそれらの生物学的受容体への結合分子の親和性および速度を検出するために使用されてきた。より最近では、市販のRWGバイオセンサは、高空間分解能（最大3.75ミクロン/ピクセル）5のセンサ表面への付着細胞の底部内の ​​質量の相対的変化の検出を可能にするために開発されてきた。これらのバイオセンサーは、細胞接着および拡散性、毒性、増殖、およびGタンパク質共役受容体（GPCR）を含む細胞表面受容体の種々によって誘発されるシグナル伝達経路などの刺激から生じる、生細胞の原形質膜の近傍の質量の変化を検出することができる6 。 RWGバイオセンサは、相対ちゃんを検出バイオセンサ7の150nmの内の質量の相対的変化の関数としての屈折率のシチズン。細胞は、バイオセンサーにメッキされている場合、屈折率のこの変化は、バイオセンサへの細胞付着の変化に起因する細胞の原形質膜の近くの質量の変化を反映する。このプロトコルは、RWGバイオセンサを使用してチャネル - タンパク質相互作用の検出について説明する。 RWGデータ収集システムは、複数のコンポーネントで構成されています。 X-BODY Biosciences社BINDスキャナがこれらの実験に使用されたため、我々は、プレートリーダー、関連するバイオセンサー、BINDスキャン取得ソフトウェア、およびBINDビュー解析ソフトウェア8から構成され、この特定のシステムのための構成要素を指すものとする。フォトニック結晶バイオセンサは、特定の光の伝播を防止する2又は3次元の誘電体材料の周期的な配置で構成され、光学バイオセンサと称する波長と方向。フォトニック結晶構造はウッドの異常と呼ばれる現象に基づいている。最初1902年にウッドによって発見され、これらの異常は、特定の回折次数の強度の急激な変化は、特定の狭い周波数帯域で発生する光の回折格子によって反射される光のスペクトルで観察された効果である。 1962年に、ヘッセルとOliner、有限期間格子は立って共振波長9を生成するWoodの異常の新しい理論を発表した。ここで説明する光学バイオセンサにおいては、木材の異常は、白色光で刺激された場合には、波長のごく狭い帯域（典型的には850から855 nm）を反映していることをRWGバイオセンサを製造するために使用される。 個々のバイオセンサーは、高屈折率誘電体材料の二酸化チタン（TiO 2）の薄層で被覆された周期的な表面構造を有する低屈折率プラスチック材料からなる。ときはbiosensまたは広い波長光源で照明されるフォトニック結晶の光学格子はBINDスキャナで分光光度計によって測定される光の波長の狭い範囲を反映する。反射波長（ピーク波長値またはPWV）のピーク強度は、信号から計算される。バイオセンサー表面の近接内の質量の増加または減少（〜150 nm）での結果としての屈折率の変化する光シフトのPWV。光学バイオセンサは、これらの実験で使用したアッセイのための標準的な生体分子科学学会（SBS）384ウェルマイクロプレートに組み込まれる。 RWVバイオセンサは、細胞10を生体内に外因性シグナルの添加により変化を検出するために使用される。 RWGバイオセンサと屈折の地元率変化の表面は特定の刺激で処理して監視されている上に細胞を直接培養する。バイオセンサにおける質量の変化の方向があり得る局所バイオセンサーの近くの質量の増加から生じる屈折の屈折率との増加はPWVの増加として測定されるので、決定した。逆に質量の減少は、PWVの減少を生成します。検出されたPWVの変化は、細胞接着の変化、タンパク質の補充/リリース、エンドサイトーシス、リサイクル、エキソサイトーシス、アポトーシス、および細胞骨格再配列を含む多数の細胞事象に起因することができます。例えば、アッセイは、カリウムチャネルおよび他の細胞質または細胞骨格成分の間のチャネル - タンパク質相互作用の変化を検出することができる。イベントは、しかしながら、原形質膜の近くに、バイオセンサーの近くに〜150nmの検出ゾーン内、および接続されたセルの場合に発生しなければならない。細胞応答の取得は、BINDスキャンソフトウェアを用いて実行され、SBSプレート384のウェルの各々の画像表現が生成される。このシステムは、単一細胞内のイベントの検出を可能にする、最大3.75ミクロン/ピクセルの解像度を有し、かつ（例えば、HEK293またはCHO細胞）細胞株、またはそれ以上の生理学的に関連する一次細胞のいずれかで使用することができる。 BIND Viewソフトウェアを有する画像分析は、個々の細胞の集団の両方における細胞応答の検出を可能にする。バイオセンサはマイクロプレート、384ウェル標準SBSに組み込まれるように、システムは、ハイスループットスクリーニング（HTS）に容易に適応可能である。 共振波長格子光学バイオセンサは、以前は11のGPCRの活性化後の細胞の原形質膜の近くの質量の変化を検出するために使用されてきた。当研究室では、2ナトリウム活性化（K Na）のカリウムチャネル、スラック-Bおよびスリック12をクローン化しています。スラック-Bとスリックチャネルの両方の活性が非常に強く、プロテインキナーゼC（PKC）13の直接的な活性化により影響されることが示されている。このような、M1ムスカリン受容体とのmGluR1代謝調節型グルタミン酸rとGαqはタンパク質共役型受容体の活性化eceptorは、強力PKC活性化を介してチャネル活性を調節する。これらのK のNaチャネルは、持続的な刺激の間に神経細胞の適応に貢献し、アクションのタイミングの精度が14を電位調節する。たるみチャンネルはFMRP、脆弱X精神遅滞タンパク質15,16を含む細胞質シグナル伝達分子、様々な相互作用することが知られている。乳児期（MMPSI）、重度の発達遅滞17になりてんかんの早期発症フォームの複数の移行部分発作のたるみ結果に突然変異。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="723">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">DMEM, High Glucose</td>
			<td style="width:172px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11965-092</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Leibovitz&#39;s L-15 Medium</td>
			<td style="width:172px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11415-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)</td>
			<td style="width:172px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Geneticin G-418 Sulfate</td>
			<td style="width:172px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB05057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">HBSS</td>
			<td style="width:172px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Fibronectin from human plasma</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F0895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Albumin from chicken egg white</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A5378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">DPBS</td>
			<td style="width:172px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:265px;">Hausser Bright-Line Phase Hemocytometer</td>
			<td style="width:172px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">02-671-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Carbamoylcholine chloride</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C4382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">SFLLR-NH2 trifluoroacetate salt</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S8701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Finnpipette (5-50 &#181;l)</td>
			<td style="width:172px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4662090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">BIND Scanner System</td>
			<td style="width:172px;">X-BODY Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">384-well TiO2 coated plates</td>
			<td style="width:172px;">X-BODY Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">TiO-96-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of label-free optical biosensors to detect modulation of potassium channels by g-protein coupled receptors

イオンチャネルを選択的にイオンが原形質膜1を流すことにより、ニューロンおよび他の興奮性の細胞型の電気的特性を制御する。神経細胞の興奮性を調節するために、イオンチャネルの生物物理学的特性は、多くの場合、ヘテロメリックチャネル複合体2,3を形成するために、チャネル自体に結合するシグナル伝達タンパク質および分子によって修飾されている。生きた細胞内の相互作用の時間経過にほとんどの情報を提供しながら、チャネルおよび調節タンパク質との相互作用を調べるの伝統的なアッセイは、潜在的に、タンパク質の動作を変更し、ターゲットの生理的関連性を減少させることができ、外因性のラベルが必要です。共振の変化を検出するために、光は、X-BODYバイオサイエンスBINDスキャナシステムなどのバイオセンサー、新規ラベルフリー技術を使用して、共振波長グレーティング（RWG）光学バイオセンサーは、バイオセンサー付近の光を反映していた。このアッセイは、相対的な検出を可能にするリガンド誘導性細胞接着の変化や広がり性、毒性、増殖、および原形質膜の近くのタンパク質 - タンパク質相互作用の変化に起因するバイオセンサー表面に付着した生細胞の底部内の質量変化。 RWGバイオセンサは、光学Gタンパク質共役受容体（GPCR）、受容体チロシンキナーゼ、及び他の細胞表面受容体の活性化後の細胞の原形質膜の近くの質量の変化を検出するために使用されてきた。イオンチャネル - タンパク質相互作用におけるリガンド誘導変化はまた、このアッセイを用いて研究することができる。本論文では、スラック-B型ナトリウム活性化カリウム（K Na）の GPCRによってチャネルの調節を検出するために使用される実験手順を説明します。

スラック-Bを安定してHEK-293細胞にトランスフェクトし、コントロール非トランスフェクトHEK-293細胞を、ウェル、384ウェル、ECMコーティングされたRWGバイオセンサプレートに1,000細胞/ウェルで播種した。バイオセンサーの中心1.5ミリメートル2からのイメージは、3.75ミクロン/ピクセルの解像度（ 図1）で記録した。塊の密度勾配マップは、予め生成され、BINDスキャンソフ?...

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Use of Label-free Optical Biosensors to Detect Modulation of Potassium Channels by G-protein Coupled Receptors

光バイオセンサー技術は、生細胞における形質膜の近傍の質量の変化を検出し、一方、個々の細胞および細胞集団の両方において細胞性応答に従うことを可能にすることができる。このプロトコルは、このアプローチを使用して、無傷の細胞におけるGタンパク質共役受容体によりカリウムチャネルの調節の検出について説明する。

Gタンパク質共役受容体によるカリウムチャネルの調節を検出するために、ラベルフリー光学バイオセンサの使用

Ion channels control the electrical properties of neurons and other excitable cell types by selectively allowing ions to flow through the plasma ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.2K ビュー.  Yale School of Medicine. 光バイオセンサー技術は、生細胞における形質膜の近傍の質量の変化を検出し、一方、個々の細胞および細胞集団の両方において細胞性応答に従うことを可能にすることができる。このプロトコルは、このアプローチを使用して、無傷の細胞におけるGタンパク質共役受容体によりカリウムチャネルの調節の検出について説明する。 

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Attaching Biological Probes to Silica Optical Biosensors Using Silane Coupling Agents

In order to interface with biological environments, biosensor platforms, such as the popular Biacore system (based on the Surface Plasmon Resonance (SPR) technique), make use of various surface modification techniques, that can, for example, prevent surface fouling, tune the hydrophobicity / hydrophilicity of the surface, adapt to a variety of electronic environments, and most frequently, induce specificity towards a target of interest.1-5 These techniques extend the functionality of otherwise highly sensitive biosensors to real-world applications in complex environments, such as blood, urine, and wastewater analysis.2,6-7 While commercial biosensing platforms, such as Biacore, have well-understood, standard techniques for performing such surface modifications, these techniques have not been translated in a standardized fashion to other label-free biosensing platforms, such as Whispering Gallery Mode (WGM) optical resonators.8-9
WGM optical resonators represent a promising technology for performing label-free detection of a wide variety of species at ultra-low concentrations.6,10-12 The high sensitivity of these platforms is a result of their unique geometric optics: WGM optical resonators confine circulating light at specific, integral resonance frequencies.13 Like the SPR platforms, the optical field is not totally confined to the sensor device, but evanesces; this "evanescent tail" can then interact with species in the surrounding environment. This interaction causes the effective refractive index of the optical field to change, resulting in a slight, but detectable, shift in the resonance frequency of the device. Because the optical field circulates, it can interact many times with the environment, resulting in an inherent amplification of the signal, and very high sensitivities to minor changes in the environment.2,14-15
To perform targeted detection in complex environments, these platforms must be paired with a probe molecule (usually one half of a binding pair, e.g. antibodies / antigens) through surface modification.2 Although WGM optical resonators can be fabricated in several geometries from a variety of material systems, the silica microsphere is the most common. These microspheres are generally fabricated on the end of an optical fiber, which provides a "stem" by which the microspheres can be handled during functionalization and detection experiments. Silica surface chemistries may be applied to attach probe molecules to their surfaces; however, traditional techniques generated for planar substrates are often not adequate for these three-dimensional structures, as any changes to the surface of the microspheres (dust, contamination, surface defects, and uneven coatings) can have severe, negative consequences on their detection capabilities. Here, we demonstrate a facile approach for the surface functionalization of silica microsphere WGM optical resonators using silane coupling agents to bridge the inorganic surface and the biological environment, by attaching biotin to the silica surface.8,16 Although we use silica microsphere WGM resonators as the sensor system in this report, the protocols are general and can be used to functionalize the surface of any silica device with biotin.

Biosensors interface with complex, biological environments and perform targeted detection by combining highly sensitive sensors with highly specific probes attached to the sensor via surface modification. Here, we demonstrate the surface functionalization of silica optical sensors with biotin using silane coupling agents to bridge the sensor and the biological environment.

シランカップリング剤を用いた石英系光バイオセンサーへの生物学的プローブの取り付け

In order to interface with biological environments, biosensor platforms, such as the popular Biacore system (based on the Surface Plasmon Resonance (SPR) ...

生物工学

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, currently available routine methods require processing steps and alter sample integrity. Raman spectroscopy is a fast method that enables the measurement of biological samples without the need for further processing steps. This laser-based technology detects the inelastic scattering of monochromatic light.6 As every chemical vibration is assigned to a specific Raman band (wavenumber in cm-1), each biological sample features a typical spectral pattern due to their inherent biochemical composition.7-9 Within Raman spectra, the peak intensities correlate with the amount of the present molecular bonds.1 Similarities and differences of the spectral data sets can be detected by employing a multivariate analysis (e.g. principal component analysis (PCA)).10
Here, we perform Raman spectroscopy of living cells and native tissues. Cells are either seeded on glass bottom dishes or kept in suspension under normal cell culture conditions (37 &deg;C, 5% CO2) before measurement. Native tissues are dissected and stored in phosphate buffered saline (PBS) at 4 &deg;C prior measurements. Depending on our experimental set up, we then either focused on the cell nucleus or extracellular matrix (ECM) proteins such as elastin and collagen. For all studies, a minimum of 30 cells or 30 random points of interest within the ECM are measured. Data processing steps included background subtraction and normalization.

Raman spectroscopy is a suitable technique for the non-contact, label-free analysis of living cells, tissue-engineered constructs and native tissues. Source-specific spectral fingerprints can be generated and analyzed using multivariate analysis.

ラマン分光法を用いた細胞と細胞外マトリックスの非接触、ラベルフリーの監視

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a model microorganism. The biosensor relies on direct binding of the target bacteria cells onto its surface, while no pretreatment (e.g.&#160;by cell lysis) of the studied sample is required. A mesoporous Si thin film is used as the optical transducer element of the biosensor. Under white light illumination, the porous layer displays well-resolved Fabry-P&#233;rot fringe patterns in its reflectivity spectrum. Applying a fast Fourier transform (FFT) to reflectivity data results in a single peak. Changes in the intensity of the FFT peak are monitored. Thus, target bacteria capture onto the biosensor surface, through antibody-antigen interactions, induces measurable changes in the intensity of the FFT peaks, allowing for a &#39;real time&#39; observation of bacteria attachment.
The mesoporous Si film, fabricated by an electrochemical anodization process, is conjugated with monoclonal antibodies, specific to the target bacteria. The immobilization, immunoactivity and specificity of the antibodies are confirmed by fluorescent labeling experiments. Once the biosensor is exposed to the target bacteria, the cells are directly captured onto the antibody-modified porous Si surface. These specific capturing events result in intensity changes in the thin-film optical interference spectrum of the biosensor. We demonstrate that these biosensors can detect relatively low bacteria concentrations (detection limit of 104 cells/ml) in less than an hour.

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor for rapid bacteria detection is introduced. The biosensor is based on a nanostructured porous Si, which is designed to directly capture the target bacteria cells onto its surface. We use monoclonal antibodies, immobilized onto the porous transducer, as the capture probes. Our studies demonstrate the applicability of these biosensors for the detection of low bacterial concentrations within minutes with no prior sample processing (such as cell lysis).

を光学的に検出<em&gt; E.大腸菌の</emメソポーラスケイ素バイオセンサーによる&gt;バクテリア

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be increasingly important. As RNA function often depends on its ability to adopt alternative structures, it is difficult to predict RNA three-dimensional structures directly from sequence. Single-molecule approaches show potentials to solve the problem of RNA structural polymorphism by monitoring molecular structures one molecule at a time. This work presents a method to precisely manipulate the folding and structure of single RNA molecules using optical tweezers. First, methods to synthesize molecules suitable for single-molecule mechanical work are described. Next, various calibration procedures to ensure the proper operations of the optical tweezers are discussed. Next, various experiments are explained. To demonstrate the utility of the technique, results of mechanically unfolding RNA hairpins and a single RNA kissing complex are used as evidence. In these examples, the nanomanipulation technique was used to study folding of each structural domain, including secondary and tertiary, independently. Lastly, the limitations and future applications of the method are discussed.

Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5&#8217; and 3&#8217; ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules.

光ピンセットによる単一のRNA分子のナノマニピュレーション

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration of pre-processing steps. Utilizing these devices towards the analysis of DNA hybridization events is important because it offers a technology for real time assessment of biomarkers at the point-of-care for various diseases. However, when the device footprint decreases the dominance of various physical phenomena increases. These phenomena influence the fabrication precision and operation reliability of the device. Therefore, there is a great need to accurately fabricate and operate these devices in a reproducible manner in order to improve the overall performance. Here, we describe the protocols and the methods used for the fabrication and the operation of a microfluidic-based electrochemical biochip for accurate analysis of DNA hybridization events. The biochip is composed of two parts: a microfluidic chip with three parallel micro-channels made of polydimethylsiloxane (PDMS), and a 3 x 3 arrayed electrochemical micro-chip. The DNA hybridization events are detected using electrochemical impedance spectroscopy (EIS) analysis. The EIS analysis enables monitoring variations of the properties of the electrochemical system that are dominant at these length scales. With the ability to monitor changes of both charge transfer and diffusional resistance with the biosensor, we demonstrate the selectivity to complementary ssDNA targets, a calculated detection limit of 3.8 nM, and a 13% cross-reactivity with other non-complementary ssDNA following 20 min&#160;of incubation. This methodology can improve the performance of miniaturized devices by elucidating on the behavior of diffusion at the micro-scale regime and by enabling the study of DNA hybridization events.

We present a microfluidic-based electrochemical biochip for DNA hybridization detection. Following ssDNA probe functionalization, the specificity, sensitivity, and detection limit are studied with complementary and non-complementary ssDNA targets. Results illustrate the influence of the DNA hybridization events on the electrochemical system, with a detection limit of 3.8 nM.

ラベルフリーDNAハイブリダイゼーション分析のためのマイクロ流体ベースの電気化学バイオチップ

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration ...

A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning of such signaling can lead to many disorders. To understand cell-to-cell signaling, it is essential to study the spatial and temporal nature of the secreted molecules from the cell without disturbing the local environment. Various assays have been developed to study protein secretion, however, these methods are typically based on fluorescent probes which disrupt the relevant signaling pathways. To overcome this limitation, a label-free technique is required.
In this paper, we describe the fabrication and application of a label-free localized surface plasmon resonance imaging (LSPRi) technology capable of detecting protein secretions from a single cell. The plasmonic nanostructures are lithographically patterned onto a standard glass coverslip and can be excited using visible light on commercially available light microscopes. Only a small fraction of the coverslip is covered by the nanostructures and hence this technique is well suited for combining common techniques such as fluorescence and bright-field imaging.
A multidisciplinary approach is used in this protocol which incorporates sensor nanofabrication and subsequent biofunctionalization, binding kinetics characterization of ligand and analyte, the integration of the chip and live cells, and the analysis of the measured signal. As a whole, this technology enables a general label-free approach towards mapping cellular secretions and correlating them with the responses of nearby cells.

Inter-cellular communication is critical for controlling various physiological activities within and outside the cell. This paper describes a protocol for measuring the spatio-temporal nature of single cell secretions. To achieve this, a multidisciplinary approach is used which integrates label-free nanoplasmonic sensing with live cell imaging.

単一細胞分泌物の時空間イメージング用ラベルフリー技術

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental studies on the behavior of molecules. Single molecule detection techniques commonly utilize labels such as fluorescent tags or quantum dots, however, labels are not always available, increase cost and complexity, and can perturb the events being studied. Optical resonators have emerged as a promising means to detect single molecules without the use of labels. Currently the smallest particle detected by a non-plasmonically-enhanced bare optical resonator system in solution is a 25 nm polystyrene sphere1. We have developed a technique known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that can surpass this limit and achieve label-free single molecule detection in aqueous solution2. As signal strength scales with particle volume, our work represents a &#62; 100x improvement in the signal to noise ratio (SNR) over the current state of the art. Here the procedures behind FLOWER are presented in an effort to increase its usage in the field.

We have developed a label-free biosensing system based on optical resonator technology known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that is capable of detecting single molecules in solution. Here the procedures behind this work are described and presented.

マイクロトロイドの光共振器を用いたラベルフリー単一分子検出

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

The Use of a &#946;-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions

Biosensors are becoming increasingly important and implemented in various fields such as pathogen detection, molecular diagnosis, environmental monitoring, and food safety control. In this context, we used &#946;-lactamases as efficient reporter enzymes in several protein-protein interaction studies. Furthermore, their ability to accept insertions of peptides or structured proteins/domains strongly encourages the use of these enzymes to generate chimeric proteins. In a recent study, we inserted a single-domain antibody fragment into the Bacillus licheniformis BlaP &#946;-lactamase. These small domains, also called nanobodies, are defined as the antigen-binding domains of single chain antibodies from camelids. Like common double chain antibodies, they show high affinities and specificities for their targets. The resulting chimeric protein exhibited a high affinity against its target while retaining the &#946;-lactamase activity. This suggests that the nanobody and &#946;-lactamase moieties remain functional. In the present work, we report a detailed protocol that combines our hybrid &#946;-lactamase system to the biosensor technology. The specific binding of the nanobody to its target can be detected thanks to a conductimetric measurement of the protons released by the catalytic activity of the enzyme.

The Use of a &amp;#946;-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions

In this work, we report a new method to study protein-protein interactions using a conductimetric biosensor based on the hybrid &#946;-lactamase technology. This method relies on release of protons upon hydrolysis of &#946;-lactams.

生体分子相互作用を検出する β-ラクタマーゼによる伝導度バイオ センサー法の使用

Biosensors are becoming increasingly important and implemented in various fields such as pathogen detection, molecular diagnosis, environmental ...

PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific lipid component within a membrane, as in the case of phosphoinositides (PIPs), to ensure specific subcellular localization and/or activation. PIPs and cellular PIP-binding domains have been studied extensively to better understand their role in cellular physiology. We applied a pH modulation assay on supported lipid bilayers (SLBs) as a tool to study protein-PIP interactions. In these studies, pH sensitive ortho-Sulforhodamine B conjugated phosphatidylethanolamine is used to detect protein-PIP interactions. Upon binding of a protein to a PIP-containing membrane surface, the interfacial potential is modulated (i.e. change in local pH), shifting the protonation state of the probe. A case study of the successful usage of the pH modulation assay is presented by using phospholipase C delta1 Pleckstrin Homology (PLC-&#948;1 PH) domain and phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) interaction as an example. The apparent dissociation constant (Kd,app) for this interaction was 0.39 &#177; 0.05 &#181;M, similar to Kd,app values obtained by others. As previously observed, the PLC-&#948;1 PH domain is PI(4,5)P2 specific, shows weaker binding towards phosphatidylinositol 4-phosphate, and no binding to pure phosphatidylcholine SLBs. The PIP-on-a-chip assay is advantageous over traditional PIP-binding assays, including but not limited to low sample volume and no ligand/receptor labeling requirements, the ability to test high- and low-affinity membrane interactions with both small and large molecules, and improved signal to noise ratio. Accordingly, the usage of the PIP-on-a-chip approach will facilitate the elucidation of mechanisms of a wide range of membrane interactions. Furthermore, this method could potentially be used in identifying therapeutics that modulate protein&#39;s capacity to interact with membranes.

Here we present a supported lipid bilayer in the context of a microfluidic platform to study protein-phosphoinositide interactions using a label-free method based on pH modulation.

PIP-on-a-chip：タンパク質 - ホスホイノシチド相互作用のラベルフリー研究

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific ...

Assessing Collagen and Elastin Pressure-dependent Microarchitectures in Live, Human Resistance Arteries by Label-free Fluorescence Microscopy

The pathogenic contribution of resistance artery remodeling is documented in essential hypertension, diabetes and the metabolic syndrome. Investigations and development of microstructurally motivated mathematical models for understanding the mechanical properties of human resistance arteries in health and disease have the potential to aid understanding how disease and medical treatments affect the human microcirculation. To develop these mathematical models, it is essential to decipher the relationship between the mechanical and microarchitectural properties of the microvascular wall. In this work, we describe an ex vivo method for passive mechanical testing and simultaneous label-free three-dimensional imaging of the microarchitecture of elastin and collagen in the arterial wall of isolated human resistance arteries. The imaging protocol can be applied to resistance arteries of any species of interest. Image analyses are described for quantifying i) pressure-induced changes in internal elastic lamina branching angles and adventitial collagen straightness using Fiji and ii) collagen and elastin volume densities determined using Ilastik software. Preferably all mechanical and imaging measurements are performed on live, perfused arteries, however, an alternative approach using standard video-microscopy pressure myography in combination with post-fixation imaging of re-pressurized vessels is discussed. This alternative method provides users with different options for analysis approaches. The inclusion of the mechanical and imaging data in mathematical models of the arterial wall mechanics is discussed, and future development and additions to the protocol are proposed.

We describe simultaneous mechanical testing and 3D-imaging of the arterial wall of isolated, live human resistance arteries, and Fiji and Ilastik image analyses for the quantification of elastin and collagen spatial organization and volume densities. We discuss the use of these data in mathematical models of arterial wall mechanics.

ラベル無料蛍光顕微鏡によるライブ、人間の抵抗血管のコラーゲンとエラスチンの圧力依存性アーキテクチャを評価します。

The pathogenic contribution of resistance artery remodeling is documented in essential hypertension, diabetes and the metabolic syndrome. Investigations ...