この作品は、スコット·I.サイモン、アンソニー·G. PasseriniにNIH / NHLBIの助成金R01 HL082689によってサポートされていました。

1。細胞培養と基板の準備<ol><li>旋盤を使って、100 x 20 mmの組織培養ディッシュ（BDファルコン）から3インチの円形の基板をカットします。 70％エタノールに浸漬して基板を滅菌する。室温で1時間4ミリリットルI型コラーゲン（100μg/ ml）を持つペトリ皿とコートで行われ、その後4ミリリットル1×PBSですすいでください。 </li><li>基板に直接1ミリリットルを適用することにより、6.5x10 5細胞/ mlとシードでヒト大動脈内皮細胞（HAEC、通路4-6）を中断します。 37℃、5％CO 2インキュベーター内で行われ、細胞が1時間の基質に付着することができます。 </li><li>細胞への1xの抗生物質抗真菌剤溶液を補充した内皮増殖培地-2（EGM-2）の9ミリリットルを追加します。細胞が90％コンフルエントに達するまで2日ごとにメディアを変更します。 </li><li> 10％FBSおよび1x抗生物質抗真菌剤溶液を添加したRPMI 1640培地でTHP-1細胞を維持します。彼らは1の密度に達する通路細胞0 6細胞/ ml。 </li></ol> 2。セルのせん断プロトコル細胞は、カスタムコーンとプレートの細胞せん断装置（CSD）に条件付けされています。デバイスの詳細と設計仕様を表1および図4に記載されています。 <ol><li> CSDを準備します。エタノールでチャンバハウジングを殺菌し、滅菌PBSですすいでください。コー​​ンは、細胞単層に垂直であることを保証するために37°Cおよびレベルへの熱住宅を。ハウジングの底部から細胞を基板を組み立て、目的の高さにコーンを設定します。 </li><li>リーボビッツ-15（L-15）CO 2の存在下で適切なpHを維持するために、せん断媒体として内皮BulletKitを添加した培地を使用しています。炎症を刺激する剪断媒体に腫瘍壊死因子-α（TNF-α、は0.5 ng / ml）を加え、入口ポートに接続されたシリンジを介してデバイスに6ミリリットルを注入し、空気を導入しないように世話をするチャンバー内の気泡。 </li><li> 4時間の高振幅安定したせん断応力（HSS、15ダイン/ cm 2）または振動せん断応力（OSS、0±5ダイン/ cm 2、1 Hz）でのせん断細胞。希望するSSは正確に前述のようにマイクロステッピングモータで制御された細胞は、上記円錐を回転させることにより達成され6面の壁SS（τW）で近似されます。 <img src="/files/ftp_upload/4169/4169eq1.jpg" alt="式（1）" /> μは媒体の粘度であり、ωはコーンの角速度であり、αはコーン角（0.5°）である。基板とコーンのアライメントは、精度の平準化と20に設定し、ギャップの高さを介して0.05°±τwの円周方向と半径方向の変動を最小限に抑えるために深さゲージを使用して、10μmの範囲内に調整されます。デバイスは、層流の特性を確保するために検証されています。 cを削除するデバイスからellsと単球接着の分析のために準備します。 </li></ol> 3。 PDMSマイクロ流体チャンバーの作製<ol><li>アプリケーションに応じて、目的のマイクロチャンネル番号とチャンネルの高さのマスター型を取得します。このプロトコルで使用されている特定の設計の特性を表1に詳述されています。 これらを作成するための方法はすでによく文献に記載されています。1簡単に言えば、チャンネルのネットワークは、CADソフトウェアを使用して設計された（Autodesk Inventorの）と5000 dpiで印刷されます透明性。ネガ型フォトレジスト（SU8）は、100μmの厚さのシリコンウエハ上にスピンされています。透明度は重ねて、紫外線にさらされています。非重合フォトレジストが正のレプリカマスターを生成するために削除されます。 </li><li>計量ボートの重量によるシリコーン硬化剤10：01とPDMS液混合シリコーンベースを作成し、5ミリリットル血清をピペットで攪拌する。壁をこすりしないように注意してくださいのソリューションにプラスチックのフレークを加えないようにするためにボートの重量を量る。 </li><li> 100x15mmのペトリ皿の中でマスターウェハを配置し、皿にPDMS液を注ぐ。 </li><li>皿をカバーし、気泡を除去するために15分間、真空容器内に配置します。 15分後にペトリ皿を取り出し、軽く表面上に空気を吹き込むことによって余分な気泡を除去します。 </li><li> 70℃で1時間オーブンでペトリ皿を置き℃に皿を取り外し、鋭い刃を使用して流体チャンバを切り取る。 </li></ol> 4。顕微鏡上のデバイスの組立<ol><li>倒立顕微鏡に光源をオンにして、37にヒーター℃に設定してください。 10mlのシリンジにチューブを接続し、気泡が存在しないことを、蒸留水でいっぱいに。シリンジポンプにシリンジを置き、1ダイン/ cm 2の壁SSを誘導するために流量を設定します。チャネルの中心線に沿って生成された壁面せん断応力（τw）の標準を使用して近似されます。平行平板フローチャンバーの式： <img src="/files/ftp_upload/4169/4169eq2.jpg" alt="式（2）" /> μは体積流量Qは媒体の粘度であり、hはチャネルの高さ、Wはチャネル幅です。 注：チャネルは有限の幅があるので、実際のτwは wはチャネルに応じて異なりますアスペクト比、および測定は、側壁に最も近い25％で回避されます。1,7 </li><li>水の中にPDMSチャンバーを配置し、個々のチャネルから空気を除去するために100μlのマイクロピペットを使用しています。バルブがオフに設定されていることを確認してチャンバーに真空アダプターを取り付けます。 </li><li>目標以上HAEC単分子膜でペトリ皿を置きます。ペトリ皿の上にPDMSチャンバーを配置しない気泡がデバイスと単層の間に形成されないことを保証しながら慎重にHAEC単分子層の上に置きます。真空がオンになっているとチャンバーがしっかりと接続されているように、バルブを回します。 </LI&gt; <li>金属左の唯一の5ミリメートルがあるよう鈍ら19ゲージの針をカットします。バッファを使用してプラスチック製のタンクを記入し、PDMSチャンバーの入り口に入れられます。使用するチャネルの適切な数に対して、この手順を繰り返します。シリンジポンプからPDMSチャネル出口にチューブを取り付けます。 </li></ol> 5。せん断応力下では単球接着アッセイ<ol><li> HBSS +のCa 2 + / Mg 2 +の + 0.1％HSAに2×10 6細胞/ mlのTHP-1細胞をサスペンドします。室温で15分間、間質由来因子-1（SDF-1、濃度50μg/ ml）でインキュベートすることによりアクティブ化THP-1細胞。 </li><li>フローを確立するため、シリンジポンプの電源を入れ、気泡を導入することなく、貯水池の細胞懸濁液50μlを加える。一度流れが完全に開発され、データ収集を開始します。 </li><li>解決策が少なくなった場合は、貯水池にバッファを追加し、適切な流量で5分間実行されます。フロー·ストリーム内の任意の未結合細胞を洗浄するためのチャンネルにバッファを流れる続けています。 </li></ol> 6。データ収集と分析<ol><li>チャンネル内の3箇所でのチャネルの縦軸に沿って完全に開発の流れは、次の2分間3フレーム/秒でデジタル画像のシーケンスを取得し、入学後、または最寄りの出口側ポートまたは25％の直前に記録しないように注意しながら壁。 </li><li>単分子層と同じ焦点面での位相明るい外観を識別することによってフィールドごとに停止した細胞の数を数えます。 </li><li>しっかりとした細胞の逮捕は、10秒の動き&lt;½セルの直径によって定義されています。 3ランダムフィールド/チャネルを介して平均データと、ImageJソフトウェアを使用して定量化する。 </li></ol> 7。代表的な結果血管内皮が均一に全身性炎症に寄与するアゴニストにさらされていますが、アテローム性動脈硬化症は、内皮機能の空間的な異質性をが関与し、動脈内の流れの乱れのサイトで優先的に開発の焦点疾患である8。 </suP&gt;このようなTNF-αなどの炎症性メディエーターの代謝ストレス下でのヒト血清中で上昇している循環と障害内皮機能と相関する。9、10、TNF-αの細胞接着分子（CAMのアップレギュレーションを含むECで十分に特徴付けられた応答を誘導する;例えば、VCAM-1、ICAM-1、E-セレクチン）およびケモカイン循環から募集球、早期のアテローム性動脈硬化病変の特徴で、11動態内皮細胞の炎症性表現型の重要な調節因子である12高の大きさのせん断応力（HSS。例えば15ダイン/ cm 2）または拍動性のせん断応力（PSS、動脈のアテローム性動脈硬化症への抵抗のサイトに関連付けられている例えば15±5ダイン/ cm 2）は、TNF-α誘導応答をダウンレギュレートする。逆に、低振幅のせん断応力（LSS、例えば、2ダイン/ cm 2）または振動せん断（OSS;例えば0±5ダイン/ cm 2）in vivoでの影響を受けやすい部位の特徴、cytokiを悪化させるNE-誘発性炎症13、14私たちのマイクロ流体PDMSデバイスは、内皮機能と病態の調節における流体力学的因子と代謝ストレスの重ね合わせに関連した仮説を検証する機構の研究を実施するためのプラットフォームを提供します。アプローチの有用性と汎用性は、大きく分けて以下の代表的な結果により示されています。 <img src="/files/ftp_upload/4169/4169fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。せん断応力は、差動TNF-α炎症性内皮単層にTHP-1細胞接着を調節する。これらのデータは、上記の、ビデオに記載されて説明した詳細なプロトコルを使用して取得した。 HAEC単層は、同時に炎症性サイトカインTNF-α（0.5 ng / mlと、VCAM-1のアップレギュレーションのために〜EC 50）およびHSS（15ダイン/ cm 2）やOSS（0±5ダインのいずれかの低用量に暴露されたdescriとして4時間のカスタムCSDで/ cm 2で 、1 Hz）を詳細なプロトコルのベッド。 THP-1細胞の逮捕は、PDMS流チャンバ内のせん断流の下で定量した。ヒト単球の表現型を模倣し、この細胞株は、その再現性と使いやすさのために選ばれました。 HSS減衰炎症反応は低下したTHP-1細胞停止の結果、OSSに比べて。データは、スチューデントのt検定により分析し、平均値±3つの独立した実験のSEMとして表されます。DeVerseらから許可を得て適応5。 以下のデータは私たちの公開作品から例を使用して、我々のアプローチの多様性を示しています。該当する場合、上記のプロトコルからの逸脱が示されている。 <img src="/files/ftp_upload/4169/4169fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。せん断応力勾配におけるサイトカイン誘導VCAM-1発現と単球の動員の変調。 A）HAEC単層floの下で4時間TNF-α（0.3 ng / ml）で刺激したHele-Shawのフロー理論に基づいて設計さVMMCのワット15チャンネルの中心線に沿ってSSの大きさの線形減少は、二次元よどみ流れの合理化と終了を形成すると一致するようにチャンバの側壁を設計することによって達成されたチャンネルのISO-電位線を一致させることができます。入り口から軸方向距離（x）の時にこのチャネルの中心線に沿って生成された壁面せん断応力（τw）は次式で与えられます。 <img src="/files/ftp_upload/4169/4169eq3.jpg" alt="式（3）" /> μは体積流量Qは媒体の粘度、ここで、hはチャネルの高さであり、w 1は、チャネルの入り口の幅、Lは総チャネルの長さです。Q 16 ​​からSSの大きさの勾配を生成するために選ばれましたよどみ点における0〜入口ダイン/ cm 2 outleに&quot;&quot;ちょうど近トン。B）-C）VCAM-1発現は、量子ドットに結合して刺激静的コントロールの割合の中央値の蛍光強度（MFI）として提示抗体を用いて免疫蛍光顕微鏡でその場で測定した。 SSは刺激HAEC（灰色の三角形）が低く、VCAM-1の基底レベルを調節していませんでした。しかし、VCAM-1発現は、〜2ダイン/ cm 2でピークとせん断の大きさ&gt; 5ダイン/ cm 2（黒四角）で、以下のTNF-αのベースラインに戻ったり、LSSの大きさで、TNF-αの相対増加した。D）単球（10 6 / ml）を）のように前提条件と組織化単分子膜上のパラレル·フロー· ​​チャンネルで5分間2ダイン/ cm 2で灌流した。内皮への単球の動員を定量的に与えられたせん断応力の大きさで、VCAM-1発現と相関していた。特に、monolayeの細かい空間分解能とVCAM-1発現と単球の動員を調べる機能rは、独立した実験でせん断わずか数離散値を適用することによって理解されないSSの大きさの狭い範囲で大きな変化を明らかにした。データは、TNF-αから* P &lt;0.05静的な条件下では、反復測定ANOVAとニューマン·クールズ事後テストによって評価の違いによって分析した。データは平均±3から6の独立した実験からのSEM。 族らから許可を得て適応2。 <img src="/files/ftp_upload/4169/4169fig3.jpg" alt="図3" /> 図3。トリグリセリドに富んだリポ蛋白（TGRL）はドナー血清トリグリセリドレベルとVCAM-1発現に比例してサイトカイン誘導炎症を調節する。HAECの単層をTGRL（10 mg / dlと同時に4時間TNF-α（0.3 ng / ml）で刺激したアポ）静置培養における高脂肪の食事の後に被験者から単離された）。VCAM-1発現はフローサイトメトリーによって中断されたECで個別に測定した。と単球の接着には、詳細なプロトコルで説明されているようVM​​MCを用いて定量。データは、TNF-αからの％変化として表示されます。単球の逮捕は、ドナー血清トリグリセリドのレベルを直接に増加した。B）炎症誘発性ドナーのサブセットの単球停止がVCAM-1のブロッキング抗体の存在下で抑制された内皮細胞VCAM-1発現に直接比例して変化した。意義が対スチューデントt検定によって決定され、3-5の独立した実験からの平均±SEMを意味します。Wangらの許可を得て適応4。

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P., Schaff, U. Y., Hui, D. Y., Rutledge, J. C., Knowlton, A. A., Passerini, A. G., Simon, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triglyceride-rich+lipoproteins+prime+aortic+endothelium+for+an+enhanced+inflammatory+response+to+tumor+necrosis+factor-alpha.">Triglyceride-rich lipoproteins prime aortic endothelium for an enhanced inflammatory response to tumor necrosis factor-alpha.</a> Circ. Res. 100, 381-390 (2007).</li><li>Wang, Y. I., Schulze, J., Raymond, N., Tomita, T., Tam, K., Simon, S. I., Passerini, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+inflammation+correlates+with+subject+triglycerides+and+waist+size+after+a+high-fat+meal.">Endothelial inflammation correlates with subject triglycerides and waist size after a high-fat meal.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. 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利害の衝突が宣言されません。

我々は、CAMの発現と単球接着のリアルタイムイメージングを通じて、血管内皮の炎症性の表現型のオンチップ評価のためのマイクロ流体PDMSデバイスの使用について説明します。我々のアプローチの大きな利点は、このような動脈硬化血管内にせん断応力をミラーリング定義されている流体力学的条件の下で食事の脂質やサイトカインなどの炎症性メディエーターに曝露した細胞の内皮機能不...

<table border="1"><tbody><tr><td> アイテム </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td> 100×20ミリメートルのペトリ皿</td><td> BDファルコン</td><td> 353003 </td></tr><tr><td>エタノール95パーセント</td><td> EMDケミカルズ</td><td> EX0290-1 </td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Cellgro </td><td> 21から031-CV </td></tr><tr><td>私はラット尾由来のコラーゲンを入力します。 </td><td>ギブコ</td><td> A10483-01 </td></tr><tr><td>ヒト大動脈内皮細胞</td><td> Genlantis </td><td> PH30405A </td></tr><tr><td>抗生物質抗真菌ソリューション</td><td>インビトロジェン</td><td> 15240-062 </td></tr><tr><td>内皮BulletKit </td><td>ロンザ</td><td> CC-4176 </td></tr><tr><td>内皮細胞基本培地-2 </td><td>ロンザ</td><td> CC-3156 </td></tr><tr><td> 10mlのシリンジ</td><td> BDファルコン</td><td> 309604 </td></tr><tr><td>ポリウレタンチューブ</td><td>タイゴン</td><td> ABW0001 </td></tr><tr><td>リーボビッツ-15メディア</td><td>ギブコ</td><td> 11415-069 </td></tr><tr><td> Sylgard 184シリコーンエラストマーベース</td><td>ダウコーニング</td><td> 184 </td></tr><tr><td> Sylgard 184シリコーンエラストマー硬化剤</td><td>ダウコーニング</td><td> 184 </td></tr><tr><td> SU8フォトレジストマスターウェーハ</td><td>カリフォルニア大学デ​​ービス校パンラボ</td><td> N / A </td></tr><tr><td> EclipseのTE200倒立顕微鏡</td><td>ニコン</td><td> EclipseのTE200 </td></tr><tr><td>注射器ポンプ</td><td>ハーバード装置</td><td> PHD2000 </td></tr><tr><td> 19ゲージの注射針</td><td>ケンドール</td><td> 8881 </td></tr><tr><td> THP-1単球細胞系</td><td> ATCC </td><td> TIB-202 </td></tr><tr><td>のCa 2 + / Mgの2 HBSS（ハンクス緩衝化生理食塩水溶液）+ </td><td&gt;ギブコ</td><td> 14025-092 </td></tr><tr><td>腫瘍壊死因子α（TNF-α） </td><td> R＆Dシステムズ</td><td> 210-TA-010 </td></tr><tr><td>間質由来因子 - 1（SDF-1） </td><td> R＆Dシステムズ</td><td> 350 NS-010 </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Cellgro </td><td> 10から040-CV </td></tr><tr><td>ヒト血清アルブミン（HSA） </td><td> ZLBベーリング</td><td> NDC 0053-7680-32 </td></tr></tbody></table> 表2特異的試薬および装置。

on-chip endothelial inflammatory phenotyping

アテロームは、内皮機能不全をもたらす全身性炎症の高まり状態に寄与する代謝異常によって増強されています。しかし、リスクの個々のレベルを示す内皮細胞の初期段階で機能的な変更は、直接ガイド治療戦略を支援するために臨床的に評価されていません。また、地元の血行動態による炎症の調節は、アテローム性動脈硬化症の非ランダム分布に寄与しますが、機構は、 生体内で線引きするのは困難です。我々は、正確な流量条件下でのヒト内皮細胞（EC）および単球の炎症性イベントの定量的アッセイ代謝摂動のラボオンチップベースのアプローチを説明します。ソフトリソグラフィーの標準的な方法培養EC単層に直接バインドされている血管擬態流体室（VMMC）を 、microfabricateするために使用されます。1これらのデバイスは、試薬の少量をしながら使用することの利点を持っている明確に定義されたせん断場にさらされたECの膜で炎症イベントを直接イメージングするためのプラットフォームを提供しています。我々は正常ヒト大動脈EC（HAEC）におけるサイトカイン、2脂質A-3、4、RAGEによって誘導される5炎症を調査するためにこれらのデバイスを適用している。ここでは、アッセイの単球細胞（THP-1）圧延および差動のせん断特性の下でエアコンと炎症性サイトカインTNF-αによって活性化されるHAEC単層上で逮捕にVMMCの使用を文書化します。このような研究は代謝危険因子でatherosusceptibilityに機械的な洞察を提供しています。

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On-Chip Endothelial Inflammatory Phenotyping

フォトリソグラフィ法によりエッチングし、PDMSから製造されるマイクロ流体フローチャンバーは、EC機能不全や炎症に関連付けられた機能的転帰を調べるために適用されます。代表的な実験では、EC単層を活性化サイトカインの単球の細胞接着を調節する差動せん断応力の能力が実証されています。

オンチップ·血管内皮の炎症性表現型

Atherogenesis is potentiated by metabolic abnormalities that contribute to a heightened state of systemic inflammation resulting in endothelial ...

on-chip-endothelial-inflammatory-phenotyping

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.8K ビュー.  University of California, Davis. フォトリソグラフィ法によりエッチングし、PDMSから製造されるマイクロ流体フローチャンバーは、EC機能不全や炎症に関連付けられた機能的転帰を調べるために適用されます。代表的な実験では、EC単層を活性化サイトカインの単球の細胞接着を調節する差動せん断応力の能力が実証されています。

ビデオ: On-Chip Endothelial Inflammatory Phenotyping

On-chip Isotachophoresis for Separation of Ions and Purification of Nucleic Acids

Electrokinetic techniques are a staple of microscale applications because of their unique ability to perform a variety of fluidic and electrophoretic processes in simple, compact systems with no moving parts. Isotachophoresis (ITP) is a simple and very robust electrokinetic technique that can achieve million-fold preconcentration1,2 and efficient separation and extraction based on ionic mobility.3 For example, we have demonstrated the application of ITP to separation and sensitive detection of unlabeled ionic molecules (e.g. toxins, DNA, rRNA, miRNA) with little or no sample preparation4-8 and to extraction and purification of nucleic acids from complex matrices including cell culture, urine, and blood.9-12
ITP achieves focusing and separation using an applied electric field and two buffers within a fluidic channel system. For anionic analytes, the leading electrolyte (LE) buffer is chosen such that its anions have higher effective electrophoretic mobility than the anions of the trailing electrolyte (TE) buffer (Effective mobility describes the observable drift velocity of an ion and takes into account the ionization state of the ion, as described in detail by Persat et al.13). After establishing an interface between the TE and LE, an electric field is applied such that LE ions move away from the region occupied by TE ions. Sample ions of intermediate effective mobility race ahead of TE ions but cannot overtake LE ions, and so they focus at the LE-TE interface (hereafter called the "ITP interface"). Further, the TE and LE form regions of respectively low and high conductivity, which establish a steep electric field gradient at the ITP interface. This field gradient preconcentrates sample species as they focus. Proper choice of TE and LE results in focusing and purification of target species from other non-focused species and, eventually, separation and segregation of sample species.
We here review the physical principles underlying ITP and discuss two standard modes of operation: "peak" and "plateau" modes. In peak mode, relatively dilute sample ions focus together within overlapping narrow peaks at the ITP interface. In plateau mode, more abundant sample ions reach a steady-state concentration and segregate into adjoining plateau-like zones ordered by their effective mobility. Peak and plateau modes arise out of the same underlying physics, but represent distinct regimes differentiated by the initial analyte concentration and/or the amount of time allotted for sample accumulation.
We first describe in detail a model peak mode experiment and then demonstrate a peak mode assay for the extraction of nucleic acids from E. coli cell culture. We conclude by presenting a plateau mode assay, where we use a non-focusing tracer (NFT) species to visualize the separation and perform quantitation of amino acids.

Isotachophoresis (ITP) is a robust electrokinetic separation and preconcentration technique with applications ranging from toxin detection to sample preparation. We review the physical principles of ITP and the methodology of applying this technique to two specific example applications: separation and detection of small molecules and purification of nucleic acids from cell culture lysate.

イオンの分離及び核酸の精製のためのオンチップ等速電気泳動

Electrokinetic techniques are a staple of microscale applications because of their unique ability to perform a variety of fluidic and electrophoretic ...

生物工学

Lensfree On-chip Tomographic Microscopy Employing Multi-angle Illumination and Pixel Super-resolution

Tomographic imaging has been a widely used tool in medicine as it can provide three-dimensional (3D) structural information regarding objects of different size scales. In micrometer and millimeter scales, optical microscopy modalities find increasing use owing to the non-ionizing nature of visible light, and the availability of a rich set of illumination sources (such as lasers and light-emitting-diodes) and detection elements (such as large format CCD and CMOS detector-arrays). Among the recently developed optical tomographic microscopy modalities, one can include optical coherence tomography, optical diffraction tomography, optical projection tomography and light-sheet microscopy. 1-6 These platforms provide sectional imaging of cells, microorganisms and model animals such as C. elegans, zebrafish and mouse embryos.
Existing 3D optical imagers generally have relatively bulky and complex architectures, limiting the availability of these equipments to advanced laboratories, and impeding their integration with lab-on-a-chip platforms and microfluidic chips. To provide an alternative tomographic microscope, we recently developed lensfree optical tomography (LOT) as a high-throughput, compact and cost-effective optical tomography modality. 7 LOT discards the use of lenses and bulky optical components, and instead relies on multi-angle illumination and digital computation to achieve depth-resolved imaging of micro-objects over a large imaging volume. LOT can image biological specimen at a spatial resolution of &lt;1 &mu;m x &lt;1 &mu;m x &lt;3 &mu;m in the x, y and z dimensions, respectively, over a large imaging volume of 15-100 mm3, and can be particularly useful for lab-on-a-chip platforms.

Lensfree optical tomography is a three-dimensional microscopy technique that offers a spatial resolution of &lt;1 &mu;m &times; &lt;1 &mu;m &times; &lt;3 &mu;m in x, y and z dimensions, respectively, over a large imaging-volume of 15-100 mm3, which can be particularly useful for integration with lab-on-a-chip platforms.

マルチアングル照明とピクセル超高解像度を採用しLensfreeオンチップ·トモグラフィー顕微鏡

Tomographic imaging has been a widely used tool in medicine as it can provide three-dimensional (3D) structural information regarding objects of different ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Our understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the mechanical properties of the endothelial surface layer. It is known that adhesion molecules on leukocytes are distributed non-uniformly relative to surface topography 3, that topography limits adhesive bond formation with other surfaces 9, and that physiological contact forces (&asymp; 5.0 &minus; 10.0 pN per microvillus) can compress the microvilli to as little as a third of their resting length, increasing the accessibility of molecules to the opposing surface 3, 7. We consider the endothelium as a two-layered structure, the relatively rigid cell body, plus the glycocalyx, a soft protective sugar coating on the luminal surface 6. It has been shown that the glycocalyx can act as a barrier to reduce adhesion of leukocytes to the endothelial surface 4. In this report we begin to address the deformability of endothelial surfaces to understand how the endothelial mechanical stiffness might affect bond formation. Endothelial cells grown in static culture do not express a robust glycocalyx, but cells grown under physiological flow conditions begin to approximate the glycocalyx observed in vivo 2. The modulus of the endothelial cell body has been measured using atomic force microscopy (AFM) to be approximately 5 to 20 kPa 5. The thickness and structure of the glycocalyx have been studied using electron microscopy 8, and the modulus of the glycocalyx has been approximated using indirect methods, but to our knowledge, there have been no published reports of a direct measurement of the glycocalyx modulus in living cells. In this study, we present indentation experiments made with a novel AFM probe on cells that have been cultured in conditions to maximize their glycocalyx expression to make direct measurements of the modulus and thickness of the endothelial glycocalyx.

The mechanical characteristics of endothelial glycocalyx were measured by indentation using micron sized spheres on AFM cantilevers. Endothelial cells were cultured in a custom chamber under physiological flow conditions to induce glycocalyx expression. Data were analyzed using a thin film model to determine the glycocalyx thickness and modulus.

原子間力顕微鏡と内皮グリコカリックスの機械的性質の定量化

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Ferromagnetic Bare Metal Stent for Endothelial Cell Capture and Retention

Rapid endothelialization of cardiovascular stents is needed to reduce stent thrombosis and to avoid anti-platelet therapy which can reduce bleeding risk. The feasibility of using magnetic forces to capture and retain endothelial outgrowth cells (EOC) labeled with super paramagnetic iron oxide nanoparticles (SPION) has been shown previously. But this technique requires the development of a mechanically functional stent from a magnetic and biocompatible material followed by in-vitro and in-vivo testing to prove rapid endothelialization. We developed a weakly ferromagnetic stent from 2205 duplex stainless steel using computer aided design (CAD) and its design was further refined using finite element analysis (FEA). The final design of the stent exhibited a principal strain below the fracture limit of the material during mechanical crimping and expansion. One hundred stents were manufactured and a subset of them was used for mechanical testing, retained magnetic field measurements, in-vitro cell capture studies, and in-vivo implantation studies. Ten stents were tested for deployment to verify if they sustained crimping and expansion cycle without failure. Another 10 stents were magnetized using a strong neodymium magnet and their retained magnetic field was measured. The stents showed that the retained magnetism was sufficient to capture SPION-labeled EOC in our in-vitro studies. SPION-labeled EOC capture and retention was verified in large animal models by implanting 1 magnetized stent and 1 non-magnetized control stent in each of 4 pigs. The stented arteries were explanted after 7 days and analyzed histologically. The weakly magnetic stents developed in this study were capable of attracting and retaining SPION-labeled endothelial cells which can promote rapid healing.

Our goals were to design, manufacture and test ferromagnetic stents for endothelial cell capture. Ten stents were tested for fracture and 10 more stents were tested for retained magnetism. Finally, 10 stents were tested in-vitro and 8 more stents were implanted in 4 pigs to show cell capture and retention.

内皮細胞捕捉および保持のための強磁性ベアメタルステント

Rapid endothelialization of cardiovascular stents is needed to reduce stent thrombosis and to avoid anti-platelet therapy which can reduce bleeding risk. ...

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An easy-to-use and low-cost sensor platform is highly desired to measure various types of analytes (e.g., biomarkers, hormones, and drugs) quantitatively and specifically. For this reason, dry film photoresist technology - enabling cheap, facile, and high-throughput fabrication - was used to manufacture the microfluidic biosensor presented here. Depending on the bioassay used afterwards, the versatile platform is capable of detecting various types of biomolecules. For the fabrication of the device, platinum electrodes are structured on a flexible polyimide (PI) foil in the only clean-room process step. The PI foil serves as a substrate for the electrodes, which are insulated with an epoxy-based photoresist. The microfluidic channel is subsequently generated by the development and lamination of dry film photoresist (DFR) foils onto the PI wafer. By using a hydrophobic stopping barrier in the channel, the channel is separated into two specific areas: an immobilization section for the enzyme-linked assay and an electrochemical measurement cell for the amperometric signal readout.
The on-chip bioassay immobilization is performed by the adsorption of the biomolecules to the channel surface. The glucose oxidase enzyme is used as a transducer for electrochemical signal generation. In the presence of the substrate, glucose, hydrogen peroxide is produced, which is detected at the platinum working electrode. The stop-flow technique is applied to obtain signal amplification along with rapid detection. Different biomolecules can quantitatively be measured by means of the introduced microfluidic system, giving an indication of different types of diseases, or, in regard to therapeutic drug monitoring, facilitating a personalized therapy.

A microfluidic biosensor platform was designed and fabricated using low-cost dry film photoresist technology for the rapid and sensitive quantification of various analytes. This single-use system allows for the electrochemical readout of on-chip-immobilized enzyme-linked assays by means of the stop-flow technique.

ドライ フィルムのレジストを用いた電気化学マイクロ流体バイオ プラットフォーム: デバイス作製、チップの試金の準備、およびシステム操作

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful research tools for studying human health and disease. To characterize the barrier function of cell layers cultured inside organ-on-chip devices, often transendothelial or transepithelial electrical resistance (TEER) is measured. To this end, electrodes are usually integrated into the chip by micromachining methods to provide more stable measurements than is achieved with manual insertion of electrodes into the inlets of the chip. However, these electrodes frequently hamper visual inspection of the studied cell layer or require expensive cleanroom processes for fabrication. To overcome these limitations, the device described here contains four easily integrated electrodes that are placed and fixed outside of the culture area, making visual inspection possible. Using these four electrodes the resistance of six measurement paths can be quantified, from which the TEER can be directly isolated, independent of the resistance of culture medium-filled microchannels. The blood-brain barrier was replicated in this device and its TEER was monitored to show the device applicability. This chip, the integrated electrodes and the TEER determination method are generally applicable in organs-on-chips, both to mimic other organs or to be incorporated into existing organ-on-chip systems.

This publication describes the fabrication of an organ-on-chip device with integrated electrodes for direct quantification of transendothelial electrical resistance (TEER). For validation, the blood-brain barrier was mimicked inside this microfluidic device and its barrier function was monitored. The presented methods for electrode integration and direct TEER quantification are generally applicable.

作製と内皮下電気抵抗を直接定量化する統合型電極を用いたオンチップ器官システムの検証

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

High Throughput Yeast Strain Phenotyping with Droplet-Based RNA Sequencing

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct libraries of millions of genetically distinct strains, screening for a desired phenotype remains a significant obstacle. With existing screening techniques, there is a tradeoff between information output and throughput, with high-throughput screening typically being performed on one product of interest. Therefore, we present an approach to accelerate strain screening by adapting single cell RNA sequencing to isogenic picoliter colonies of genetically engineered yeast strains. To address the unique challenges of performing RNA sequencing on yeast cells, we culture isogenic yeast colonies within hydrogels and spheroplast prior to performing RNA sequencing. The RNA sequencing data can be used to infer yeast phenotypes and sort out engineered pathways. The scalability of our method addresses a critical obstruction in microbial engineering.

A bottleneck in the &#8216;design-build-test&#8217; cycle of microbial engineering is the speed at which we can perform functional screens of strains. We describe a high-throughput method for strain screening applied to hundreds to thousands of yeast cells per experiment that utilizes droplet-based RNA sequencing.

液滴ベースのRNAシーケンシングによるハイスループット酵母株フェノタイピング

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct ...

Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks

Bioprinting is emerging as a promising tool to fabricate 3D human cancer models that better recapitulate critical hallmarks of in vivo tissue architecture. In current layer-by-layer extrusion bioprinting, individual cells are extruded in a bioink together with complex spatial and temporal cues to promote hierarchical tissue self-assembly. However, this biofabrication technique relies on complex interactions among cells, bioinks and biochemical and biophysical cues. Thus, self-assembly may take days or even weeks, may require specific bioinks, and may not always occur when there is more than one cell type involved. We therefore developed a technique to directly bioprint pre-formed 3D breast epithelial spheroids in a variety of bioinks. Bioprinted pre-formed 3D breast epithelial spheroids sustained their viability and polarized architecture after printing. We additionally printed the 3D spheroids onto vascular endothelial cell networks to create a co-culture model. Thus, the novel bioprinting technique rapidly creates a more physiologically relevant 3D human breast model at lower cost and with higher flexibility than traditional bioprinting techniques. This versatile bioprinting technique can be extrapolated to create 3D models of other tissues in additional bioinks.

The goal of this protocol is to directly bioprint breast epithelial cells as multicellular spheroids onto pre-formed endothelial networks to rapidly create 3D breast-endothelial co-culture models which can be used for drug screening studies.

内皮ネットワーク上の3D多細胞乳房スフェロイドの直接バイオプリンティング

Bioprinting is emerging as a promising tool to fabricate 3D human cancer models that better recapitulate critical hallmarks of in vivo tissue ...

Characterization of Blood Outgrowth Endothelial Cells (BOEC) from Porcine Peripheral Blood

The endothelium is a dynamic integrated structure that plays an important role in many physiological functions such as angiogenesis, hemostasis, inflammation, and homeostasis. The endothelium also plays an important role in pathophysiologies such as atherosclerosis, hypertension, and diabetes. Endothelial cells form the inner lining of blood and lymphatic vessels and display heterogeneity in structure and function. Various groups have evaluated the functionality of endothelial cells derived from human peripheral blood with a focus on endothelial progenitor cells derived from hematopoietic stem cells or mature blood outgrowth endothelial cells (or endothelial colony-forming cells). These cells provide an autologous resource for therapeutics and disease modeling. Xenogeneic cells may provide an alternative source of therapeutics due to their availability and homogeneity achieved by using genetically similar animals raised in similar conditions. Hence, a robust protocol for the isolation and expansion of highly proliferative blood outgrowth endothelial cells from porcine peripheral blood has been presented. These cells can be used for numerous applications such as cardiovascular tissue engineering, cell therapy, disease modeling, drug screening, studying endothelial cell biology, and in vitro co-cultures to investigate inflammatory and coagulation responses in xenotransplantation.

Characterization of Blood Outgrowth Endothelial Cells BOEC from Porcine Peripheral Blood

ブタ末梢血からの血液伸長内皮細胞(BOEC)の特性評価

The endothelium is a dynamic integrated structure that plays an important role in many physiological functions such as angiogenesis, hemostasis, ...

A Microphysiological System to Study Leukocyte-Endothelial Cell Interaction during Inflammation

Leukocyte-endothelial cell interactions play an important role in inflammatory diseases such as sepsis. During inflammation, excessive migration of activated leukocytes across the vascular endothelium into key organs can lead to organ failure. A physiologically relevant biomimetic microfluidic assay (bMFA) has been developed and validated using several experimental and computational techniques, which can reproduce the entire leukocyte rolling/adhesion/migration cascade to study leukocyte-endothelial cell interactions. Microvascular networks obtained from in vivo images in rodents were digitized using a Geographic Information System (GIS) approach and microfabricated with polydimethylsiloxane (PDMS) on a microscope slide. To study the effect of shear rate and vascular topology on leukocyte-endothelial cell interactions, a Computational Fluid Dynamics (CFD) model was developed to generate a corresponding map of shear rates and velocities throughout the network. The bMFA enables the quantification of leukocyte-endothelial cells interactions, including rolling velocity, number of adhered leukocytes in response to different shear rates, number of migrated leukocytes, endothelial cell permeability, adhesion molecule expression and other important variables. Furthermore, by using human-related samples, such as human endothelial cells and leukocytes, bMFA provides a tool for rapid screening of potential therapeutics to increase their clinical translatability.

In this protocol, a biomimetic microfluid assay, which can reproduce a physiologically relevant microvascular environment and reproduce the entire leukocyte adhesion/migration cascade, is employed to study leukocyte-endothelial cell interactions in inflammatory disease.

炎症時の白血球-内皮細胞相互作用を研究するための微生理学的システム

Leukocyte-endothelial cell interactions play an important role in inflammatory diseases such as sepsis. During inflammation, excessive migration of ...