The authors would like to thank intern Evelyn Von Neida who provided paramount insights regarding the preparation of biomass samples for both of the high-throughput pipelines discussed in this manuscript. Support for the development of this work and manuscript was provided by the BioEnergy Science Center. The BioEnergy Science Center is a U.S. Department of Energy Bioenergy Research Center supported by the Office of Biological and Environmental Research in the DOE Office of Science. The National Renewable Energy Laboratory (NREL) is a national laboratory of the US DOE Office of Energy Efficiency and Renewable Energy, operated for DOE by the Alliance for Sustainable Energy, LLC. This work was supported by the U.S. Department of Energy under Contract No. DE-AC36-08-GO28308 with the National Renewable Energy Laboratory.

酵素糖化9,29に続いてグルコースおよびキシロース収量の1.高スループットの決意<ol><li>サンプル調製（研削、デ糊付け、抽出、前処理） <ol><li>粒子は、20メッシュ（850ミクロン）スクリーンを通過するように、ウィリーミルを使用して、各バイオマス試料の少なくとも300ミリグラムを挽きます。帯電防止ジップトップバッグに移す（通常はバーコード）とバーコードのデータベースにサンプル情報を記録します。 </li><li>番号が（鉛筆で、インクまたはマーカーを使用しないでください）​​ティーバッグに約静電気防止用の袋から地上バイオマスの250 mg以上を追加し、慎重にティーバッグをロールアップし、防止するために、バイオマスの上に端を折るようにしてくださいというデ糊付けし、抽出中の損失。 </li><li>ティーバッグは、スズ被覆銅線を使用して閉じたラップ。各バーコードのサンプルのティーバッグの数を記録します。 </li><li>商業的な酵素（典型的には、0.25％（v / v）のグルコアミラーゼ（〜1600 AGU / L）からの脱糊付け酵素溶液を調製します0.1 M酢酸ナトリウム（pHは5.0）1.5％（v / v）のα-アミラーゼ（〜2900 KNU-S / L））。バルクバイオマスのグラムあたり16 mlまたは120ティーバッグサンプルあたり500ミリリットルを準備します。注意：地上バイオマスから澱粉を除去することができる負荷量は、酵素負荷および比の範囲で消化した後、デンプンのために試験することにより実験的に決定されるべきです。 </li><li>プラスチック容器では、バルク地上バイオマス1g当たりデ糊付け酵素液の16ミリリットルを追加します。バッチデ糊付けプロトコルの場合、緩衝酵素溶液500 mlに120ティーバッグを追加します。 </li><li>可能な澱粉を除去するために、120rpmで、24（±4）時間、55℃でシェーカーでインキュベートします。 </li><li>脱糊付けインキュベートした後、30分間脱イオン水で数リットルのバイオマスを洗浄し、浸し。カスケードに熱い液体エタノールを引き起こし、解決策のレベルの突然の暴力的な上昇​​をもたらすことができる溶液中の気泡のバンピング（形成を引き起こす可能性がありますバッファー塩を除去するために、このプロセスをさらに2回繰り返し抽出時の反応容器）のうち。 </li><li>脱糊のバイオマスを徹底的にすすいだ後、抽出のためにソックスレー列にティーバッグを置きます。いいえシンブルは、このステップのために必要とされません。 </li><li> 95％のエタノールを用い、ソックスレー還流を設定し、24時間のサンプルを抽出します。 </li><li>ソックスレー反応器からティーバッグを取り外し、平らなトレイの上に単層に広がります。 </li><li>サンプルは、ヒュームフード中で室温で一晩乾燥することができます。 </li><li>ティーバッグをアンロールし、元のバーコード静電​​気防止袋に乾燥バイオマスを返します。 注：帯電防止袋取り扱い特性を改善する、バイオマス中の静電気を低減することで効率的です。他のストレージオプションが使用される場合、追加のバイオマスによる貯蔵容器の側面に付着したバイオマスに必要とされるかもしれません。 </li><li>バーコードホッパーに乾燥バイオマスの少なくとも50 mgの転送（より多くの材料を使用すると、正確な分注のためのより良いです）。 S帯電防止バッグや受信ホッパーのバーコードは正確なサンプルの追跡を確保することができます。 </li><li>固体は、ラック内のサンプルのために細心の注意を払って、ロボットの重さにロードホッパー。すべてのサンプルが含まれており、使用したプレートの数に基づいて、分配プロトコルを選択するのに十分な原子炉プレートをロードします。 </li><li>ロボット耐酸性ステンレス鋼96ウェルプレートに乾燥した試料（±0.3 mg）を5mgの重量を量ります。いずれかの局所的な変動を最小限にするために、プレートの周りに分布し、各サンプルの3複製を秤量。 </li><li>アッセイ性能を追跡するために、十分に特徴付けられたバイオマス標準材料の8制御バイオマスサンプルを含みます。複数のプレートは、複数の標準的なバイオマスホッパーの使用を繰り返し、分配サイクルでホッパーにふるいにかけることによって生じる粒子サイズのずれを最小限に抑えることができます。 注：各プレートには、3反復で24サンプル、脱イオン水と酵素からなる4ブランク、および8制御があるはずですLS、以前に特徴付け標準バイオマスを使用。プレートの4隅の各々の3コーナーウェルは、糖標準用に予約されています。 </li><li>誤ったバイオマス粒子のための空白と砂糖標準井戸を確認し、存在する場合は削除します。 </li><li>各ウェルに脱イオン水250μlを添加し、シリコーン接着剤付きポリテトラフルオロエチレン（PTFE）テープでプレートをシール。 </li><li> 1/8「はんだごてチップを用いて、各プレートのために、各蒸気口（117合計）でPTFEテープを突き刺します。密封された反応容器プレート上に積層空のプレートをガイドとして使用して、PTFEフィルムの動きを制限します。 </li><li>スタックの上下にプレートし、空のプレートの間に0.031 &quot;の厚さのガラス繊維強化PTFE製ガスケット（蒸気ポート用の穴をあらかじめパンチ）でしっかりとプレートを固定します。 17.5分、または所望の重症度に基づいて、他の温度/時間の組み合わせのために180℃に設定した蒸気反応器を用いてサンプルを前処理。 </li><li> 50℃に冷却し、反応器プレート;脱イオン水でフラッディングすることで、C。 </li></ol></li><li>酵素的糖化<ol><li> 1.0 Mクエン酸ナトリウム、pHが5.0に8％（v / v）の酵素溶液からなる酵素糖化液を準備します。反応容器プレートあたり5ミリリットルを準備します。注：必要な希釈は、特定のストック酵素溶液の活性およびタンパク質含量に基づいて決定されるべきです。 </li><li>プレートがクールである場合、20分間1500×gで、スイングバケットローターでそれらを遠心分離します。封止膜削除します。注：これらのプレートは重く、遠心仕様は互換性のためにチェックする必要があります。 </li><li>各ウェルに8％の酵素原液（グラムバイオマスあたり70 mgの酵素）の40μLを追加します。 </li><li>新しいPTFEテープで再密封。磁性板クランプに密封プレートを置きます。 </li><li>静かに反転によるサンプル（少なくとも15倍）を混合し、70時間50℃でインキュベートします。 </li><li>糖化が終了した場合には、1,500 xで反転し、遠心分離することによって、プレートを混ぜます20分間グラム。 </li></ol></li><li>シュガーアッセイ<ol><li> 6グルコースおよび0.014 Mクエン酸緩衝液中のキシロース組み合わせ校正標準0から0.750ミリグラム/ mlの範囲（pHは5.0）のセット準備（0、0.2、0.3、0.45、0.65、および0.75 mgの/ mlの推奨）、および0から0.600それぞれグルコースとキシロースのためミリグラム/ mlの（0、0.1、0.2、0.35、0.45、および0.6 mgの/ mlのを推奨）、。 </li><li>キットの説明書に従って、グルコースオキシダーゼ/ペルオキシダーゼ（GOPOD）およびキシロースデヒドロゲナーゼ（XDH）試薬を準備します。 </li><li>ピペットを用いて、反応容器プレートのコーナーウェル（12ウェルの合計）に隣接する4コーナー井戸とエッジウェルから液体の200μlのを削除します。 </li><li>ピペットを用いて、96ウェルポリスチレン平底希釈プレートの各ウェルに180μlの脱イオン水を分配します。 12砂糖標準とコーナー井戸に水を追加しないでください（96チャンネルヘッドを使用している場合、これらのヒントを削除します）。 </li><li>ピペットを使用して、グルコースアッセイPLの各ウェルに180μlのGOPOD試薬を分配食べました。 </li><li>ピペットを用いて、キシロースアッセイプレートの各ウェルに180μlのXDH試薬を分注します。 </li><li>ピペットを用い、希釈プレートに96ウェルの反応器プレートから20μlの加水分解物のアリコートを移します。井戸の上部からピペットは、バイオマス固形分とコーナーウェル内の残液を避けるために。少なくとも10サイクル粉砕して混合します。 </li><li>ピペットを用い、希釈プレートのコーナーウェルに、二重に、糖標準の110μLを移します。 </li><li>ピペットを使用して、グルコースおよびキシロースアッセイプレートに、希釈プレートからの20μlのアリコートを移します。粉砕して混ぜます。 </li><li> 30分間室温でグルコースおよびキシロースアッセイプレートをインキュベートします。慎重に読む前に任意の表面の気泡を破ります。簡単にプレートの表面上を通過ヒートガンはうまく動作します。 </li><li>紫外/可視96ウェルプレートリーダーを使用して、510 nmの測定波長を設定し、試薬ブランクに対して吸光度を記録。この測定は、グルコース濃度に比例するキノンイミンの形成を監視します。グルコース濃度は、1.3.1で調製した較正標準に基づく較正曲線から計算します。 </li><li>紫外/可視96ウェルプレートリーダーを使用して、340 nmの測定波長を設定し、吸光度を記録します。この測定は、キシロース濃度に比例したNADHのNAD +の還元を、監視します。キシロース濃度は、1.3.1で調製した較正標準に基づく較正曲線から計算します。 </li></ol></li></ol> pyMBMS 28を用いて、全リグニンおよびリグニン単量体含有量の2.高スループット決意<ol><li>サンプル調製<ol><li>ステップ1.1.1、および1.1.6-1.1.8に記載の方法を用いてバイオマスを粉砕し、抽出します。これは、研削、実験のコントロールとして使用する標準のセットの抽出が含まれます。 注：pyMBMS measurementsではなく、粒子サイズに依存しているので、唯一pyMBMSプロトコルを使用する場合、バイオマスの調製は、試料は、&lt;、サンプルホルダーに4ミリメートル適合できるようにするために行われるべきです。 </li><li>約4 mgの小さなへら分配を使用したオートサンプラー用に設計された80μlのステンレス製のカップに準備されたバイオマスの（3〜5 mgのが好ましいです）。 </li><li> （または麦わら-8494;ポプラ-8492;松-8493サトウキビバガス-8491）、分析されるサンプルの少なくとも10％は、米国立標準技術研究所から入手可能なもののような管理基準であることを確認してください。標準はまた、すでに標準的な方法を用いて特徴付けられた分析されるべきサンプルに類似の任意の種であってもよいです。 </li><li>ランダムに時間をかけて可能な分光器のドリフトによるバイアスを避けるために、ピンセットを使用して、オートサンプラーカップにサンプルをロードします。注：サンプルの典型的なランダム化は、一度、すべてのサンプルの測定が含まれるであろう、再ランダム化が続きます重複した測定のためのサンプル程度の。ランダム化プログラムは、オンラインで入手できます。 </li><li>標準穴パンチを使用して、手動でなしバインダーと、型A / Dガラス繊維シートからガラスフィルターディスクを製造します。 、ピンセットでラウンドガラス繊維フィルターを持ち、サンプルカップの上にセンター、実験中に各カップ内の物質を閉じ込めるために3.5ミリメートル六角レンチを使用して、試料中に押し込みます。 </li></ol></li><li>インストゥルメンタル・プロトコル<ol><li>実験試料のために存在することができる化合物の全範囲にわたって最大強度を持つ既知の標準を用いて、質量分析計を較正します。典型的なバイオマスサンプルについては、パーフルオロトリブチルアミン（PFTBA）を使用します。 </li><li>ガス流量計を使用して、0.9 L /分のヘリウムキャリアガス流量を設定します。 </li><li> 500℃での熱分解温度とオートサンプラーソフトウェアを使用して350°Cまでの界面温度にオートサンプラー炉を設定します。注記：1/8 &quot;ステンレス鋼を加熱質量分析計にオートサンプラーを接続する熱テープで包まれた移送ラインを、250℃での熱コントローラを用いて制御されます。 </li><li>質量分析計でのデータ収集を開始し、バックグラウンドスペクトルの収集のための十分なデータを取得するために、少なくとも60秒待ってください。 </li><li> 2.2.2からの仕様に自動化されたオートサンプラー法を開始します。注意：オートサンプラーは、オートサンプラー炉に個別に各サンプルを削除します。総データ収集時間は約1.5分です。しかし、典型的な4 mgのサンプルの熱分解は、30秒後に完了しました。 </li><li> 0.5秒のスキャン速度で、質量分析ソフトウェアを使用して、各サンプルの記録総イオン量（TIC）。 m / z 30〜450の間でレコードの強度。 注意：代表的なバイオマス化合物は、17 eVの時にソフトイオン化を使用します。機器は、1,000のm / z 1から大きな間隔を記録することができます。しかし、走査速度は、コンピュータのCPUパワーによって制限されます。 </li><li> MAを使用して、スペクトルから背景を削除しますヌアルはソフトウェアで機能を強化します。注：データ収集の開始時にベースラインの60スキャン部は、平均バックグラウンド値を計算するために使用されます。この平均背景スペクトルは、質量分析計ソフトウェアで自動的に実験サンプルスペクトルから除去されます。 </li><li>データベースプログラムの中に、各サンプルのスペクトルデータを含む質量分析計ソフトウェアによって作成された単一列のテキストフ​​ァイルをインポートし、1のデータベースにすべてのサンプルを組み合わせます。スプレッドシートに適用可能なメタデータを追加します。統計ソフトウェアパッケージにフォーマットされたデータ（表計算/ CSVファイル）をインポートし、熱分解サンプルの質量の変動を考慮するためにスペクトルを正規化する意味。 </li><li>測定に使用される複製された標準サンプルのグループを分析するためにスペクトルデータを用いて、主成分分析（PCA）を実行するために、統計ソフトウェアパッケージを使用し、ならびに化学物質の分類に不可欠であるピークを評価しますローディングプロット28中の化合物。 PCAグループそのスペクトルの類似性に基づいて、サンプル、および標準のチェックは実行時に起因する機器のドリフトに実験誤差を測定することができます注意してください。 </li><li>リグニンシリン（S）/グアイアシル（G）の比を計算するために、Sのピーク面積を合計（M / Z = 154、167、168、182、194、208、および210）Gピークの和で除算124、137、138、150、164、および178で。 </li><li>総リグニン含量を計算するには、M / Z = 120、124、137、138、150、152、154、164、167、178、180、182、194、及び210とリグニンのピークを合計。 </li><li>そのようなKlasonリグニンとして、総リグニンを推定するための標準的な方法にpyMBMS測定値をスケーリングするための補正係数を算出します。 pyMBMSを使用して、標準試料に対して測定された全リグニン含量によって、個々の標準のKlasonリグニン値を割ります。 </li><li>データセット内のすべてのような種には、この補正係数を適用します。分析バイオマスの種類ごとに繰り返します。 NOTE：補正係数を分析バイオマスのS / Gに基づいて大きく変化することができます。 </li></ol></li></ol>

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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+12.+High-Throughput+Screening+of+Plant+Cell-Wall+Composition+Using+Pyrolysis+Molecular+Beam+Mass+Spectroscopy.">Ch. 12. High-Throughput Screening of Plant Cell-Wall Composition Using Pyrolysis Molecular Beam Mass Spectroscopy.</a> Biofuels: Methods and Protocols. 581, 169-183 (2009).</li><li>Decker, S., Himmel, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+17.+Reducing+the+effect+of+variable+starch+levels+in+biomass+recalcitrance+screening).">Ch. 17. Reducing the effect of variable starch levels in biomass recalcitrance screening).</a> Biomass Conversion. 908, 181-195 (2012).</li><li>Evans, R. J., Milne, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+the+pyrolysis+of+biomass.">Molecular characterization of the pyrolysis of biomass.</a> Energy Fuels. 1 (2), 123-137 (1987).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

次のようにハイスループットスクリーニング実験を行う際に、正確で再現性のあるデータを得るための重要なサンプル調製手順は次のとおりです。 シュガー放出アッセイ： 一般に、サンプルは、一度に、数十から数千の範囲のロットで製造されます。それぞれの主なステップは、典型的には、サンプル間の調製の変動を最小にするために前方に移動...

非再生可能燃料とその関連製品の下落のグローバルな供給として、科学者たちは、植物由来の源1から同様の燃料や化学物質を作成するために挑戦されています。この研究の重要な側面は、植物の種がバイオ燃料及びバイオマテリアル2,3の製造に適している可能性が決定されます。典型的には、これらの原料は、リグニン、セルロース、およびヘミセルロース含有量について評価されます。同様に、熱的、機械的、および/または化学的な前処理を経て解体（反抗）に対する感受性を持つか、その後の酵素糖化なし。より詳細な分析は、リグニンおよびヘミセルロース画分の特定の組成物、ならびに必要に応じて、最適な酵素活性を決定するために使用されます。本質的に希望する商品に生化学的または熱化学変換のための理想的な特性を持たない植物のトランスジェニック修正は鍋の大幅に拡張ソースで研究者に提供していますential原料4。小さ ​​なサンプルセットのために非常に有用であるが、植物の化学的特性を定量化するための標準的な分析方法は、サンプル5-7の数百または数千の迅速なスクリーニングには不向きです。本明細書に記載のHTP法は、迅速かつ効率的に熱および/または酵素分解に細胞壁反抗の変化をバイオマス変異体の大きな番号を評価するために開発されてきました。 これは、HTPスクリーニングアッセイは、本明細書に記載の変換または収量を最大にするように設計されていないことを理解することが重要です。目的は、従来のバイオマス試料の固有の反抗の相対的差異を決定することです。その結果、分析ステップの多くは、目的の最大変換速度または程度を得ることである &quot;典型的な&quot;バイオマス変換アッセイ、異なります。例えば、下部前処理重大度および短い酵素加水分解時間は、異なる最大化するために使用されサンプル間ences。ほとんどの場合、比較的高い酵素負荷を大幅に結果をゆがめる可能性が酵素活性の実験的変動に起因する差異を減少させるために使用されます。 植物の細胞壁と単糖の組成を決定するための迅速な技術は、酵素糖化以下の遊離したロボット、カスタマイズされた、熱化学互換性の96ウェルプレート、および標準的な実験方法8-11や、振動分光法などの楽器のプロトコル（赤外線の変更が含まれます（IR）、近赤外線（NIR）、またはラマン）および核磁気共鳴（NMR）12-17。これらの方法論は、実験の削減につながる、高セルロース、低リグニン含量、または最高グルコース、キシロース、エタノールを得ることが予想される、 などが挙げられる。これらの方法は、バイオマスや消耗品の少量を採用するダウンスケールの分析を有効にしているとの供給原料を分離するための鍵です費用18 </s&gt;アップ。この方法論的アプローチのもう一つの特徴は、種々の実験条件を迅速にすることができることであり、同時にいくつかの例では、評価しました。例えば、異なる前処理方針または酵素カクテルの様々な最適な実験パラメータを迅速に識別して使用することができるように、試験することができます。トウモロコシ茎葉9、ポプラ8,10、サトウキビバガス8、およびスイッチグラス8など人気の原料は、首尾よくこれらのHTP法を用いて評価されています。 総リグニンおよびリグニン単量体組成物はまた、一般的にバイオマスの特性を定量化します。リグニン含量の減少は、多糖類19,20の酵素消化を増加させることが示されています。 （多くの場合、シリン/グアイアシル（S / G）の含有量として報告される）リグニン単量体の比率は植物細胞壁の解体で果たす役割はまだ調査中です。一部のレポートは、S / Gでその削減を示しています他の研究は反対の傾向19,22を発表しながら、比は、加水分解21後に増加したグルコース収量につながりました。リグニンおよびそのモノマーを評価するためのハイスループット法は、振動多変量解析と結合された分光法（IR、NIR、およびラマン23-26）、および熱分解分子ビーム質量分析法（pyMBMS）27,28を含みます 。 バイオマスをスクリーニングするためのHTP法を開発する場合、いくつかの不可欠な考慮事項が念頭に置いておく必要があります。一つの重要な側面は、方法の複雑さです。技術に必要なスキルレベルとは何ですか？計量化学分析は、例えば、構築評価し、予測モデルを維持するための特定のスキルを必要とします。標準的な方法は、望ましくない、準備やデータ解析の手順を示すか、有毒な試薬を使用しています。モデルの開発は、新しいデータがモデルの堅牢性を高めるために時間をかけてモデルに組み込まれている継続的なプロセスです。別considerationはコスト削減であると提案された高スループット法の実験的な分析時間を減少させました。この方法は非常に迅速ですが、非常に高価である場合には、採用する多くのラボのための実現可能な技術ではないかもしれません。この原稿に示される方法は、スループット能力を増幅するように修正された標準化された技術の変異体です。これらのプロトコルは、定量的予測モデルの開発を必要とすることなく、興味のあるバイオマスの特性を測定します。 、モデルを開発するために使用される標準的な分析と強い相関を示すが、実際にサンプルに対する関心の量を測定するほど正確ではありませんしながら、予測方法以来、これらの技術の重要な属性です。使用方法は、基本的に、標準的なベンチスケールの分析方法のバージョンをスケールダウンしているのに対し、正確さと精度、速度とスループットのために取引されています。ほとんどの場合、この結果は、小容量のピペッティングおよび計量の上位エラーに起因するものです。同様の増加サンプルサイズとして十分な不均一性が低減されます。大規模なサンプルセットをスクリーニングし、比較することができますが、別個のキャンペーンの間とベンチスケールの結果との比較を行う際に、細心の注意を払わなければなりません。 最も時間のかかるステップは、バイオマスの物理的操作を必要とします。研削サンプルはサンプル間圧延機を掃除などのサンプルあたりのいくつかの分をとることができます。手動でアンロードをロードし、クリーニングホッパー、充填、ティーバッグやサンプルバッグを空にすることも非常に労働集約的です。各ステップは分以上かかる場合がありますが、数千のサンプルを実行すると、数時間または数日かかる場合があります。ロボットは約3〜4時間または6〜8プレート1日目ロボット-1にバイオマスと典型的な反応容器プレートをロードすることができます。この状況は、同様にテストされる種類、バイオマスの量として使用される精度パラメータに依存します。水を原子炉プレートを充填、希酸、または酵素を迅速に液体処理ロボットを使用して行われます。 Pプレートスタック（1〜20の原子炉プレート）の再治療は、アセンブリは、クールダウン時に1〜3時間がかかり、解体は含まれています。酵素加水分解は3日かかり、糖分析は、アッセイを完了し、結果を読み取るために準備時間の約1時間を加えた反応容器プレートあたり10分を必要とします。設定前処理と分析日の週間スケジュールは、継続的に週〜800〜1000のサンプルをアッセイの人間コンポーネントの奇数時間や週末の努力を最小限に抑え、合理的な作業スケジュールを収納して処理することができます。最大スループットは、主にどのくらいのハードウェア（ロボット、原子炉プレートなど ）、いくつかの要因に依存し、どのくらいの「ソフトウェア」（ すなわち 、人材派遣）マニュアル作業を行うことが可能です。実用的な上限は、2,500〜3,000サンプル/週です。しかし、その出力は、7日週の操作と複数の学生のインターンや技術を必要とします。比較では、HPLCによる3000サンプルは、SAMの約125日を必要とするであろうPLE分析に加えて、手動で分析前に反応器およびフィルタリングのサンプルにサンプルを計量の追加の労働。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Wiley mill</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>3375E15 (Model 4), or 3383L20 (Mini-mill)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-static bags</td>
			<td>Minigrip*</td>
			<td>MGST4P02503</td>
			<td>2.5x3&#34;, multiple suppliers available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tin-coated copper wire</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8871K84</td>
			<td>0.016&#34; diameter, bend-and-stay wire</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tea-bags</td>
			<td>Herbco</td>
			<td>press n&#39; brew teabags</td>
			<td>3.5x5 inches</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gluco-amylase</td>
			<td>Novozymes</td>
			<td>Spirizyme Fuel&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha-amylase</td>
			<td>Novozymes</td>
			<td>Liquozyme SC DS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">
			<table cellpadding="0" cellspacing="0">
				<tbody>
					<tr>
						<td>sodium acetate trihydrate</td>
					</tr>
				</tbody>
			</table>
			</td>
			<td>any chemical supplier</td>
			<td></td>
			<td>reagent grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetic acid</td>
			<td>any chemical supplier</td>
			<td></td>
			<td>reagent grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>190 proof (95%) ethanol</td>
			<td>any chemical supplier</td>
			<td></td>
			<td>reagent grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hoppers</td>
			<td>Freeslate</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well C-276 Hastelloy plates</td>
			<td>Aspen Machining (Lafayette, Colorado)</td>
			<td>N/A (custom built)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/8&#8221; soldering iron tip</td>
			<td>Sears</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silicone-adhesive backed Teflon tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>5180</td>
			<td>3&#34; wide (36-yard rolls)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>enzyme solution</td>
			<td>Novozymes</td>
			<td></td>
			<td>Cellic CTec2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>citric acid monohydrate</td>
			<td>any chemical supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>any chemical supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disposable, polystyrene 96-well plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655101</td>
			<td>or equivalent; multiple suppliers available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose oxidase/peroxidase&#160;</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>K-Gluc</td>
			<td>Megazyme D-glucose assay kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xylose dehydrogenase</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>K-Xylose</td>
			<td>Megazyme D-xylose assay kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose standard solution</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>K-Gluc</td>
			<td>Megazyme D-glucose assay kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xylose standard solution</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>K-Xylose</td>
			<td>Megazyme D-xylose assay kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stainless steel sample cups</td>
			<td>Frontier Laboratories</td>
			<td>PY1-EC80F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass fiber sheets</td>
			<td>Pall</td>
			<td>66227</td>
			<td>8x10&#34; sheets--circles punched with standard hole punch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sugarcane Bagasse Whole Biomass Feedstock</td>
			<td>NIST</td>
			<td>8491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eastern Cottonwood (poplar) Whole Biomass Feedstock</td>
			<td>NIST</td>
			<td>8492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monterey Pine Whole Biomass Feedstock</td>
			<td>NIST</td>
			<td>8493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat Straw Whole Biomass Feedstock</td>
			<td>NIST</td>
			<td>8494</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput screening of recalcitrance variations in lignocellulosic biomass: total lignin, lignin monomers, and enzymatic sugar release

The conversion of lignocellulosic biomass to fuels, chemicals, and other commodities has been explored as one possible pathway toward reductions in the use of non-renewable energy sources. In order to identify which plants, out of a diverse pool, have the desired chemical traits for downstream applications, attributes, such as cellulose and lignin content, or monomeric sugar release following an enzymatic saccharification, must be compared. The experimental and data analysis protocols of the standard methods of analysis can be time-consuming, thereby limiting the number of samples that can be measured. High-throughput (HTP) methods alleviate the shortcomings of the standard methods, and permit the rapid screening of available samples to isolate those possessing the desired traits. This study illustrates the HTP sugar release and pyrolysis-molecular beam mass spectrometry pipelines employed at the National Renewable Energy Lab. These pipelines have enabled the efficient assessment of thousands of plants while decreasing experimental time and costs through reductions in labor and consumables.

熱前処理およびそれに続く酵素糖化の複合効果は、アッセイの終了時に放出されるグルコースおよびキシロースの質量の関数として測定されます。結果は、バイオマスのグラムあたりの放出されたグルコースとキシロースのミリグラムで報告されています。これは通常、出発材料の組成分析に基づく理論収率パーセントとして報告されているベンチスケールのアッセイから報告されたデータ?...

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High-throughput Screening of Recalcitrance Variations in Lignocellulosic Biomass: Total Lignin, Lignin Monomers, and Enzymatic Sugar Release

Plant cell wall structure and chemistry traits are evaluated to identify ideal feedstocks for biofuels and bio-materials. Standard methods have limitations when applied to large data sets. These high-throughput pretreatment, enzyme saccharification, and pyrolysis-molecular beam mass spectrometry methods compare large numbers of biomass samples with decreased experimental time and cost.

リグノセルロース系バイオマス中の反抗バリエーションのハイスループットスクリーニング：総リグニン、リグニンモノマー、および酵素シュガーリリース

The conversion of lignocellulosic biomass to fuels, chemicals, and other commodities has been explored as one possible pathway toward reductions in the ...

high-throughput-screening-recalcitrance-variations-lignocellulosic

Research

JoVE Journal

Environment

9.9K ビュー.  National Renewable Energy Laboratory. Plant cell wall structure and chemistry traits are evaluated to identify ideal feedstocks for biofuels and bio-materials. Standard methods have limitations when applied to large data sets. These high-throughput pretreatment, enzyme saccharification, and pyrolysis-molecular beam mass spectrometry methods compare large numbers of biomass samples with decreased experimental time and cost.

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Determination of Microbial Extracellular Enzyme Activity in Waters, Soils, and Sediments using High Throughput Microplate Assays

Much of the nutrient cycling and carbon processing in natural environments occurs through the activity of extracellular enzymes released by microorganisms. Thus, measurement of the activity of these extracellular enzymes can give insights into the rates of ecosystem level processes, such as organic matter decomposition or nitrogen and phosphorus mineralization. Assays of extracellular enzyme activity in environmental samples typically involve exposing the samples to artificial colorimetric or fluorometric substrates and tracking the rate of substrate hydrolysis. Here we describe microplate based methods for these procedures that allow the analysis of large numbers of samples within a short time frame. Samples are allowed to react with artificial substrates within 96-well microplates or deep well microplate blocks, and enzyme activity is subsequently determined by absorption or fluorescence of the resulting end product using a typical microplate reader or fluorometer. Such high throughput procedures not only facilitate comparisons between spatially separate sites or ecosystems, but also substantially reduce the cost of such assays by reducing overall reagent volumes needed per sample.

Microplate based procedures are described for the colorimetric or fluorometric analysis of extracellular enzyme activity. These procedures allow for the rapid assay of such activity in large numbers of environmental samples within a manageable time frame.

ハイスループットマイクロプレートアッセイを用いてウォーターズ、土壌、および底質中の微生物細胞外酵素活性の測定

Much of the nutrient cycling and carbon  processing in natural environments occurs through the activity of extracellular  enzymes released by ...

環境学

High-throughput Fluorometric Measurement of Potential Soil Extracellular Enzyme Activities

Microbes in soils and other environments produce extracellular enzymes to depolymerize and hydrolyze organic macromolecules so that they can be assimilated for energy and nutrients. Measuring soil microbial enzyme activity is crucial in understanding soil ecosystem functional dynamics. The general concept of the fluorescence enzyme assay is that synthetic C-, N-, or P-rich substrates bound with a fluorescent dye are added to soil samples. When intact, the labeled substrates do not fluoresce. Enzyme activity is measured as the increase in fluorescence as the fluorescent dyes are cleaved from their substrates, which allows them to fluoresce. Enzyme measurements can be expressed in units of molarity or activity. To perform this assay, soil slurries are prepared by combining soil with a pH buffer. The pH buffer (typically a 50 mM sodium acetate or 50 mM Tris buffer), is chosen for the buffer&#39;s particular acid dissociation constant (pKa) to best match the soil sample pH. The soil slurries are inoculated with a nonlimiting amount of fluorescently labeled (i.e. C-, N-, or P-rich) substrate. Using soil slurries in the assay serves to minimize limitations on enzyme and substrate diffusion. Therefore, this assay controls for differences in substrate limitation, diffusion rates, and soil pH conditions; thus detecting potential enzyme activity rates as a function of the difference in enzyme concentrations (per sample).
Fluorescence enzyme assays are typically more sensitive than spectrophotometric (i.e. colorimetric) assays,&#160;but can suffer from interference caused by impurities and the instability of many fluorescent compounds when exposed to light; so caution is required when handling fluorescent substrates. Likewise, this method only assesses potential enzyme activities under laboratory conditions when substrates are not limiting. Caution should be used when interpreting the data representing cross-site comparisons with differing temperatures or soil types, as in situ soil type and temperature can influence enzyme kinetics.

To measure potential rates of soil extracellular enzyme activities, synthetic substrates that are bound to a fluorescent dye are added to soil samples. Enzyme activity is measured as the fluorescent dye is released from the substrate by an enzyme-catalyzed reaction, where higher fluorescence indicates more substrate degradation.

潜在的な土壌菌体外酵素の活動のハイスループット蛍光測定

Microbes in soils and other environments produce extracellular enzymes to depolymerize and hydrolyze organic macromolecules so that they can be ...

Semi-High Throughput Screening for Potential Drought-tolerance in Lettuce (Lactuca sativa) Germplasm Collections

This protocol describes a method by which a large collection of the leafy green vegetable lettuce (Lactuca sativa L.) germplasm was screened for likely drought-tolerance traits. Fresh water availability for agricultural use is a growing concern across the United States as well as many regions of the world. Short-term drought events along with regulatory intervention in the regulation of water availability coupled with the looming threat of long-term climate shifts that may lead to reduced precipitation in many important agricultural regions has increased the need to hasten the development of crops adapted for improved water use efficiency in order to maintain or expand production in the coming years. This protocol is not meant as a step-by-step guide to identifying at either the physiological or molecular level drought-tolerance traits in lettuce, but rather is a method developed and refined through the screening of thousands of different lettuce varieties. The nature of this screen is based in part on the streamlined measurements focusing on only three water-stress indicators: leaf relative water content, wilt, and differential plant growth following drought-stress. The purpose of rapidly screening a large germplasm collection is to narrow the candidate pool to a point in which more intensive physiological, molecular, and genetic methods can be applied to identify specific drought-tolerant traits in either the lab or field. Candidates can also be directly incorporated into breeding programs as a source of drought-tolerance traits.

Semi-High Throughput Screening for Potential Drought-tolerance in Lettuce Lactuca sativa Germplasm Collections

This protocol was developed to screen a large germplasm collection of the leafy vegetable lettuce (Lactuca sativa L.) for drought-tolerance, in order to identify a small candidate pool of lettuce for use in physiological, molecular, and genetic studies to identify underlying drought-tolerance traits along with breeding programs.

レタスの潜在的な干ばつ耐性のためのセミハイスループットスクリーニング（<em&gt;レタス</em&gt;）遺伝資源のコレクション

This protocol describes a method by which a large collection of the leafy green vegetable lettuce (Lactuca sativa L.) germplasm was screened for likely ...

Pretreatment of Lignocellulosic Biomass with Low-cost Ionic Liquids

A number of ionic liquids (ILs) with economically attractive production costs have recently received growing interest as media for the delignification of a variety of lignocellulosic feedstocks. Here we demonstrate the use of these low-cost protic ILs in the deconstruction of lignocellulosic biomass (Ionosolv pretreatment), yielding cellulose and a purified lignin. In the most generic process, the protic ionic liquid is synthesized by accurate combination of aqueous acid and amine base. The water content is adjusted subsequently. For the delignification, the biomass is placed into a vessel with IL solution at elevated temperatures to dissolve the lignin and hemicellulose, leaving a cellulose-rich pulp ready for saccharification (hydrolysis to fermentable sugars). The lignin is later precipitated from the IL by the addition of water and recovered as a solid. The removal of the added water regenerates the ionic liquid, which can be reused multiple times. This protocol is useful to investigate the significant potential of protic ILs for use in commercial biomass pretreatment/lignin fractionation for producing biofuels or renewable chemicals and materials.

The pretreatment of lignocellulosic biomass with protic low-cost ionic liquids is shown, resulting in a delignified cellulose-rich pulp and a purified lignin. The pulp gives rise to high glucose yields after enzymatic saccharification.

低コストのイオン液体でリグノセルロース系バイオマスの前処理

A number of ionic liquids (ILs) with economically attractive production costs have recently received growing interest as media for the delignification of ...

Ammonia Fiber Expansion (AFEX) Pretreatment of Lignocellulosic Biomass

Lignocellulosic materials are plant-derived feedstocks, such as crop residues (e.g., corn stover, rice straw, and sugar cane bagasse) and purpose-grown energy crops (e.g., miscanthus, and switchgrass) that are available in large quantities to produce biofuels, biochemicals, and animal feed. Plant polysaccharides (i.e., cellulose, hemicellulose, and pectin) embedded within cell walls are highly recalcitrant towards conversion into useful products. Ammonia fiber expansion (AFEX) is a thermochemical pretreatment that increases accessibility of polysaccharides to enzymes for hydrolysis into fermentable sugars. These released sugars can be converted into fuels and chemicals in a biorefinery. Here, we describe a laboratory-scale batch AFEX process to produce pretreated biomass on the gram-scale without any ammonia recycling. The laboratory-scale process can be used to identify optimal pretreatment conditions (e.g., ammonia loading, water loading, biomass loading, temperature, pressure, residence time, etc.) and generates sufficient quantities of pretreated samples for detailed physicochemical characterization and enzymatic/microbial analysis. The yield of fermentable sugars from enzymatic hydrolysis of corn stover pretreated using the laboratory-scale AFEX process is comparable to pilot-scale AFEX process under similar pretreatment conditions. This paper is intended to provide a detailed standard operating procedure for the safe and consistent operation of laboratory-scale reactors for performing AFEX pretreatment of lignocellulosic biomass.

Ammonia Fiber Expansion AFEX Pretreatment of Lignocellulosic Biomass

Ammonia fiber expansion (AFEX) is a thermochemical pretreatment technology that can convert lignocellulosic biomass (e.g., corn stover, rice straw, and sugarcane bagasse) into a highly digestible feedstock for both biofuels and animal feed applications. Here, we describe a laboratory-scale method for conducting AFEX pretreatment on lignocellulosic biomass.

アンモニア繊維膨張(AFEX)リグノセルロース系バイオマスの前処理

Lignocellulosic materials are plant-derived feedstocks, such as crop residues (e.g., corn stover, rice straw, and sugar cane bagasse) and purpose-grown ...

A Novel Method for the Pentosan Analysis Present in Jute Biomass and Its Conversion into Sugar Monomers Using Acidic Ionic Liquid

Recently, ionic liquids (ILs) are used for biomass valorization into valuable chemicals because of their remarkable properties such as thermal stability, lower vapor pressure, non-flammability, higher heat capacity, and tunable solubility and acidity. Here, we demonstrate a method for the synthesis of C5 sugars (xylose and arabinose) from the pentosan present in jute biomass in a one-pot process by utilizing a catalytic amount of Br&#248;nsted acidic 1-methyl-3-(3-sulfopropyl)-imidazolium hydrogen sulfate IL. The acidic IL is synthesized in the lab and characterized using NMR spectroscopic techniques for understanding its purity. The various properties of BAIL are measured such as acid strength, thermal and hydrothermal stability, which showed that the catalyst is stable at a higher temperature (250 &#176;C) and possesses very high acid strength (Ho 1.57). The acidic IL converts over 90% of pentosan into sugars and furfural. Hence, the presenting method in this study can also be employed for the evaluation of pentosan concentration in other kinds of lignocellulosic biomass.

We present a protocol for the synthesis of C5 sugars (xylose and arabinose) from a renewable non-edible lignocellulosic biomass (i.e., jute) with the presence of Br&#248;nsted acidic ionic liquids (BAILs) as the catalyst in water. The BAILs catalyst exhibited better catalytic performance than conventional mineral acid catalysts (H2SO4 and HCl).

ペントサン解析手法ジュート バイオマスと酸性イオン液体を用いた糖モノマーへの変換に存在

Recently, ionic liquids (ILs) are used for biomass valorization into valuable chemicals because of their remarkable properties such as thermal stability, ...

High-throughput, Microscale Protocol for the Analysis of Processing Parameters and Nutritional Qualities in Maize (Zea mays L.)

Maize is an important grain crop in the United States and worldwide. However, maize grain must be processed prior to human consumption. Furthermore, whole grain composition and processing characteristics vary among maize hybrids and can impact the quality of the final processed product. Therefore, in order to produce healthier processed food products from maize, it is necessary to know how to optimize processing parameters for particular sets of germplasm to account for these differences in grain composition and processing characteristics. This includes a better understanding of how current processing techniques impact the nutritional quality of the final processed food product. Here, we describe a microscale protocol that both simulates the processing pipeline to produce cornflakes from large flaking grits and allows for the processing of multiple grain samples simultaneously. The flaking grits, the intermediate processed products, or final processed product, as well as the corn grain itself, can be analyzed for nutritional content as part of a high-throughput analytical pipeline. This procedure was developed specifically for incorporation into a maize breeding research program, and it can be modified for other grain crops. We provide an example of the analysis of insoluble-bound ferulic acid and p-coumaric acid content in maize. Samples were taken at five different processing stages. We demonstrate that sampling can take place at multiple stages during microscale processing, that the processing technique can be utilized in the context of a specialized maize breeding program, and that, in our example, most of the nutritional content was lost during food product processing.

High-throughput, Microscale Protocol for the Analysis of Processing Parameters and Nutritional Qualities in Maize Zea mays L.

Here, we present a microscale protocol for processing grain samples and for incorporating this microscale approach into a high-throughput analytical pipeline. This is a higher throughput adaptation of currently available protocols.

マイクロ スケール プロトコル処理解析パラメーターとトウモロコシ (Zea mays l.) で栄養の資質の高いスループット

Maize is an important grain crop in the United States and worldwide. However, maize grain must be processed prior to human consumption. Furthermore, whole ...

A 3-dimensional (3D)-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

The zebrafish is a globally recognized fresh water organism frequently used in developmental biology, environmental toxicology, and human disease related research fields. Thanks to its unique features, including large fecundity, embryo translucency, rapid and simultaneous development, etc., zebrafish embryos are often used for large scale toxicity assessment of chemicals and drug/compound screening. A typical screening procedure involves adult zebrafish spawning, embryos selection, and arraying the embryos into multi-well plates. From there, embryos are subjected to exposure and the toxicity of chemical, or the effectiveness of the drugs/compounds can be evaluated relatively quickly based on phenotypic observations. Among these processes, embryos arraying is one of the most time-consuming and labor-intensive steps that limits the throughput level. In this protocol, we present an innovative approach that makes use of a 3D-printed arraying template coupled with vacuum manipulation to speed up this laborious step. The protocol herein describes the overall design of the arraying template, a detailed experimental setup and step-by-step procedure, followed by representative results. When implemented, this approach should prove beneficial in a variety of research applications using zebrafish embryos as testing subjects.

A 3-dimensional 3D-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

Here, we present a protocol to design and fabricate a zebrafish embryo arraying template, followed by a detailed procedure on the use of such template for high throughput zebrafish embryo arraying into a 96-well plate.

3 次元 (3 D)-高スループット ゼブラフィッシュ胚配列複写のためテンプレートを印刷

The zebrafish is a globally recognized fresh water organism frequently used in developmental biology, environmental toxicology, and human disease related ...

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

Applying toxicity testing of chemicals in higher order organisms, such as mice or rats, is time-consuming and expensive, due to their long lifespan and maintenance issues. On the contrary, the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) has advantages to make it an ideal choice for toxicity testing: a short lifespan, easy cultivation, and efficient reproduction. Here, we describe a protocol for the automatic phenotypic profiling of C. elegans in a 384-well plate. The nematode worms are cultured in a 384-well plate with liquid medium and chemical treatment, and videos are taken of each well to quantify the chemical influence on 33 worm features. Experimental results demonstrate that the quantified phenotype features can classify and predict the acute toxicity for different chemical compounds and establish a priority list for further traditional chemical toxicity assessment tests in a rodent model.

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

A quantitative method has been developed to identify and predict the acute toxicity of chemicals by automatically analyzing the phenotypic profiling of Caenorhabditis elegans. This protocol describes how to treat worms with chemicals in a 384-well plate, capture videos, and quantify toxicological related phenotypes.

線虫の表現型プロファイリングを自動化によって化学的毒性予測のための高スループット試金

Applying toxicity testing of chemicals in higher order organisms, such as mice or rats, is time-consuming and expensive, due to their long lifespan and ...

High-throughput Siderophore Screening from Environmental Samples: Plant Tissues, Bulk Soils, and Rhizosphere Soils

Siderophores (low-molecular weight metal chelating compounds) are important in various ecological phenomenon ranging from iron (Fe) biogeochemical cycling in soils, to pathogen competition, plant growth promotion, and cross-kingdom signaling. Furthermore, siderophores are also of commercial interest in bioleaching and bioweathering of metal-bearing minerals and ores. A rapid, cost effective, and robust means of quantitatively assessing siderophore production in complex samples is key to identifying important aspects of the ecological ramifications of siderophore activity, including, novel siderophore producing microbes. The method presented here was developed to assess siderophore activity of in-tact microbiome communities, in environmental samples, such as soil or plant tissues. The samples were homogenized and diluted in a modified M9 medium (without Fe), and enrichment cultures were incubated for 3 days. Siderophore production was assessed in samples at 24, 48, and 72 hours (h) using a novel 96-well microplate CAS (Chrome azurol sulphonate)-Fe agar assay, an adaptation of the traditionally tedious and time-consuming colorimetric method of assessing siderophore activity, performed on individual cultivated microbial isolates. We applied our method to 4 different genotypes/Lines of wheat (Triticum aestivum L.), including Lewjain, Madsen, and PI561725, and PI561727 commonly grown in the inland Pacific Northwest. Siderophore production was clearly impacted by the genotype of wheat, and in the specific types of plant tissues observed. We successfully used our method to rapidly screen for the influence of plant genotype on siderophore production, a key function in terrestrial and aquatic ecosystems. We produced many technical replicates, yielding very reliable statistical differences in soils and within plant tissues. Importantly, the results show the proposed method can be used to rapidly examine siderophore production in complex samples with a high degree of reliability, in a manner that allows communities to be preserved for later work to identify taxa and functional genes.

We present a protocol for rapid screening of environmental samples for siderophore potential contributing to micronutrient bioavailability and turnover in terrestrial systems.

環境試料からの担鉄細胞高スループット スクリーニング: 植物細胞、一括土壌および根圏土壌

Siderophores (low-molecular weight metal chelating compounds) are important in various ecological phenomenon ranging from iron (Fe) biogeochemical cycling ...