Name: lateral root inducible system in arabidopsis and maize
Uploaded: 2016-01-14T16:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
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The authors thank Davy Opdenacker for technical assistance and photography. We greatly thank Dr. Annick Bleys for helpful suggestions to improve the manuscript. This work was financed by the Interuniversity Attraction Poles Programme IUAP P7/29 'MARS' from the Belgian Federal Science Policy Office, by the FWO grant G027313N and by the Agency for Innovation by Science and Technology, IWT (IR).

1. シロイヌナズナ LRISプロトコル注：テキストは、「小」または「大」規模の実験を指します。そのようなマーカーのライン分析および組織学的染色6、14のような小さな規模の実験では、わずか数のサンプルを必要とします。そのような定量的リアルタイム定量RT-PCR、マイクロアレイ9-11またはRNA配列決定のような大規模な実験は、サンプルのより大きな量を必要とします。このように、サンプル当たり〜1000年苗の量は、ルートセグメントの解剖後にマイクロアレイ実験を行うためにVanneste ら 11で使用されていました。 1日目 <ol><li> シロイヌナズナの種子の殺菌 注：種子消毒のための次の手順のいずれかを選択します。それらのいずれかのプロトコルの次のステップのために適しています。ガス滅菌（1.1.2）は、液体殺菌（1.1.1）上の2つの主な利点を提供する：大規模な麻痺を取り扱う際にはあまり時間がかかります種子のER、何のピペット操作は、個々のサンプルのために発生することがないので、滅菌種子は、より長い期間保存することができます。しかし、デシケーターと慎重な取り扱いが必要です。 <ol><li> 液体滅菌 <ol><li>マイクロ遠心管における種子の所望の数を注ぎます。 2ミリリットルのマイクロ遠心チューブに1.5mlチューブ中の20mg（〜800種子）または40mgの（〜1600種子）まで使用します。 </li><li> 70％エタノール1 mlを加え。反転または軽く2分間振ります。 </li><li> 15分間1mLの滅菌溶液で70％エタノールを交換してください。 （新鮮な滅菌溶液を調製する：3.85ミリリットルの次亜塩素酸ナトリウム（NaOC​​lを）株式（12％）（注意：使用ヒュームフード）、5μlのトゥイーン20を、水で10mlまでのすべての種子が来ることを確認するために、チューブを数回反転します。溶液と接触しました。 </li><li>層流キャビネット中で、1 mlの滅菌蒸留水を消毒液を交換し、繰り返しによって5分間の種を5回すすぎLY新鮮な滅菌蒸留水1mlで置き換えます。 </li></ol></li><li> ガス殺菌 <ol><li> 2 mlのマイクロ遠心チューブにシードの所望の数を注ぎます。いくつかの独立したラインで作業する場合、個々のチューブを使用し、それらをプラスチック微量遠心管ボックスまたはホルダーにオープンしたアレンジ。一本のチューブ内のシードの数は、500（12.5 mg）を超えた場合、成功した滅菌を確実にするために、チューブの適切な数の種を細分化。近隣のチューブのキャップがお互いをカバーしていないことを確認してください。それは殺菌のためだけでなく、デシケーター中であることが必要であるとして、底の箱の蓋を一緒にフィット。 </li><li>ガラスビーカー（：使用ドラフトチャンバー注意）とともに、デシケーターのボウルに箱を置きます。 </li><li> 12％のNaOCl（：使用ドラフトチャンバー注意）100mlの入ったビーカーを埋めます。デシケーターに蓋を置くが、ビーカーが置かれている小さな開口部を残します。 </li><li> 37％塩酸3mlの（発煙）（CAUを追加TION：小さな開口を通してビーカーにヒュームフード）を使用し、迅速にデシケーターを閉じます。 Cl 2ガスの形成に起因するいくつかの時間のためのソリューション意志バブル。 O / Nを閉じた（または少なくとも8時間）システムのままにしておきます。 </li><li>デシケーターの蓋を外します。箱を取り出し、輸送中の汚染を避けるために蓋でそれをカバーしています。 </li><li>層流キャビネットのボックスを入れ、ふたを取り外し、ガス放出を可能にするために、室温で約1時間の種を残します。 注：種子を安全に4℃で最大2週間、閉鎖ミクロ遠心管中の乾燥を格納することができます。 </li></ol></li></ol></li><li> シロイヌナズナの側根の誘導 <ol><li> 側根の阻害（NPA処理） <ol><li> in vitroでの成長のための成長培地を準備します。培地の半分強ムラシゲ・スクーグ塩混合物15、0.1グラム/ Lのミオイノシトール、10グラム/ Lのスクロースを含み、0.5で緩衝されていますG / L 2-（N-モルホリノ）エタンスルホン酸（MES）。 </li><li> 1 M KOHで5.7にpHを調整します。植物組織寒天を8g / Lを加え、121℃で20分間、培地をオートクレーブ。 </li><li>ジメチルスルホキシド（DMSO）（：使用手袋注意）NPAの25 mMストック溶液を調製します。層流キャビネット中で、（ボトルを手で保持することができる温度である）が約65°Cまでオートクレーブ培地を冷却し、10μMNPAの最終濃度を得るために、25 mMのNPAストック溶液を加えます。 </li><li>静かに10秒間ボトルを振ることにより添加した際に均質化します。正方形のシャーレ（12センチメートル×12センチ）あたりの培地50mlを注ぎます。 注：大規模な実験の場合には、容易な移動を確保するためにナイロンメッシュ（20ミクロン）を適用します。オートクレーブ処理（ 図1A）のためのメッシュ（9センチメートル×9センチ）を準備。オートクレーブ処理した場合には、無菌のピンセット（ 図1B）を使用して、増殖培地にメッシュを適用します。静かにSTEを使用して増殖培地にメッシュをプッシュそれは成長培地（ 図1B）（：無菌状態での作業注意）との良好な接触にあることを確認するrilized drigalsky。 </li><li> NPA-プレート上の種をまきます。 注：場合は、大規模な実験が予定されている、（1.2.2.3を参照）2緻密でサンプリングを容易にするための50個の種子のよく整列行まきます。 <ol><li>液体の滅菌の場合は、200μlのピペットを用いて、NPA-プレート上に種をまきます。種子をピペットすることができるようにするために無菌状態でのピペット先端の終わり（または先端の滅菌前）の4ミリメートル - 3をカット。ピペットアップや種子を再懸濁するために数回ダウンは、その後10で約150μlの滅菌水をピペット - 20種子や先端の下部にある種子の堆積物まで待ちます。 （注意：無菌状態での作業） 注意：先端で軽く寒天またはメッシュをタッチすると、シードと水の低下はそれから解放されます（ 図1C）。 </li> &lt;ガス滅菌の場合、Liが&gt;、粘着性表面を確保するために種子を取る前にオートクレーブしtoothpicks.Pinchに寒天につまようじを使用して種をまきます。種子に爪楊枝を使用して1つずつピックアップし、プレート上の種子を配布する（ 図1D）。また、種子に滅菌水を追加し、1.2.1.5.1（注意：無菌状態での作業）に記載されているように種をまきます。 </li></ol></li><li>通気性粘着テープでプレートを密封し、それらに少なくとも2日、最大1週間暗所で4℃でプレートを保存します。これは、層別化し、同期を保証し、より効率的な発芽のために必要とされます。 注：また、種子がより少ない冷蔵庫のスペースを必要とする、播種前成層マイクロ遠心管中で蒸留水に浸漬することができます。この場合には、4℃で少なくとも1週間のチューブを格納し、直ちに（1.2.1.7参照）を播種した後、成長キャビネットにプレートを移動させます。 3日目 </LI&gt; <li>ほぼ垂直の位置（80〜90°）で5日（発芽と成長の3日の2日間）成長キャビネット（連続光（110μEmを-2秒-1）、21°C）にプレートを移動のではなく、培地中の根の成長を確保します。 8日目 </li></ol></li><li> 側根誘導（NAA処理） <ol><li> 1.2.1.1と1.2.1.2で説明したのと同じ成長培地を準備します。 （：使用手袋注意）DMSO中のNAAの50 mMストック溶液を調製します。 65℃までのオートクレーブ処理中に冷却し、10μMNAA（注意：無菌状態での作業）の最終濃度を得るために、培地にNAAのソリューションを追加します。 <ol><li>静かに10秒間ボトルを振ることにより添加した際に均質化します。正方形のシャーレ（12センチメートル×12センチ）あたりの培地50mlを注ぎます。 </li></ol></li><li>これらのSUPに10μMのNPAを補足した成長培地を含むプレートから苗を転送10μMNAAとplemented。 <ol><li>苗の子葉の下に曲がったピンセットの腕を引っ掛け、ゆっくりプレートから取り外します。唯一の根が完全に好ましくは下向きNPA-増殖培地とに接触して成長しているの苗を移します。 </li><li>小さな距離にわたってNAAを含む成長培地の表面上にルートをすくい取ります。植物の根は成長培地との良好な接触状態にあることを確認します。必要に応じて、ピンセットで穏やかに成長培地表面へのルートを押してください。 注：大規模な実験の場合には、ピンセットを持つ2つの上部の角にメッシュを持ち上げてメッシュと転送と接触していないすべての苗を削除します。メッシュが小さな距離（ 図1E）の上に寒天表面上にメッシュをスキミングすることにより、NAAを含む培地との良好な接触状態にあることを確認します。 </li></ol></li><li>通気性のテープで新しいプレートを密封し、成長キャビネットに配置します（コンサンプリングまでの誘導後の所望の時間のための垂直位置にあるtinuous光（110μEmを-2秒-1）、21℃）。 注：大規模な実験の場合には、メッシュ上のすべてを一度に直接ルート・セグメントをカットし、軽くメッシュの表面をこすることによって、それらをサンプリングするためにメスを使用しています。 </li></ol></li></ol></li></ol> 2. LRISトウモロコシプロトコル<ol><li> トウモロコシカーネルの階層化 <ol><li>少なくとも1週間、暗所で4℃でトウモロコシ穀粒をインキュベートします。 注：このプロトコルは、B73トウモロコシ近交系を使用して開発されてきました。 </li></ol></li><li> トウモロコシカーネルの滅菌 1日目 注意：トウモロコシの苗は、無菌状態で増殖させることはありませんが、それはロール紙での真菌の増殖を防止するために、トウモロコシ穀粒を殺菌し、滅菌材料で作業することをお勧めしますシステム。 <ol><li>滅菌ガラスビーカーにトウモロコシカーネルの必要な数を入れてください。 </li><li>滅菌溶液100ml（6％水中の次亜塩素酸ナトリウム）（：使用ドラフトチャンバー注意）を追加します。 </li><li>磁気攪拌棒を加え、室温で5分間低攪拌速度（約250 rpm）で磁気撹拌機にビーカーを置きます。 </li><li>新鮮な滅菌水100mlでソリューションを置き換えることにより、5分間、5回洗浄します。 </li></ol></li><li> トウモロコシカーネルを蒔きます <ol><li>汚染のリスクを軽減し、ペーパータオルのロールを取るために手袋を着用してください。 </li><li> 2枚（約92センチメートル×24センチ）の長さの合計とハンドタオル紙の2ストレッチを切り取り、きれいな表面（ 図2A）に互いの上にそれらを配置します。 </li><li>シートは、長さ（約92センチメートル×12センチ）（ 図2A）の上に二つ折り。 </li><li>トン以上の上部から約2cmで10のカーネルを配布するためにピンセットを使用して、彼の紙の全体の長さ、両端（ 図2B）で無料各カーネルと8センチメートル間に8cmの隙間を維持しながら。カーネルの幼根がダウンと紙（ 図2B）を向いていることを確認します。 </li><li> （ 図2B）の場所に種を維持しながらゆっくりと、長さにわたって紙をロールバックします。ローリングを促進するために、それは最初に滅菌水で紙をスプレーするオプションです。 </li><li>約6センチ、直径14センチ、高さ（例えば、250ミリリットル遠心管）の滅菌ガラス管にロール紙を入れて、ラック（ 図2C）に配置します。 </li></ol></li><li> トウモロコシにおける側根の誘導 <ol><li> （DMSOに溶解）の50mM NPA原液（：使用手袋注意）を準備。 </li><li>各チューブは、滅菌ガラスビーカーに125 mlの滅菌水に50mMのNPAストック溶液から125μLを添加することにより、50μMのNPAソリューションを作ります。 </li><li>よく混ぜ、チューブ内のロール紙の上に、50μMNPA液の125ミリリットルを注ぎます。ロール紙は、ソリューションを吸収し、完全に浸しになります。 注意：他の寸法のロール紙とチューブを使用する場合は、それに応じて音量を調整します。液体は、十分な取り込みを確保するために途中でチューブに到達する必要があります。 </li><li> 3日（27℃、連続光、相対湿度70％）の成長キャビネットにロール紙システムを配置します。ロール紙は、ソリューションが（ 図2D）時間をかけて蒸発するので、余分な50μMのNPA溶液を添加することにより浸したままであることを確認してください。 4日目 </li><li> （DMSOに溶解）、50mMのNAA原液（：使用手袋注意）を準備。 </li><li>各チューブは、滅菌ガラスビーカーに125 mlの滅菌水に50mMのNAAストックから125μlのを追加することで、50μMのNAA液を調製。 </li><li>ゆっくりと紙ロールから残りNPAソリューションのほとんどを絞り出すと場所（：使用手袋注意）それを洗い流すために5分間滅菌水中メートル。ゆっくりと紙ロールからほとんどの水を絞り出します。この洗浄工程を3回繰り返します。 </li><li>十分に混合し、チューブ内の用紙ロールオーバー、50μMのNAA液を注ぎます。彼らは完全に浸されていることを確認します。 </li><li>誘導後の所望の期間の成長キャビネット（27℃、連続光、相対湿度70％）にロール紙システムを配置します。 </li></ol></li><li> トウモロコシの不定冠根における側根の誘導 注：上記のLRISとしては、プライマリルートに側根を誘導します。しかし、トウモロコシおよび他の単子葉植物、プライマリルートおよび胚種子根に、一緒に彼らの側根で、開発苗の間に主に重要です。植物の成長の後の段階では、後胚不定根が茎に発生し、また、新しい根系16を形成するために、側根を開発しています。 LRISも使用することができますdは、胚主要ルートにLRISにいくつかのマイナーな調整に従うことによって、これらの後胚不定冠根の側根を誘導しました。 <ol><li>ロール紙を作るために、それぞれ外側にハンドタオル紙の二つの層、および内で発芽紙の2層を有する紙のサンドイッチを作成します。発芽紙の2枚の間に（ステップ2.1〜2.2を参照）滅菌カーネルを配置します。ハンドタオル紙に比べて発芽紙は、紙の開口部は、後に容易に転がるようになりますこれは、根毛と側根が貫通しにくいでしょう。一方、ハンドタオル紙の2つの外部層は、液体の吸収を促進します。 </li><li> 700ミリリットルのガラス管にロールを挿入し、それらの上NPAずに滅菌水を注ぎます。彼らは完全に浸されていることを確認します。 </li><li>成長キャビネットに滅菌カーネルを発芽（ステップ2.4​​.9を参照）。 </li><li>不定冠根まで苗を育てます（B73のために6日）出現し始めます。ロール紙が必要なときに滅菌水を添加することにより、常に湿った保たれていることを確認します。 </li><li> 4日間、25μMNPA溶液に移す（ステップは2.4.4に2.4.1を参照）、洗浄工程の後、50μMのNAA液でNPAソリューションを置き換えることにより、側根開始の同様の誘導に続いて（ステップ2.4​​を参照してください2.4.9に0.5）。 </li></ol></li></ol>

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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+ethylene+on+uptake,+distribution,+and+metabolism+of+indoleacetic+acid-1-14C+and+-2-14C+and+naphthaleneacetic+acid-1-14C.">Effect of ethylene on uptake, distribution, and metabolism of indoleacetic acid-1-14C and -2-14C and naphthaleneacetic acid-1-14C.</a> Plant Physiol. 46, 157-162 (1970).</li><li>Delbarre, A., Muller, P., Imhoff, V., Guern, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+mechanisms+controlling+uptake+and+accumulation+of+2,4-dichlorophenoxy+acetic+acid,+naphthalene-1-acetic+acid,+and+indole-3-acetic+acid+in+suspension-cultured+tobacco+cells.">Comparison of mechanisms controlling uptake and accumulation of 2,4-dichlorophenoxy acetic acid, naphthalene-1-acetic acid, and indole-3-acetic acid in suspension-cultured tobacco cells.</a> Planta. 198, 532-541 (1996).</li><li>Bailey-Serres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microgenomics:+genome-scale,+cell-specific+monitoring+of+multiple+gene+regulation+tiers.">Microgenomics: genome-scale, cell-specific monitoring of multiple gene regulation tiers.</a> Annu Rev Plant Biol. 64, 293-325 (2013).</li><li>Perez-Torres, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphate+availability+alters+lateral+root+development+in+Arabidopsis+by+modulating+auxin+sensitivity+via+a+mechanism+involving+the+TIR1+auxin+receptor.">Phosphate availability alters lateral root development in Arabidopsis by modulating auxin sensitivity via a mechanism involving the TIR1 auxin receptor.</a> Plant Cell. 20, 3258-3272 (2008).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

シロイヌナズナ LRISプロトコルでは、それが唯一の完全NPAを含む成長培地と接触して成長した実生を転送することが重要です。これは、側根の開始は全体の根の長さの上にブロックされることを保証します。転送中の小植物を傷つけないようにするために、湾曲した鉗子のアームは、苗の子葉の下に引っ掛けることができます。転送時には、苗の根はNAAを含む寒天培地と十分に接触し?...

それが土壌から、足場と水と栄養素の摂取を保証するため、根系は、植物の成長のために重要です。根系の拡大は主に側根の生産に依存しているため、その開始及び形成が広く研究されています。側根は、創業者セル 1と呼ばれる、鞘細胞の特定のサブセットに開始されます。トウモロコシなどの単子葉植物に、それらは師部の極3に見られるのに対し、このようなシロイヌナズナなどのほとんどの双子葉植物では、これらの細胞は、原生木部の極2に配置されています。創始細胞は、特定の細胞周期遺伝子の発現に続いて増加オーキシン応答4、でマークされている（例えば、 サイクリンB1; 1 / CYCB1; 1）、その後、彼らは非対称背斜部門5の第1ラウンドを受けます。協調背斜と周縁部門の一連の後、側根の原基は、最終的にAと出てくるように形成されていますutonomous側根。これらのイベントが豊富でも同期でもないので、側根開始の位置とタイミングは、しかし、予測可能ではありません。これは、このプロセスを研究するためのトランスクリプトミクス、分子的アプローチの使用を妨げます。 これに対処するには、側根誘導系（LRISは）7,6を開発してきた。このシステムでは、苗を最初に結果的に側根の開始を阻止する、オーキシン輸送と蓄積を阻害するN -1-ナフチルフタラミン酸（NPA）で処理されています8。その後、合成オーキシン1-ナフタレン酢酸（NAA）を含む培地に苗を転送することによって、全体の鞘層が、それによって大量の細胞分裂6を開始する側根を誘導上昇オーキシンレベルに応答します。このように、このシステムは、後半の特定の段階について濃縮根サンプルの容易な収集を可能にする、高速同期と豊富側根のイニシエーションにつながりますRALルート開発。その後、これらのサンプルは、側根形成の間のゲノムワイドな発現プロファイルを決定するために用いることができます。 LRISは、側根のシロイヌナズナの開始とトウモロコシ9-13について、すでにかなりの知識が得られましたが、より多くのゲノムが配列決定されており、経済的な重要に知識を伝達する関心の高まりがあるとして、他の植物種にこのシステムを適用する必要性がより明らかになり、種。 ここでは、 シロイヌナズナやトウモロコシLRISsの詳細なプロトコルが与えられています。次に、システムの使用例は、トウモロコシLRISから得られたトランスクリプトミクスデータが異なる植物種間側根開始時に保存された機能を持つ機能的ホモログを同定するために使用することができる方法を示すことによって、提供されます。最後に、他の植物種のためLRISを最適化するためのガイドラインが提案されています。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;ARABIDOPSIS LRIS&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Seeds&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Arabidopsis seeds</td><td></td><td></td><td>Col-0 ecotype</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Gas sterilization of seeds&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>micro-centrifuge tubes 1.5 ml</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>0030 125.215</td><td>Eppendorf microtubes 3810X, PCR clean</td></tr><tr><td>micro-centrifuge tubes 2 ml</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>0030 120.094</td><td>Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes</td></tr><tr><td>hydrochloric acid</td><td>Merck KGaA</td><td>1,003,171,000</td><td>37% (fuming) for analysis EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eu</td></tr><tr><td>glass desiccator</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td></td><td>Pyrex</td></tr><tr><td>glass beaker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>plastic micro-centrifuge tubes box or holder</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Bleach sterilization of seeds&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ethanol</td><td>Chem-Lab nv</td><td>CL00.0505.1000</td><td>Ethanol, abs. 100% a.r. dilute to 70%</td></tr><tr><td>sodium hypochlorite (NaOCl)</td><td>Carl Roth</td><td>9062.3</td><td>12%</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>sterile water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Growth medium&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Murashige and Skoog salt mixture</td><td>DUCHEFA Biochemie B.V.</td><td>M0221-0050</td><td></td></tr><tr><td>myo-inositol</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>I5125-100G</td><td></td></tr><tr><td>2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES)</td><td>DUCHEFA Biochemie B.V.</td><td>M1503.0100</td><td></td></tr><tr><td>sucrose</td><td>VWR, Internation LLC</td><td>27483.294</td><td>D(+)-Sucrose Ph. Eur.</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Merck KGaA</td><td>1050211000</td><td>pellets for analysis (max. 0.002% Na) EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur</td></tr><tr><td>Plant Tissue Culture Agar</td><td>LabM Limited</td><td>MC029</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Lateral root induction chemicals&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-1-naphthylphthalamic acid (NPA)</td><td>DUCHEFA Biochemie B.V.</td><td>No. N0926.0250</td><td>10 &amp;micro;M (Arabidopsis)</td></tr><tr><td>1-naphthalene acetic acid (NAA)</td><td>DUCHEFA Biochemie B.V.</td><td>No. N0903.0050</td><td>10 &amp;micro;M (Arabidopsis)</td></tr><tr><td>dimethylsulfoxide (DMSO)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>494429-1L</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Making a mesh for transfer&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>nylon mesh</td><td>Prosep byba</td><td></td><td>Synthetic nylon mesh 20 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Sowing and seedling handling&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>square petri dish plates</td><td>GOSSELIN</td><td>BP124-05</td><td>12 x 12 cm</td></tr><tr><td>50 ml DURAN tubes</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>CLS430304</td><td>Corning&amp;nbsp;50 ml centrifuge tubes</td></tr><tr><td>drigalski</td><td>Carl Roth</td><td>K732.1</td><td></td></tr><tr><td>pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>cut pipette tips</td><td>Daslab</td><td>162001X</td><td>Universal 200, cut off 5 mm of tip before autoclaving</td></tr><tr><td>breathable tape&amp;nbsp;</td><td>3M Deutschland GmbH</td><td>cat. no. 1530-1</td><td></td></tr><tr><td>tweezers</td><td>Fiers nv/sa</td><td>K342.1; K344.1</td><td>Dumont tweezers type a nr 5; Dumont tweezers type e nr 7</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Growth conditions&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>growth room</td><td></td><td></td><td>21 &amp;deg;C, continuous light</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;MAIZE LRIS&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Seeds&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maize kernels</td><td></td><td></td><td>B-73</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Bleach sterilization of kernels&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>glass beaker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>magnetic stirrer&amp;nbsp;</td><td>Fiers nv/sa</td><td>C267.1</td><td></td></tr><tr><td>sodium hypochlorite (NaOCl)</td><td>Carl Roth</td><td>9062.3</td><td>12%</td></tr><tr><td>sterile water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Lateral root induction chemicals&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-1-naphthylphthalamic acid (NPA)</td><td>DUCHEFA Biochemie B.V.</td><td>No. N0926.0250</td><td>50 &amp;micro;M (maize primary root), 25 &amp;micro;M (maize adventitious root)</td></tr><tr><td>1-naphthalene acetic acid (NAA)</td><td>DUCHEFA Biochemie B.V.</td><td>No. N0903.0050</td><td>50 &amp;micro;M (maize)</td></tr><tr><td>dimethylsulfoxide (DMSO)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>494429-1L</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Sowing and seedling handling&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>paper hand towels</td><td>Kimberly-Clark Professional*</td><td>6681</td><td>SCOTT Hand Towels - Roll / White; sheet size (24 x 46 cm)</td></tr><tr><td>seed germination paper</td><td>Anchor Paper Company</td><td></td><td>10 X 15 38# seed germination paper</td></tr><tr><td>tweezers</td><td>Fiers nv/sa</td><td>K342.1; K344.1</td><td>Dumont tweezers type a nr 5; Dumont tweezers type e nr 7</td></tr><tr><td>250 ml (centrifuge) tubes</td><td>SCHOTT DURAN</td><td>2160136</td><td>approx. 5.6 cm diameter and 14.7 cm height&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>700 ml tubes</td><td>DURAN GROUP</td><td>213994609</td><td>cylinders, round foot tube, D 60&amp;nbsp; x 250</td></tr><tr><td>rack</td><td></td><td></td><td>for maize tubes, home made</td></tr><tr><td>sterile water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Growth conditions&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>growth cabinet</td><td></td><td></td><td>27 &amp;deg;C, continuous light, 70% relative humidity</td></tr></tbody></table>

lateral root inducible system in arabidopsis and maize

Lateral root development contributes significantly to the root system, and hence is crucial for plant growth. The study of lateral root initiation is however tedious, because it occurs only in a few cells inside the root and in an unpredictable manner. To circumvent this problem, a Lateral Root Inducible System (LRIS) has been developed. By treating seedlings consecutively with an auxin transport inhibitor and a synthetic auxin, highly controlled lateral root initiation occurs synchronously in the primary root, allowing abundant sampling of a desired developmental stage. The LRIS has first been developed for Arabidopsis thaliana, but can be applied to other plants as well. Accordingly, it has been adapted for use in maize (Zea mays). A detailed overview of the different steps of the LRIS in both plants is given. The combination of this system with comparative transcriptomics made it possible to identify functional homologs of Arabidopsis lateral root initiation genes in other species as illustrated here for the CYCLIN B1;1 (CYCB1;1) cell cycle gene in maize. Finally, the principles that need to be taken into account when an LRIS is developed for other plant species are discussed.

LRISの適用は、側根開始プロセスの比較トランスクリプトを実行します LRISの1つの用途は、異なる種における側根形成の間の比較遺伝子発現プロファイルの相関関係です。比較トランスクリプトミクスは、異なる種における側根の開発プロセスに関与オルソロガス遺伝子を特定する可能性を作成して近づきま?...

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シロイヌナズナとトウモロコシの側根誘導システム |生物学 |ビデオ

Lateral Root Inducible System in Arabidopsis and Maize

側根誘導系で<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;とトウモロコシ

The Lateral Root Inducible System (LRIS) allows for synchronous induction of lateral roots and is presented for Arabidopsis thaliana and maize.

Lateral root development contributes significantly to the root system, and hence is crucial for plant growth. The study of lateral root initiation is ...

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Experimental Design for Laser Microdissection RNA-Seq: Lessons from an Analysis of Maize Leaf Development

Genes with important roles in development frequently have spatially and/or temporally restricted expression patterns. Often these gene transcripts are not detected or are not identified as differentially expressed (DE) in transcriptomic analyses of whole plant organs. Laser Microdissection RNA-Seq (LM RNA-Seq) is a powerful tool to identify genes that are DE in specific developmental domains. However, the choice of cellular domains to microdissect and compare, and the accuracy of the microdissections are crucial to the success of the experiments. Here, two examples illustrate design considerations for transcriptomics experiments; a LM RNA-seq analysis to identify genes that are DE along the maize leaf proximal-distal axis, and a second experiment to identify genes that are DE in liguleless1-R (lg1-R) mutants compared to wild-type. Key elements that contributed to the success of these experiments were detailed histological and in situ hybridization analyses of the region to be analyzed, selection of leaf primordia at equivalent developmental stages, the use of morphological landmarks to select regions for microdissection, and microdissection of precisely measured domains. This paper provides a detailed protocol for the analysis of developmental domains by LM RNA-Seq. The data presented here illustrate how the region selected for microdissection will affect the results obtained.

Many developmentally important genes have cell- or tissue-specific expression patterns. This paper describes LM RNA-seq experiments to identify genes that are differentially expressed at the maize leaf blade-sheath boundary and in lg1-R mutants compared to wild-type. The experimental considerations discussed here apply to transcriptomic analyses of other developmental phenomena.

レーザーマイクロダイセクションRNA-のSeqのための実験デザイン：トウモロコシ葉の開発の分析からの教訓

Genes with important roles in development frequently have spatially and/or temporally restricted expression patterns. Often these gene transcripts are not ...

生化学

Measuring Gene Expression in Bombarded Barley Aleurone Layers with Increased Throughput

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for germination or early seedling development are activated by gibberellin (GA), while genes associated with stress responses are activated by abscisic acid (ABA). The mechanisms of GA and ABA signaling can be interrogated by introducing reporter gene constructs into aleurone cells via particle bombardment, with the resulting transient expression measured using enzyme assays. An improved protocol is reported that partially automates and streamlines the grain homogenization step and the enzyme assays, allowing significantly more throughput than existing methods. Homogenization of the grain samples is carried out using an automated tissue homogenizer, and GUS (&#946;-glucuronidase) assays are carried out using a 96-well plate system. Representative results using the protocol suggest that phospholipase D activity may play an important role in the activation of HVA1 gene expression by ABA, through the transcription factor TaABF1.

An improved protocol is presented for the measurement of transient gene expression from reporter constructs in barley aleurone cells after particle bombardment. The combination of automated grain grinding with 96-well plate enzyme assays provides high throughput for the procedure.

スループットを向上させると衝撃されたオオムギ糊粉層における遺伝子発現を測定

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for ...

遺伝学

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the flexible and efficient GreenGate cloning system with the proven and benchmarked LhGR system (here termed GR-LhG4) for the inducible expression, we have generated a set of transgenic Arabidopsis lines that can drive the expression of an effector cassette in a range of specific cell types in the three main plant meristems. To this end, we chose the previously developed GR-LhG4 system based on a chimeric transcription factor and a cognate pOp-type promoter ensuring tight control over a wide range of expression levels. In addition, to visualize the expression domain where the synthetic transcription factor is active, an ER-localized mTurquoise2 fluorescent reporter under control of the pOp4 or pOp6 promoter is encoded in driver lines. Here, we describe the steps necessary to generate a driver or effector line and demonstrate how cell type specific expression can be induced and followed in the shoot apical meristem, the root apical meristem and the cambium of Arabidopsis. By using several or all driver lines, the context specific effect of expressing one or multiple factors (effectors) under control of the synthetic pOp promoter can be assessed rapidly, for example in F1 plants of a cross between one effector and multiple driver lines. This approach is exemplified by the ectopic expression of VND7, a NAC transcription factor capable of inducing ectopic secondary cell wall deposition in a cell autonomous manner.

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Here, we describe the generation and application of a set of transgenic Arabidopsis thaliana lines enabling inducible, tissue-specific expression in the three main meristems, the shoot apical meristem, the root apical meristem, and the cambium.

誘導、細胞型における発現シロイヌナズナLhGR を介したトランス-活性化

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis

To facilitate the use of lignocellulosic biomass as an alternative bioenergy resource, during biological conversion processes, a pretreatment step is needed to open up the structure of the plant cell wall, increasing the accessibility of the cell wall carbohydrates. Lignin, a polyphenolic material present in many cell wall types, is known to be a significant hindrance to enzyme access. Reduction in lignin content to a level that does not interfere with the structural integrity and defense system of the plant might be a valuable step to reduce the costs of bioethanol production. In this study, we have genetically down-regulated one of the lignin biosynthesis-related genes, cinnamoyl-CoA reductase (ZmCCR1) via a double stranded RNA interference technique. The ZmCCR1_RNAi construct was integrated into the maize genome using the particle bombardment method. Transgenic maize plants grew normally as compared to the wild-type control plants without interfering with biomass growth or defense mechanisms, with the exception of displaying of brown-coloration in transgenic plants leaf mid-ribs, husks, and stems. The microscopic analyses, in conjunction with the histological assay, revealed that the leaf sclerenchyma fibers were thinned but the structure and size of other major vascular system components was not altered. The lignin content in the transgenic maize was reduced by 7-8.7%, the crystalline cellulose content was increased in response to lignin reduction, and hemicelluloses remained unchanged. The analyses may indicate that carbon flow might have been shifted from lignin biosynthesis to cellulose biosynthesis. This article delineates the procedures used to down-regulate the lignin content in maize via RNAi technology, and the cell wall compositional analyses used to verify the effect of the modifications on the cell wall structure.

Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis

A double stranded RNA interference (dsRNAi) technique is employed to down-regulate the maize cinnamoyl coenzyme A reductase (ZmCCR1) gene to lower plant lignin content. Lignin down-regulation from the cell wall is visualized by microscopic analyses and quantified by the Klason method. Compositional changes in hemicellulose and crystalline cellulose are analyzed.

のリグニンダウンレギュレーション<em&gt;トウモロコシ</em&gt; dsRNAiとクラソンリグニン分析によって

To facilitate the use of lignocellulosic biomass as an alternative bioenergy resource, during biological conversion processes, a pretreatment step is ...

生物工学

Inoculation Strategies to Infect Plant Roots with Soil-Borne Microorganisms

The rhizosphere harbors a highly complex microbial community in which plant roots are constantly challenged. Roots are in close contact with a wide variety of microorganisms, but studies on soil-borne interactions are still behind those performed on aboveground organs. Although some inoculation strategies for infecting model plants with model root pathogens are described in the literature, it remains difficult to get a comprehensive methodological overview. To address this problem, three different root inoculation systems are precisely described that can be applied to gain insights into the biology of root-microbe interactions. For illustration, Verticillium species (namely, V. longisporum and V. dahliae) were employed as root invading model pathogens. However, the methods can be easily adapted to other root colonizing microbes - both pathogenic and beneficial. By colonizing the plant xylem, vascular soil-borne fungi such as Verticillium spp. exhibit a unique lifestyle. After root invasion, they spread via the xylem vessels acropetally, reach the shoot, and elicit disease symptoms. Three representative plant species were chosen as model hosts: Arabidopsis thaliana, economically important oilseed rape (Brassica napus), and tomato (Solanum lycopersicum). Step-by-step protocols are given. Representative results of pathogenicity assays, transcriptional analyses of marker genes, and independent confirmations by reporter constructs are shown. Furthermore, the advantages and disadvantages of each inoculation system are thoroughly discussed. These proven protocols can assist in providing approaches for research questions on root-microbe interactions. Knowing how plants cope with microbes in the soil is crucial for developing new strategies to improve agriculture.

This protocol presents a detailed summary of strategies to inoculate plant roots with soil-borne microbes. Exemplified for the fungi Verticillium longisporum and Verticillium dahliae, three different root infection systems are described. Potential applications and possible downstream analyses are highlighted, and advantages or disadvantages are discussed for each system.

植物の根に土壌媒介微生物を感染させる接種戦略

The rhizosphere harbors a highly complex microbial community in which plant roots are constantly challenged. Roots are in close contact with a wide ...

環境学

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome affinity purification (TRAP) method and consecutive optimized low-input library preparation.
As starting material, we employ plant lines that express GFP-tagged ribosomal protein RPL18 in a cell type-specific manner by use of adequate promoters. Prior to immunopurification and RNA extraction, the tissue is snap frozen, which preserves tissue integrity and simultaneously allows execution of time series studies with high temporal resolution. Notably, cell wall structures remain intact, which is a major drawback in alternative procedures such as fluorescence-activated cell sorting-based approaches that rely on tissue protoplasting to isolate distinct cell populations. Additionally, no tissue fixation is necessary as in laser capture microdissection-based techniques, which allows high-quality RNA to be obtained.
However, sampling from subpopulations of cells and only isolating polysome-associated RNA severely limits RNA yields. It is, therefore, necessary to apply sufficiently sensitive library preparation methods for successful data acquisition by RNA-seq.
TRAP offers an ideal tool for plant research as many developmental processes involve cell wall-related and mechanical signaling pathways. The use of promoters to target specific cell populations is bridging the gap between organ and single-cell level that in turn suffer from little resolution or very high costs. Here, we apply TRAP to study cell-cell communication in lateral root formation.

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Translating ribosome affinity purification (TRAP) offers the possibility to dissect developmental programs with minimal processing of organs and tissues. The protocol yields high-quality RNA from cells targeted with a green fluorescent protein (GFP)-labeled ribosomal subunit. Downstream analysis tools, such as qRT-PCR or RNA-seq, reveal tissue and cell type-specific expression profiles.

細胞型特異的スケールでのシロイヌナズナ・タリアナの開発を調査するためのリボソーム親和性精製(TRAP)の翻訳

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome ...

発生生物学

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular fluorescent complementation (BiFC) assay in tobacco epidermal cells, from testing protein-protein interaction to monitoring spatial distribution of signal transduction in plant cells. In this protocol, we used the BiFC assay to show that the interaction and the signaling between the Arabidopsis MAPKKK YODA and MAPK6 occur at the plasma membrane. When the scaffold protein BASL was co-expressed, the YODA-MAPK interaction redistributed and spatially co-polarized with CFP-BASL. This modified tobacco expression system allows for quick examination of signaling localization and dynamic changes (less than 4 days) and can accommodate multiple of fluorescent protein colors (at least three). We also presented detailed methods to quantify protein distribution (asymmetric spatial localization, or &#34;polarization&#34;) in tobacco cells. This advanced tobacco expression system has a potential to be used widely for quick testing of dynamic signaling events in live plant cells.

At the subcellular level, signaling events are dynamically modulated by developmental and environmental cues. Here we describe a protocol that employs the tobacco transient expression system to monitor dynamic protein-protein interaction and to disclose spatial organization of signal transduction in plant cells.

タバコ一過性発現系を使用したMAPKシグナル伝達経路の空間再編のイメージング

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

生物学

Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the observation of the whole organ with a high spatial- as well as temporal resolution over prolonged periods of time, which may cause photo-toxic effects. This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy, which is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel. The plant is mounted in such a way that the roots are submerged in a liquid medium while the leaves remain in the air. In order to ensure photosynthetic activity of the plant, a custom-made lighting system illuminates the leaves. To keep the roots in darkness the water surface is covered with sheets of black plastic foil. This method allows long-term imaging of plant organ development in standardized conditions.

This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy. The setup is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel and letting it grow in controlled bright conditions. This allows long-term observation of plant organ development in standardized conditions.

ゲルの表面上に成長する植物の根の光シート蛍光顕微鏡

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the ...

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

Demonstrated here is a detailed protocol for Agrobacterium-mediated genetic transformation of maize inbred lines using morphogenic genes Baby boom (Bbm) and Wuschel2 (Wus2). Bbm is regulated by the maize phospholipid transferase gene (Pltp) promoter, and Wus2 is under the control of a maize auxin-inducible (Axig1) promoter. An Agrobacterium strain carrying these morphogenic genes on transfer DNA (T-DNA) and extra copies of Agrobacterium virulence (vir) genes are used to infect maize immature embryo explants. Somatic embryos form on the scutella of infected embryos and can be selected by herbicide resistance and germinated into plants. A heat-activated cre/loxP recombination system built into the DNA construct allows for removal of morphogenic genes from the maize genome during an early stage of the transformation process. Transformation frequencies of approximately 14%, 4%, and 4% (numbers of independent transgenic events per 100 infected embryos) can be achieved for W22, B73, and Mo17, respectively, using this protocol.

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

Plant morphogenic genes can be used to improve genetic transformation of recalcitrant genotypes. Described here is an Agrobacterium-mediated genetic transformation (QuickCorn) protocol for three important public maize inbred lines.

アグロバクテリウム-形態新生遺伝子を用いた再カルシトランストウモロコシ近交線の媒介性不成熟胚変態

Demonstrated here is a detailed protocol for Agrobacterium-mediated genetic transformation of maize inbred lines using morphogenic genes Baby boom (Bbm) ...

アグロバクテリウム媒介性植物の毛根誘導と再生

Hairy Root Transformation and Regeneration in Arabidopsis thaliana and Brassica napus

Hairy root transformation represents a versatile tool for plant biotechnology in various species. Infection by an Agrobacterium strain carrying a Root-inducing (Ri) plasmid induces the formation of hairy roots at the wounding site after the transfer of T-DNA from the Ri plasmid into the plant genome. The protocol describes in detail the procedure of the injection-based hairy root induction in Brassica napus DH12075 and Arabidopsis thaliana Col-0. The hairy roots may be used to analyze a transgene of interest or processed for the generation of transgenic plants. Regeneration medium containing cytokinin 6-benzylaminopurine (5 mg/L) and auxin 1-naphthaleneacetic acid (8 mg/L) successfully elicits shoot formation in both species. The protocol covers the genotyping and selection of regenerants and T1 plants to obtain plants carrying a transgene of interest and free of T-DNA from the Ri plasmid. An alternative process leading to the formation of a composite plant is also depicted. In this case, hairy roots are kept on the shoot (instead of the natural roots), which enables the study of a transgene in hairy root cultures in the context of the whole plant.

著者スポットライト:アブラナ科の効率向上のための毛深い根ベースの形質転換プロトコルの最適化

The protocol describes hairy root induction using Arabidopsis primary inflorescence stems and Brassica napus hypocotyls. The hairy roots can be cultured and used as explants to regenerate transgenic plants.

側根誘導系で

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