We gratefully acknowledge funding for this project from the USDA National Institute of Food and Agriculture grants 2009-01208 and 2009-01984.

MMSを使用して、農業大量の水からの細菌の1。集中<ol><li> MMSの準備<ol><li> 40×12 cmの4プライのチーズクロス矩形部分をカット。 </li><li> 20×6cmの矩形を取得するために両方の軸に沿ってチーズクロスを折る。 </li><li>背の高い約6センチ、直径3cmの円柱状の綿棒を形成するために、しっかりとその長軸に沿ってチーズクロスをロールバックします。 </li><li>アルミホイルにチーズクロス綿棒をオートクレーブカセットオートクレーブしないでください。 10％の家庭用漂白剤で30分間、それを浸すことによってカセットを除染し、チオ硫酸ナトリウム五水和物（のNa 2 S 2 O 3·5H 2 O）溶液（50ミリグラム/ Lで15分間カセットを浸漬することにより残留塩素を非アクティブ滅菌水で調製）。 </li><li> MMSのカセットに綿棒を挿入します。 NOTE：MMSカセットの非使い捨て版が使用される場合、チーズクロス私の4プライシートで始まる80×22センチasuring、40×11 cmのそれを折ると、約11センチ、直径6cmの円筒を形成するためにそれをロールバックします。 </li><li> MMSを組み立てます。 </li><li>チューブが完全に差込口に付着して確保すること、MMSの両側の差込口にビニールチューブを取り付け、蠕動ポンプにチューブを固定します。蠕動ポンプの上流チューブはサンプリングに十分な長さであることを確認してください。 </li></ol></li><li>細菌の濃度<ol><li>サンプルを高速で蠕動ポンプを実行することにより、農業用水の少なくとも10 L。 </li><li>サンプリングが完了した後、水試料から蠕動ポンプ入口を撤回ず、排水が、MMSを終了観察されなくなるまでポンプを実行し続ける。 </li><li>マニホールドが同時にいくつかのサンプルを実行するために使用されている場合は、各MMSの流出物を収集し、10 Lは、単一のMMSを介して濾過されたときには、その特定のMMS用のバルブを閉じて、ポンプを稼働し続ける。 <ol><li>私のサンプリング時完成したS、、農業用水からの蠕動ポンプ入口を撤回マニホールドのすべてのバルブを開いて、何流出水がMMSSを終了観察されなくなるまでポンプを実行し続ける。 </li></ol></li></ol></li><li>濃度はすべてのMMSS終了したときに、慎重にMMSのスピゴットからビニールチューブを除去し、MMSの両側にスピゴットキャップ。しっかりと蓋をMMSは、濃縮メディアを追加する前に、最大12時間保存することができます。 </li></ol> 2。、MMSの濃縮およびサンプル調製<ol><li>充実<ol><li> MMSの蓋を外して、無菌的に適切な無菌の濃縮ブイヨンの20ミリリットルを追加します。 1 MMSは、それぞれの選択的濃縮のために使用してください。あるいは、同じ試料中のすべての3つの標的細菌を増殖させる非選択的濃縮を行う。 注：MMSカセットの非使い捨てのバージョンを使用する場合は、無菌的にカセットからチーズクロスフィルタを削除し、広告の前に、滅菌袋に置く適切な濃縮メディアの丁225ミリリットル。 <ol><li> Eの濃縮のための大腸菌 、バンコマイシン塩酸塩の8 mg / Lの補充したバッファリングされたペプトン水（BPW）の20ミリリットルを追加します。 </li><li> サルモネラ属菌の濃縮のために。、BPWの20ミリリットルを追加サルモネラサプリメント （4ミリリットル/ L）を補充した。 </li><li> Lの濃縮のためのリステリア 、VIDAS UPリステリア（LPT）ブロス20ミリリットルを追加。 </li><li>シングルMMSを使用して、すべての3の微生物同時非選択的濃縮のために、ユニバーサルpreenrichmentブロス（UPB）を使用します。 </li></ol></li><li>背中緊密にMMSの蓋をネジ止めします。差込口がしっかり濃縮の際に流出し、汚染の可能性を避けるために蓋をしていることを確認します。 </li><li> 200 rpmで振とう培養器で最大18〜24時間のMMSをインキュベートする。 E. 42℃を使用する大腸菌やサルモネラ属。選択的濃縮度。 L·30℃を使用するリステリア選択増、そして37＆＃を使用176、非選択的濃縮のためのC。 </li></ol></li><li>試料調製<ol><li>インキュベーションが完了したときに、差込口のいずれかを暴露する、インキュベーターからMMSを削除してから、静かに1.5mlのマイクロチューブに約0.5mlを分注する。別の方法として、外で一晩濃縮の0.5ミリリットルを、MMSやピペットを外します。 NOTE：MMSカセットの使い捨てではないバージョンが使用される場合、バッグから富化を0.5mlをピペット。 </li><li> Eの比色分析のための大腸菌選択的濃縮、または非選択的濃縮度を分析するための、5 ​​Wでの濃縮の0.5ミリリットル音波処理、プローブソニケータを使用して20秒22 kHzの。 </li></ol></li></ol> μPADs3。準備比色基質の埋め込み<ol><li>試験した各サンプルおよびターゲットのための十分なμPADsを準備します。 E.を検出するために大腸菌、サルモネラ属菌のため、CPRGとX-GlucをμPADsを準備。検出は、MCμPADsを作成し、L.のためのmonocytogenes検出は、X型InPμPADsを準備します。 <ol><li>比色基質についてHEPES緩衝液[0.1％ウシ血清アルブミン（BSA）と0.1 M HEPES]を調製し、使用されようとしている基板に記載の緩衝液のpHを調整してpH 7.5 CPRG又はX-Glucを調製するための、 MCのためのpH 9、及びX-InPのためのpH 7。 </li><li> pHの基質のストック溶液を準備します3 MM（CPRG）、62.5ミリメートル（X-Glucを）、15 MM（MC）、100ミリ（X-INP）の濃度でHEPES緩衝液を調整した。光からストック溶液を保護します。 </li><li>その後、各基板原液24μlのμPADマイクロスポットを埋め込む、無菌ペトリ皿の内側μPADsを置きます。 </li></ol></li></ol> 4。検出とデータ解析<ol><li>検出<ol><li>シャーレに含まれる各適切なμPADマイクロスポットに濃縮されたサンプルの6を添加する。 </li><li>ペトリ皿のカバーを背面に配置し、パラフィルムでそれを封印。 </li><li>サンプルをインキュベートマイクロスポットの発色と乾燥を可能にするために、最大3時間、37℃でμPADと。 </li></ol></li><li>結果の目視検査<ol><li> μPADsの色の変化の簡単な目視検査により検出を行う。 注：通常、決定的な色の変化をもたらす強力な反応をさらに明確化の必要性を回避する必要があり、陽性とみなされるべきである濃縮の18〜24時間後には、次の期待されている。 </li><li> Eの存在を決定赤紫色や青緑、無色からのX-Glucを変更して埋め込 ​​まれたマイクロスポットが黄色からCPRG変更に埋め込 ​​まマイクロスポットを観察することによって大腸菌陽性サンプル。 </li><li> Lの存在を決定インディゴ無色からのX-InPの変化に埋め込 ​​まマイクロスポットを観察することによってリステリア陽性サンプル。 </li><li> サルモネラの存在を決定する。 COLから、MCの変更に埋め込まマイクロスポットを観察することによって、正のサンプル紫藤色にorless。 </li></ol></li><li>ソフトウェア支援データ解析 NOTE：明らかに弱い反応が陽性または陰性であるかどうかを決定するために、結果の半定量分析を可能にするために実施。 <ol><li> μPADsは、完全に乾燥できます。 </li><li>フラットベッドスキャナを使用してμPADをスキャンします。 </li><li>画像を処理するためにImageJソフトウェアを使用してください。 <ol><li>メインメニュー（または[「CLT + O」）の「ファイル」タブの下にあるImageJの中で、分析されるスキャンした画像を「OPEN」。 </li><li> （「CLT + +の私Shiftキー」を押すか）、メインメニューの「編集」タブの下にある「反転」を選択画像を反転します。 </li><li>メインメニューの「分析」タブを使用して分析した報告された測定値を選択する」に設定し測定を...」を選択します。 </li><li> 「平均グレイ強度」、「しきい値に制限」、および「表示ラベル」ボックスがあることを確認してくださいチェックし、Enterキーを押して「OK」これは、ソフトウェアが選択した各領域を分析し、どのように設定して、どのようにそれを報告します。 </li><li>あなたは内に測定したい領域の概要を説明し、円を描くように「楕円」ツールを使用します。 </li><li> 「分析」タブで「測定」（またはキーを押し「CLT + M &quot;）を選択します。ソフトウェアが定義された領域内で平均グレイ強度を測定し、コピーして、更なる分析のために、Excelに貼り付けることができ、ポップアップ画面でそれを報告します。 注：より正確な分析のために、各試料の少なくとも二つの技術的反復を実行する必要がある。 </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guidance for industry: Guide to minimize microbial food safety hazards for fresh fruits and vegetables. , (1998).</li><li>Bisha, B., P&#233;rez-M&#233;ndez, A., Danyluk, M. D., Goodridge, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Modified+Moore+swabs+and+continuous+flow+centrifugation+for+concentration+of+Salmonella+and+Escherichia+coli+O157:H7+from+large+volumes+of+water).">Evaluation of Modified Moore swabs and continuous flow centrifugation for concentration of Salmonella and Escherichia coli O157:H7 from large volumes of water).</a> J Food Prot. 74, 1934-1937 (2011).</li><li>Sbodio, A., Maeda, S., Lopez-Velasco, G., Suslow, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+Moore+swab+optimization+and+validation+in+capturing+E.+coli+O157:H7+and+Salmonella+enterica+in+large+volume+field+samples+of+irrigation+water.">Modified Moore swab optimization and validation in capturing E. coli O157:H7 and Salmonella enterica in large volume field samples of irrigation water.</a> Food Res Int. 51, 654-662 (2013).</li><li>McEgan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Salmonella+spp.+from+large+volumes+of+water+by+modified+Moore+swabs+and+tangential+flow+filtration.">Detection of Salmonella spp. from large volumes of water by modified Moore swabs and tangential flow filtration.</a> Lett Appl Microbiol. 56, 88-94 (2013).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Solicitation Number: FDA-SS-1116253. , (2013).</li><li>Jokerst, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+paper-based+analytical+device+for+colorimetric+detection+of+select+foodborne+pathogens.">Development of a paper-based analytical device for colorimetric detection of select foodborne pathogens.</a> Analytical Chemistry. 84, 2900-2907 (1021).</li><li>Martinez, A. W., Phillips, S. T., Butte, M. J., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterned+paper+as+a+platform+for+inexpensive,+low-volume,+portable+bioassays.">Patterned paper as a platform for inexpensive, low-volume, portable bioassays.</a> Angew Chem Int Edit. 46, 1318-1320 (2007).</li><li>Martinez, A. W., Phillips, S. T., Wiley, B. J., Gupta, M., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FLASH:+A+rapid+method+for+prototyping+paper-based+microfluidic+devices.">FLASH: A rapid method for prototyping paper-based microfluidic devices.</a> Lab on a Chip. 8, 2146-2150 (1039).</li><li>Abe, K., Suzuki, K., Citterio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inkjet-printed+microfluidic+multianalyte+chemical+sensing+paper.">Inkjet-printed microfluidic multianalyte chemical sensing paper.</a> Analytical Chemistry. 80, 6928-6934 (1021).</li><li>Cheng, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millimeter-scale+contact+printing+of+aqueous+solutions+using+a+stamp+made+out+of+paper+and+tape.">Millimeter-scale contact printing of aqueous solutions using a stamp made out of paper and tape.</a> Lab on a Chip. 10, 3201-3205 (1039).</li><li>Lu, Y., Shi, W. W., Jiang, L., Qin, J. H., Lin, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+prototyping+of+paper-based+microfluidics+with+wax+for+low-cost,+portable+bioassay.">Rapid prototyping of paper-based microfluidics with wax for low-cost, portable bioassay.</a> Electrophoresis. 30, 1497-1500 (2009).</li><li>Charles, S., Henry, L. D. G., Jana, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jokerst+Rapid+detection+of+pathogens+using+paper+devices.">Jokerst Rapid detection of pathogens using paper devices.</a> US patent. , (2012).</li><li>Bisha, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T10-06+Colorimetric+paper-based+detection+of+Salmonella+spp.+and+Escherichia+coli+from+artificially+contaminated+irrigation+river+water.">T10-06 Colorimetric paper-based detection of Salmonella spp. and Escherichia coli from artificially contaminated irrigation river water.</a> , (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

このプロトコルは、 大腸菌を検出するための統合された方法を説明します大腸菌 、 サルモネラ属、およびL.農業用水におけるリステリア 。ここで、農業用水の大量からの細菌のMMS濃度（10 L）は、細菌の濃縮、およびμPADsを用いて細菌を示す比色検出に連結されている。細菌を10倍に濃縮しながら、MMS手順は水試料中の微粒子高含有コンテンツに対応できる?...

これは、食品媒介疾患剤は、食品媒介疾患の負担を軽減するために、フィールドベースの設定で迅速に、好ましくは検出されることが重要である。食中毒細菌の病原体を検出するための一般的な戦略は、生化学的プロファイリング、選択的かつ差動培養、免疫学的分離と検出、分子検出があります。しかしながら、これらの方法は、散発的な汚染によって妨げ小さなサンプルサイズは、試験された、食品媒介病原菌の多くの場合、低濃度、長い処理時間を必要とし、および/またはフィールドの設定に適用可能ではない。さらに、多くの食品マトリックス中の化合物は、検出および診断アプリケーションへの抑制性である。微生物検出の可能性を向上させるために、米国食品医薬品局は、（例えば、洗浄水及び灌漑用水として）農業用水のテストが新鮮な農産物の大きな表面積に接触し又はビヒクルとして機能するいずれかのものであることが示唆されているpについてroduce汚染は、食品1の直接試験に対する実行可能な代替手段です。そうであっても、代表的な農業用水のサンプルの希釈効果と相まって、多くの場合、低い固有の病原体を負担は、病原体濃度のためのサンプル調製法が必要不可欠になります。そのような方法は、水（≥10 L）、適切な病原体濃度、および下流側検出戦略との相溶性を大量にサンプリングが必要となる。 修正されたムーアスワブ（MMS）は、水2-4大量の（≥10リットル）から細菌を濃縮するために使用される、安価でシンプルな、そして堅牢なデバイスです。 MMSは、蠕動ポンプを用いて、カセットを通してポンプ大量の水のための粗いフィルターとして機能し、ガーゼで満たされたプラスチックカセット、から構成されています。 MMSは処理されたリチウム中の微生物を含む有機及び無機微粒子を捕捉し細菌濃度（≥10倍濃度）の非差別的な方法である頭の良いサンプル。それはMMSによる標的微生物の濃度の優れた効力は微生物シルト-粘土画分又は懸濁固体3の有機微小凝集体に結合することが期待されているという事実によって説明できる可能性がある。 MMSの頑丈なデザインは、このようなフィルタの目詰まり、大量に処理することができないこと、高濁度フィルタサンプル、および高コストなどの水からの細菌の捕捉および濃縮のための他の濾過方法に関連するほとんどの欠点を克服することができます。これらの理由のために、FDAは、MMSの、環境および産生に関連するサンプル収集手順5の公式手順に組み込まれることが推奨される。 ここで、この方法は濃度、濃縮、および大腸菌の検出、 サルモネラ属、農業水からのリステリア·モノサイトゲネスに記載されている。 MMSはBACTの濃度で使用されているERIA、また選択的または非選択的細菌濃縮のための容器として機能します。細菌検出は、紙ベースの分析装置（μPADs）6を使用して生化学的に達成される。 μPADs7-11を印刷し 、フォトリソグラフィー、インクジェット印刷、スタンピング、およびワックスを含む種々の方法を用いて流体ネットワークまたはスポット試験として製造することができる。流体設計の例は、サンプルが中心部に堆積され、その後、サンプル又は基板の中心12内に毛管作用によってチャネルの外のリザーバから引き出された遠位リザーバ又は単一のチャネルパターンに流れる樹状チャネルパターンとすることができる。このプロトコルのために、我々はここでテスト微生物の指標酵素で処理可能な発色性基質を用いて埋め込まれた7 mmの直径ワックスペーパースポットアレイに採用することを選択した。クロロフェノールレッド-β-D-ガラク（CPRG）と5 - ブロモ-4 - クロロ-3 - インドリルβ-D-グルクロニド（X-Glucを）E.によって生成β-ガラクトシダーゼ、β-グルクロニダーゼを検出するための大腸菌 ; サルモネラ属によって産生さC8-エステラーゼの検出のための5 -ブロモ-6 -クロロ-3 -インドリルカプリレート（マゼンタカプリル酸）;および5 -ブロモ-4 -クロロ-3 -インドリル-myo-イノシトールリン酸（X型InP）L.により製造ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼC（PI-PLC）の検出のためのリステリア 6。したがって、特定の細菌の存在は、複雑な装置又はデータ解釈を必要とせずに視覚的に観察することができる。これらの特定の標的細菌の酵素ベースの比色μPAD検出の特異性および感度は、以前は06探求されてきた。さらに、これらの標的細菌のための統合濃度検出方法の感度は、微生物の予め決めレベル大量の水を加えることによって評価した（未発表データとビーシャら 13）。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agricultural water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Irrigation water, produce wash water, well water, etc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinyl tubing</td>
			<td>Wilmar</td>
			<td>BN-CVT1005</td>
			<td>&#160;1/4&#34; inner diameter,&#160; 3/8&#34; outer diameter, available at:&#160; http://www.wilmar.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified Moore Swab cartridge&#160;</td>
			<td>Lumiere Diagnostics</td>
			<td></td>
			<td>11 &#189; cm in length and 4 &#189; cm in width, available at:&#160; http://www.lumierediagnostics.com.&#160; Alternativelly, a non-disposable version of the cartridge can be used (refer to the text)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cheesecloth</td>
			<td>Chesapeake Wiper &#38; Supply, Inc.</td>
			<td>CC90</td>
			<td>Grade #90, 44 &#215; 36 weave, available at:&#160; www.raglady.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Household Bleach</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>Sodium hypochlorite concentration approx. 6%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium thiosulphate 5-hydrate</td>
			<td>Mallinckrodt Baker Inc</td>
			<td>8100-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manifold</td>
			<td>Built in-house</td>
			<td></td>
			<td>Optional, device can be constructed from PVC pipes and appropriate fittings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Micron Meters</td>
			<td>RPP1300</td>
			<td>Available at:&#160; http://www.micronmeters.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>Disposable, 10ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal preenrichment broth</td>
			<td>Difco</td>
			<td>223510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffered peptone water</td>
			<td>Difco</td>
			<td>218105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salmonella supplement</td>
			<td>Biom&#233;rieux Industry</td>
			<td>42650</td>
			<td>http://www.biomerieux-usa.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VIDAS UP Listeria (LPT) Broth</td>
			<td>Biom&#233;rieux Industry</td>
			<td>410848</td>
			<td>http://www.biomerieux-usa.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vancomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>861987</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Aid</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>Drummond DP-110 used here</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>Excella E25, New Brunswick Scientific used here</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette&#160;</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>10 &#956;l, 1 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>Barrier, 10 &#956;l, 1 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 microcentrifuge tubes</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>RNase- and DNase- free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe sonicator</td>
			<td>Q Sonica LLC</td>
			<td>XL-2000 series</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;PADs</td>
			<td>Avant&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Wax printed 7 mm diameter circles, with 4 pt line thickness. Contact Dr. Charles Henry for additional information</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES [N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N&#8242;-2-ethanesulfonic acid]</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorophenol red-galactopyranoside (CPRG)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>59767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-&#946;-D-glucuronide (X-Gluc)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B8174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-bromo-6-chloro-3 indolylcaprylate (magenta caprylate)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>53451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Bromo-4-chloro-myo-inositol phosphate (X-InP)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>38896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, polystyrene 100mm by 15 mm</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat bed scanner</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>Xerox USB scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td></td>
			<td>http://rsb.info.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

colorimetric paper-based detection of escherichia coli, salmonella spp., and listeria monocytogenes from large volumes of agricultural water

このプロトコルは、。 大腸菌、サルモネラの迅速な比色検出を説明し、農業の水の大量（10リットル）からのリステリア菌 。ここで、水は、細菌を濃縮するために、プラスチック製のカートリッジに封入単純ゴーズフィルタからなる​​無菌の変形ムーアスワブ（MMS）を介して濾過する。濾過に続いて、標的細菌に対して非選択的または選択的な富化をMMSで行われる。標的細菌の比色検出のために、濃縮度は、その後、細菌指標基質を用いて埋め込まれた紙ベースの分析装置（μPADs）を用いてアッセイする。各基板はμPAD上に視覚的に検出可能な着色生成物（定性的検出）を生成し、標的を示す細菌の酵素と反応する。あるいは、反応しμPADsのデジタル画像は、共通の走査または写真デバイスで生成し、ImageJソフトウェア、アルを用いて分析することができる結果のより客観的かつ標準化された解釈のためlowing。生化学的スクリーニング手順は、上記の細菌病原体を同定するために設計されているが、いくつかのケースでは、背景微生物叢または比色基質の分解によって生成される酵素は、偽陽性を生成することができる。そのため、より多くの差別的な診断を使用して確認が必要となります。それにもかかわらず、この細菌濃度及び検出プラットフォームは、初期スクリーニング法としての使用を正当化する、（濃縮、富化、及び検出は、約24時間以内に行われる）、安価な（0.1 CFU / mlの検出限界）に敏感、実施が容易で、かつ迅速である農業用水の微生物学的品質のために。

このプロトコルに記載のように、MMS（ 図1）を用いて細菌の濃度は、約15〜20分以内に行うことができる。 2つの別個の構成要素でアクリロニトリルブタジエンスチレン（ABS）から構成においてMMS;円筒状のチーズクロススワブが挿入される集積スピゴット体（ 図1A）との両方の蓋とカートリッジ。両成分は、その後、MMS（ 図1B）を形成螺合されている。 MMS...

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Colorimetric Paper-based Detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from Large Volumes of Agricultural Water

A protocol involving integrated concentration, enrichment, and end-point colorimetric detection of foodborne pathogens in large volumes of agricultural water is presented here. Water is filtered through Modified Moore Swabs (MMS), enriched with selective or non-selective media, and detection is performed using paper-based analytical devices (&#181;PAD) imbedded with bacterial-indicative colorimetric substrates.

比色検出の紙ベース<em&gt;エシェリヒア·コリ</em&gt;<em&gt;サルモネラ</em&gt;属、および<em&gt;リステリア菌</em&gt;農業大量の水から

This protocol describes rapid colorimetric detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from large volumes (10 L) of ...

colorimetric-paper-based-detection-escherichia-coli-salmonella-spp

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Colorimetric Paper-based Detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from Large Volumes of Agricultural Water

14.3K ビュー.  University of Wyoming. A protocol involving integrated concentration, enrichment, and end-point colorimetric detection of foodborne pathogens in large volumes of agricultural water is presented here. Water is filtered through Modified Moore Swabs (MMS), enriched with selective or non-selective media, and detection is performed using paper-based analytical devices (µPAD) imbedded with bacterial-indicative colorimetric substrates.

ビデオ: Colorimetric Paper-based Detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from Large Volumes of Agricultural Water

Laboratory-determined Phosphorus Flux from Lake Sediments as a Measure of Internal Phosphorus Loading

Eutrophication is a water quality issue in lakes worldwide, and there is a critical need to identify and control nutrient sources. Internal phosphorus (P) loading from lake sediments can account for a substantial portion of the total P load in eutrophic, and some mesotrophic, lakes. Laboratory determination of P release rates from sediment cores is one approach for determining the role of internal P loading and guiding management decisions. Two principal alternatives to experimental determination of sediment P release exist for estimating internal load: in situ measurements of changes in hypolimnetic P over time and P mass balance. The experimental approach using laboratory-based sediment incubations to quantify internal P load is a direct method, making it a valuable tool for lake management and restoration.
Laboratory incubations of sediment cores can help determine the relative importance of internal vs. external P loads, as well as be used to answer a variety of lake management and research questions. We illustrate the use of sediment core incubations to assess the effectiveness of an aluminum sulfate (alum) treatment for reducing sediment P release. Other research questions that can be investigated using this approach include the effects of sediment resuspension and bioturbation on P release.
The approach also has limitations. Assumptions must be made with respect to: extrapolating results from sediment cores to the entire lake; deciding over what time periods to measure nutrient release; and addressing possible core tube artifacts. A comprehensive dissolved oxygen monitoring strategy to assess temporal and spatial redox status in the lake provides greater confidence in annual P loads estimated from sediment core incubations.

Lake eutrophication is a water quality issue worldwide, making the need to identify and control nutrient sources critical. Laboratory determination of phosphorus release rates from sediment cores is a valuable approach for determining the role of internal phosphorus loading and guiding management decisions.

内部リン負荷の尺度として湖堆積物の研究室に決定されたリンフラックス

Eutrophication is a water quality issue in lakes worldwide, and there is a critical need to identify and control nutrient sources. Internal phosphorus (P) ...

環境学

Measurement of Greenhouse Gas Flux from Agricultural Soils Using Static Chambers

Measurement of greenhouse gas (GHG) fluxes between the soil and the atmosphere, in both managed and unmanaged ecosystems, is critical to understanding the biogeochemical drivers of climate change and to the development and evaluation of GHG mitigation strategies based on modulation of landscape management practices. The static chamber-based method described here is based on trapping gases emitted from the soil surface within a chamber and collecting samples from the chamber headspace at regular intervals for analysis by gas chromatography. Change in gas concentration over time is used to calculate flux. This method can be utilized to measure landscape-based flux of carbon dioxide, nitrous oxide, and methane, and to estimate differences between treatments or explore system dynamics over seasons or years. Infrastructure requirements are modest, but a comprehensive experimental design is essential. This method is easily deployed in the field, conforms to established guidelines, and produces data suitable to large-scale GHG emissions studies.

This article showcases the static chamber-based method for measurement of greenhouse gas flux from soil systems. With relatively modest infrastructure investments, measurements may be obtained from multiple treatments/locations and over timeframes ranging from hours to years.

静的チャンバを用いて農用地の土壌からの温室効果ガスフラックスの測定

Measurement of greenhouse gas (GHG) fluxes between the soil and the atmosphere, in both managed and unmanaged ecosystems, is critical to understanding the ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a standardized method for use in multiple analytical laboratories during monitoring period 3 of the Unregulated Contaminant Monitoring Rule. Herein we present the protocol for extraction of viral ribonucleic acid (RNA) from water sample concentrates and for quantitatively measuring enterovirus and norovirus concentrations using reverse transcription-quantitative PCR (RT-qPCR). Virus concentrations for the molecular assay are calculated in terms of genomic copies of viral RNA per liter based upon a standard curve. The method uses a number of quality controls to increase data quality and to reduce interlaboratory and intralaboratory variation. The method has been evaluated by examining virus recovery from ground and reagent grade waters seeded with poliovirus type 3 and murine norovirus as a surrogate for human noroviruses. Mean poliovirus recoveries were 20% in groundwaters and 44% in reagent grade water. Mean murine norovirus recoveries with the RT-qPCR assay were 30% in groundwaters and 4% in reagent grade water.

Here we present a procedure to quantify enterovirus and norovirus in environmental and drinking waters using reverse transcription-quantitative PCR. Mean virus recovery from groundwater with this standardized procedure from EPA Method 1615 was 20% for poliovirus and 30% for murine norovirus.

エンテロウイルスと文化およびRT-qPCRにより水中のノロウイルス発生のEPAメソッド1615測定。パートIII。 RT-qPCRによりウイルス検出

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a ...

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

This manuscript describes a duplex digital PCR assay (EntHF183 dPCR) for simultaneous quantification of Enterococcus spp. and the human fecal-associated HF183 marker. The EntHF183 duplex dPCR (referred as EntHF183 dPCR hereon) assay uses the same primer and probe sequences as its published individual quantitative PCR (qPCR) counterparts. Likewise, the same water filtration and DNA extraction procedures as performed prior to qPCR are followed prior to running dPCR. However, the duplex dPCR assay has several advantages over the qPCR assays. Most important, the dPCR assay eliminates the need for running a standard curve and hence, the associated bias and variability, by direct quantification of its targets. In addition, while duplexing (i.e. simultaneous quantification) Enterococcus and HF183 in qPCR often leads to severe underestimation of the less abundant target in a sample, dPCR provides consistent quantification of both targets, whether quantified individually or simultaneously in the same reaction. The dPCR assay is also able to tolerate PCR inhibitor concentrations that are one to two orders of magnitude higher than those tolerated by qPCR. These advantages make the EntHF183 dPCR assay particularly attractive because it simultaneously provides accurate and repeatable information on both general and human-associated fecal contamination in environmental waters without the need to run two separate qPCR assays. Despite its advantages over qPCR, the upper quantification limit of the dPCR assay with currently available instrumentation is approximately four orders of magnitude lower than that achievable by qPCR. Consequently, dilution is needed for measurement of high concentrations of target organisms such as those typically observed following sewage spills.

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

This manuscript describes a duplex digital PCR assay that can be used to simultaneously quantify Enterococcus spp. and the HF183 genetic markers as indicators of general and human-associated fecal contamination in recreational waters.

の同時定量のための二重デジタルPCRアッセイ<em&gt;エンテロコッカス属。</em&gt;およびWatersにおけるヒトの糞便関連HF183マーカー

This manuscript describes a duplex digital PCR assay (EntHF183 dPCR) for simultaneous quantification of Enterococcus spp. and the human fecal-associated ...

Characterization and Application of Passive Samplers for Monitoring of Pesticides in Water

Five different water passive samplers were calibrated under laboratory conditions for measurement of 124 legacy and current used pesticides. This study provides a protocol for the passive sampler preparation, calibration, extraction method and instrumental analysis. Sampling rates (RS) and passive sampler-water partition coefficients (KPW) were calculated for silicone rubber, polar organic chemical integrative sampler POCIS-A, POCIS-B, SDB-RPS and C18 disk. The uptake of the selected compounds depended on their physicochemical properties, i.e., silicone rubber showed a better uptake for more hydrophobic compounds (log octanol-water partition coefficient (KOW) &#62; 5.3), whereas POCIS-A, POCIS-B and SDB-RPS disk were more suitable for hydrophilic compounds (log KOW &#60; 0.70).

A protocol about the characterization and application of five different passive sampling devices is presented.

水中の農薬のモニタリングのための特性とパッシブサンプラーの応用

Five different water passive samplers were calibrated under laboratory conditions for measurement of 124 legacy and current used pesticides. This study ...

Continuous Instream Monitoring of Nutrients and Sediment in Agricultural Watersheds

Pollutant concentrations and loads in watersheds vary considerably with time and space. Accurate and timely information on the magnitude of pollutants in water resources is a prerequisite for understanding the drivers of the pollutant loads and for making informed water resource management decisions. The commonly used &#34;grab sampling&#34; method provides the concentrations of pollutants at the time of sampling (i.e., a snapshot concentration) and may under- or overpredict the pollutant concentrations and loads. Continuous monitoring of nutrients and sediment has recently received more attention due to advances in computing, sensing technology, and storage devices. This protocol demonstrates the use of sensors, sondes, and instrumentation to continuously monitor in situ nitrate, ammonium, turbidity, pH, conductivity, temperature, and dissolved oxygen (DO) and to calculate the loads from two streams (ditches) in two agricultural watersheds. With the proper calibration, maintenance, and operation of sensors and sondes, good water quality data can be obtained by overcoming challenging conditions such as fouling and debris buildup. The method can also be used in watersheds of various sizes and characterized by agricultural, forested, and/or urban land.

With the advancement of technology and the rise in end-user expectations, the need and use of higher temporal resolution data for pollutant load estimation has increased. This protocol describes a method for continuous in situ water quality monitoring to obtain higher temporal resolution data for informed water resource management decisions.

連続インストリームの栄養素と農業生態系流域における堆積物の監視

Pollutant concentrations and loads in watersheds vary considerably with time and space. Accurate and timely information on the magnitude of pollutants in ...

Measuring and Mapping Patterns of Soil Erosion and Deposition Related to Soil Carbonate Concentrations Under Agricultural Management

Spatial patterns of soil erosion and deposition can be inferred from differences in ground elevation mapped at appropriate time increments. Such changes in elevation are related to changes in near-surface soil carbonate (CaCO3) profiles. The objective is to describe a simple conceptual model and detailed protocol for repeatable field and laboratory measurements of these quantities. Here, accurate elevation is measured using a ground-based differential global positioning system (GPS); other data acquisition methods could be applied to the same basic method. Soil samples are collected from prescribed depth intervals and analyzed in the lab using an efficient and precise modified pressure-calcimeter method for quantitative analysis of inorganic carbon concentration. Standard statistical methods are applied to point data, and representative results show significant correlations between changes in soil surface layer CaCO3 and changes in elevation consistent with the conceptual model; CaCO3 generally decreased in depositional areas and increased in erosional areas. Maps are derived from point measurements of elevation and soil CaCO3 to aid analyses. A map of erosional and depositional patterns at the study site, a rain-fed winter wheat field cropped in alternating wheat-fallow strips, shows the interacting effects of water and wind erosion affected by management and topography. Alternative sampling methods and depth intervals are discussed and recommended for future work relating soil erosion and deposition to soil CaCO3.

Spatial patterns of soil erosion and deposition can be inferred from differences in ground elevation mapped at appropriate time increments. Such changes in elevation are related to changes in near-surface soil carbonates. Repeatable methods for field and laboratory measurements of these quantities and data analysis methods are described here.

測定と土壌侵食と堆積土炭酸濃度農業経営に関連のパターンのマッピング

Spatial patterns of soil erosion and deposition can be inferred from differences in ground elevation mapped at appropriate time increments. Such changes ...

Capturing Flow-weighted Water and Suspended Particulates from Agricultural Canals During Drainage Events

The purpose of this study is to describe the methods used to capture flow-weighted water and suspended particulates from farm canals during drainage discharge events. Farm canals can be enriched by nutrients such as phosphorus (P) that are susceptible to transport. Phosphorus in the form of suspended particulates can significantly contribute to the overall P loads in drainage water. A settling tank experiment was conducted to capture suspended particulates during discrete drainage events. Farm canal discharge water was collected in a series of two 200 L settling tanks over the entire duration of the drainage event, so as to represent a composite subsample of the water being discharged. Imhoff settling cones are ultimately used to settle out the suspended particulates. This is achieved by siphoning water from the settling tanks via the cones. The particulates are then collected for physico-chemical analyses.

Nutrients present in particulate form can contribute significantly to the overall loads in agricultural drainage waters. This study describes a novel method to capture flow-weighted water and suspended particulates from farm canal drainage over the entire duration of the drainage event.

排水のイベント中に水の流れ加重と農業用水路から浮遊微粒子をキャプチャ

The purpose of this study is to describe the methods used to capture flow-weighted water and suspended particulates from farm canals during drainage ...

Continuous Hydrologic and Water Quality Monitoring of Vernal Ponds

Vernal ponds, also referred to as vernal pools, provide critical ecosystem services and habitat for a variety of threatened and endangered species. However, they are vulnerable parts of the landscapes that are often poorly understood and understudied. Land use and management practices, as well as climate change are thought to be a contribution to the global amphibian decline. However, more research is needed to understand the extent of these impacts. Here, we present methodology for characterizing a vernal pond's morphology and detail a monitoring station that can be used to collect water quantity and quality data over the duration of a vernal pond's hydroperiod. We provide methodology for how to conduct field surveys to characterize the morphology and develop stage-storage curves for a vernal pond. Additionally, we provide methodology for monitoring the water level, temperature, pH, oxidation-reduction potential, dissolved oxygen, and electrical conductivity of water in a vernal pond, as well as monitoring rainfall data. This information can be used to better quantify the ecosystem services that vernal ponds provide and the impacts of anthropogenic activities on their ability to provide these services.

Understanding the ecosystem services and processes provided by vernal ponds and the impacts of anthropogenic activities on their ability to provide these services requires intensive hydrologic monitoring. This sampling protocol using in-situ monitoring equipment was developed to understand the impact of anthropogenic activities on water levels and quality.

連続的な水文水質ヴァーナル池のモニタリングと

Vernal ponds, also referred to as vernal pools, provide critical ecosystem services and habitat for a variety of threatened and endangered species. ...

Specific and Accurate Detection of the Citrus Greening Pathogen Candidatus liberibacter spp. Using Conventional PCR on Citrus Leaf Tissue Samples

Citrus greening, also known as huanglongbing, is a destructive citrus disease ravaging citrus farms globally. This disease causes asymmetrical yellow leaf mottling, vein yellowing, defoliation, root decay, and ultimately, the death of the citrus plant. When infected, the citrus plants have stunted growth and produce flowers out of season. These flowers rarely yield fruit, and those that do yield small, bitter, irregularly shaped citrus fruit that are not desirable. This disease is spread by the Asian citrus psyllid, Diaphorina citri, and by the grafting of infected citrus tissue. The pathogen has a long and variable incubation period within the citrus plant&#8212;sometimes years, before symptoms appear. Attempts to culture this pathogen in vitro have been unsuccessful, possibly due to the low and uneven concentration of the pathogen within infected citrus tissue, or because it is difficult to replicate the environmental conditions conducive to growth of the pathogen. It is very difficult to identify the disease before it has spread, due to its long incubation period and researchers&#39; inability to culture the pathogen. As a result, the disease only becomes apparent after suddenly destroying a citrus farmer&#39;s entire yield. Presented here is a method for the accurate and specific detection of the citrus greening pathogen, Candidatus liberibacter spp. using a genomic DNA extraction kit and PCR. This method is simple, efficient, cost effective, and adaptable for quantitative analysis. This method can be adapted for use on any citrus tissue; however, it is potentially limited by the amount of pathogen present in the tissue. Nevertheless, this method will allow citrus farmers to identify infected citrus plants earlier, and curb the spread of this destructive disease before it can further spread.

Specific and Accurate Detection of the Citrus Greening Pathogen Candidatus liberibacter  spp. Using Conventional PCR on Citrus Leaf Tissue Samples

Citrus Greening is a particularly destructive disease affecting citrus crops globally. Presented here is a simple method using PCR and genomic DNA extraction of citrus leaf tissue for the accurate and precise identification of the citrus greening pathogen, Candidatus liberibacter spp.

特定病原体緑化シトラスカンキツグリーニング病病原細菌属カンキツ葉組織サンプルで使用した従来の PCR の正確な検出

Citrus greening, also known as huanglongbing, is a destructive citrus disease ravaging citrus farms globally. This disease causes asymmetrical yellow leaf ...