資金調達：米国陸軍の医学研究および資材コマンド（USAMRMC）と遠隔医療·先端技術研究センターが管理する。 Shunxi智は、ここで説明したように注射器の変更を貢献した。

1。システムのセットアップシステムは、単段ミキサー、インライン高剪断ホモジナイザー、HCT、ホモジナイザーとの間に流体を移動させるローラーポンプ、および熱交換器（図1）を取り付け、保持タンクを濃縮（HCT）からなる。 <ol><li>一段ミキサーの下に2ベースポートと3側面ポートを装備滅菌、広口4リットルのガラス回収容器を置きます。容器の口にミキサーヘッドを下げて（ヘッドスペースを汚染する周囲の空気を防ぐために）ゴム製のシールやテープを使用して気密フィットを保証します。 </li><li>無菌3月8日とHCTの（図1、ポート＃1）ベースポートのいずれかに合わせて」（ID）をクリアチューブ、およそ10 &quot;長い、濃縮エマルジ ​​ョンの収集のための先端の3方活栓を装備。 </li><li>無菌3/8 &quot;（ID）のチューブで二塁ポート（図1、ポート＃2）を取り付け、approximatel長さY 36 &quot;。ローラーポンプを介して、このチューブを通します。 2ポートを含むTピースと高せん断ホモジナイザーの入口にフィットし、次のように接続し、ローラーポンプを介して、ポート＃2からチューブを接続し、Tピースの側ポートに接続します。低流量酸素ガス流量計を用いて酸素タンクに他のポートを接続します。 </li><li> 4℃に維持し、インライン熱交換器の入口ポートに高剪断ホモジナイザーの出口ポートを接続閉ループシステムを作成、HCT（図1、ポート＃3）の戻り口に熱交換器の出口ポートを接続する。 </li><li> HCT（図1、ポート＃4）に（流量計を経由して）酸素タンクを取り付けます。 HCTの上部ポート（図1、ポート＃5）の大気に開放されているガス組成計を取り付けます。 </li><li>無菌性が望まれる場合には、オートクレーブによる各使用の前にガラスと金属成分を滅菌する。配管部品やプラスチックのCOを殺菌各使用前に、エチレンオキシドによるnnectors。生成物はインビボで試験される場合、これは特に重要である。 </li></ol> 2。のLOM製造<ol><li> GMP 1,2 -ジステアロイル-sn-グリセロ-3 -ホスホコリン（DSPC）およびHCTの基部におけるコレステロール10gを20gのを置く。水相に可能な限り多くの脂質を統合し、1分間、HCT、手撹拌するプラズマLyte Aの1リットルを追加します。 </li><li>ミキサー全体ヘッドは水相で覆われていることを確認して、水相中に一段階ミキサーを下げます。 HCTの上部は気密（上記の手順1.1を参照）、全くのオープンサイドポートがないことであることを確認してください。ポート＃4に取り付けられたガス源をオンにして、HCTのヘッドスペースの酸素分率が&gt; 95％に達するまで待ちます。 10リットル/分（LPM）で、これは約10分を取る必要があります。 </li><li>単段ミキサーを用いて、5,000 rpmで5分間、前駆体エマルションを混合する。得られた混合物を淡い白で表示し、目に見えるLIPIが含まれているべきではないD塊。混合した後、未使用の脂質 - 水混合物は、単回使用の前に最大30日間4℃で保存することができる。 </li><li>総理1.3 LPMでのローラーポンプをオンにして前駆体エマルション全体閉ループシステム。システムが準備されると、1.3 LPMでオンポンプを保つ。 </li><li>のLOMの製造を開始するには、7,500 rpmまでのインライン高剪断ホモジナイザーをオンにします。その直後に、0.5 LPMでのホモジナイザーの入口部への酸素の流れをオンにします。 3,500 rpmで上（HCT）で一段階ミキサーを保管してください。のLOMは、インラインホモジナイザー（図2）内のロータブレード及びemulsor画面の界面に形成されている。数分以内に、流体が目に見えてより粘性になる必要があります。より厳密な手法は、製造中に、ポート1からのアリコートを除去し、粘度計を用いて分析することによって行うことができる時間の関数としての粘度を決定することである。 注：目に見える気泡はミキサーを出るチューブ中に存在する場合、酸素インライン·ホモジナイザーへの流れが高すぎる。流体は不透明であり、目に見える気泡を含まないまでガス流を下滴定する。 </li><li> 15分間のシステムを実行してから、それに高剪断ホモジナイザーおよび酸素注入をオフにしてください。エマルジョンが除去されるまで、HCT単段ミキサーを実行し続ける。これは相分離を軽減し、HCT内で比較的均一な製品を保持します。 注意：ガス充填エマルジョンの量は、シリアル濃度段階の間に約2〜3倍に増やす必要があります。そうでない場合は、その酸素が高剪断ホモジナイザーに流入され、前駆体エマルションでその脂質濃度が正しいことを確認してください。脂質濃度が低下すると生産効率が低下する。 </li></ol> 3。コレクション、集中、評価、およびのLOMのストレージ<ol><li>無菌を取り付け、収集容器上のベースポート＃1に装着活栓に140ミリリットルルアーロックシリンジを変更しました。 10を策定流体の0ミリリットル。すべての流体が除去されるまでしっかりとシリンジを繰り返し、キャップ。 <ol><li>注射器への空気の100ミリリットルを引き出す、次に140ミリリットルマークの上に余分なプランジャーとシリンジ材を切り鋸で注射器を変更します。プランジ​​ャーを策定する歯付き鉗子を使用して記入し、空の注射器。この変更は、簡単に遠心分離することができます。 </li></ol></li><li>エンドキャップ付き遠心シリンジは10分間225×gで冷蔵（4℃）バケット遠心機で下向き。 </li><li>材料の3つの層は、遠心分離後に表示されます。過剰曇っ水相の最下層を追放して捨てる。第二層は明るい白で、集中のLOMが含まれています。雰囲気ガスの汚染を防止するために三方活栓を用いて、ガス不透過性のシリンジに濃縮された泡を移す。破裂したのLOMから遊離酸素ガスを含む最終的な層を捨てる。 </li><li>泡質濃縮泡の≥90％のガスに達することによって評価することができる。カルキユル次のようにガス濃度を食べた。 体積％のガス= [（発泡体重/泡体積） - 1]×100 <ol><li>粒径が予想範囲内である場合に、第2の品質管理として、光掩蔽によるサイズのマイクロバブルを決定する。これは、均質化時間または処方の変化が気泡のサイズを変化させる可能性があることに留意すべきである。 </li></ol></li><li>しっかりとルアーロックフィッティングでガラスシリンジにキャップ。集中のLOMは、使用時にプラズマLyte Aで希釈することができる。注射器は22、4で保存するか、あるいは可能な-20℃º;より低い温度は、強化された貯蔵寿命安定性7を提供することがあります。 </li></ol>

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著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

濃縮性の高い酸素化のLOMを作成する最も重要なステップは次のとおりです。1）HCT内のヘッドスペースが十分に酸素化されたままであることを確実にする。 2）脂質賦形剤の純度は（）貯蔵条件およびGMP製品の使用を含む最適であることを保証する; 3）粉末の脂質は、システムをプライミングする前に、水相と完全に混ぜることを保証する; 4）ガスの体積分率が70％を超えないことを確実にす?...

タンパク質、ポリマー、および脂質のシェルからなるマイクロバブルは、薬物送達のためのベクター、遺伝子治療、および超音波造影剤1-5として開発されている。これらの治療的使用は、血管内マイクロバブル持続性を必要とするので、このようなマイクロバブルは、一般に、血液中の低い溶解性を有し、気泡を安定化させる3,4パーフルオロカーボン6のような不活性、高分子量のガスが充填されている。 最近では、脂質ベースの酸素マイクロバブル（のLOM）は、末端器官の酸素供給を維持し、気道閉塞や低酸素血症7の期間中に血行動態不安定性を防ぐことができる酸素の治療用量を提供するように設計されています。静脈内のガス送達のために設計されたエマルジョンは、超音波造影剤または標的化薬物送達のために使用されるものとは異なる設計上の特徴を必要とする。本体は、酸素ガス（〜200ml /分）を大量に消費するため、まず、のLOMを製造する必要があり、大規模に注入された。これにより、製造プロセスが効率的である必要があります。第二に、製造プロセスは、周囲空気に（100％酸素で充填されたい）のLOMの露光を通して窒素汚染を回避するために閉ループであるべきである。のLOMの目的は、静脈内のガス送達であるので第三に、のLOMのガス留分は、エマルジ ​​ョンの粘度7による制限を認識し、最大化されるべきである。最後に、すべての静脈内注射用と同様に、粒径分布の正確な制御は、微小血管障害物08を回避するために不可欠である。 マイクロバブルの製造のためのいくつかの確立された方法がある。超音波処理は、高い強度を利用し、低周波の超音波は、マイクロバブル7,9を生成するためのガスヘッドスペースの存在下では、このような両親媒性リン脂質のような界面活性剤を含むエマルジ ​​ョンの空気-流体界面に適用した。このプロセスは、超変えることによって制御可能である超音波処理はほとんど臨床的に使用されるマイクロバブルの製造に使用されていないものの、音の周波数、パワー、パルス持続時間、得られた粒度分布は、特定のサイズ分布のマイクロバブルを生成するように調整することができる。合併は、大量の2に対応するためにスケールアップすることも困難である、密閉系、中の界面活性剤やガスの激しい機械的攪拌である。液滴ベースのマイクロ流体は、マイクロバブルの粒度分布10月13日の正確な制御が可能になります。伝統的に困難なスケールアップするものの、多チャンネルの高速マイクロフルイディクスは、マイクロバブル生産効率を高める13が記載されている。これらの方法のいずれかを用いて製造されたマイクロバブルは、遠心分画14,15及びマイクロバブル浮遊選鉱16,17として製造後小型化プロセスを必要とし得る。 非常に安定したマイクロバブルの製造のための別の確立された方法は、せん断homogenizですマイクロバブルの表面18上の安定六角形のリン脂質パターンになることができますATION 6、。この概念を踏まえ、我々は自己組織化のLOM 19を作成するために、インライン高剪断ホモジナイザーの組み込みについて説明します。このプロセスでは、ホモジナイザが急速にマイクロバブルを作成するための高い機械と油圧剪断を作成する、デュアル細かいメッシュemulsorスクリーンに近接して回転ブレード利用する。このシステムを介して脂肪乳剤のシリアル濃度はさらに遠心分離によって濃縮することができ、ますます濃厚ガス留分を、得られます。

<table><tbody><tr><td>1,2-distearoyl-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-glycero-3-phosphocholine (DSPC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>770365</td><td>Alternate product: non-GMP from NOF America (Coatsome MC-8080)</td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C75209</td><td></td></tr><tr><td>Plasma-Lyte A</td><td>VWR</td><td>80089-818</td><td>Alternatively can use NaCl</td></tr><tr><td>Glass collection vessel</td><td>Specialty Glass, Inc.</td><td>Custom</td><td>Contact: Pam Zurbrick - 281-595-2210</td></tr><tr><td>Gas composition (oxygen) monitor</td><td>Precision Medical</td><td>PM5900L</td><td></td></tr><tr><td>Sarns 8000 roller pump</td><td>Calicut Medical</td><td>16407</td><td>Part of a modular perfusion system</td></tr><tr><td>BIOtherm Heat Exchanger</td><td>Medtronic</td><td>ECMOtherm-II</td><td></td></tr><tr><td>Verso laboratory in-line mixer</td><td>Silverson Machines, Inc</td><td>TH-IL-102-VERSO</td><td>Use multistage workheads and front-end extension with T piece</td></tr><tr><td>T-piece for Silverson Verso inlet port</td><td>Process Innovations</td><td>Custom</td><td>Contact: Brian Leavitt - 508-423-2266</td></tr><tr><td>L5M-A laboratory mixer</td><td>Silverson Machines, Inc</td><td>NC0136483</td><td>Use mesh emulsor screen (fine)</td></tr><tr><td>Rochester-Ochsner toothed forceps</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-812-18</td><td></td></tr><tr><td>140 ml syringe</td><td>Kendall Healthcare Monoject</td><td>8881114030</td><td>Ensure there is a luer lock.</td></tr><tr><td>IX71 Inverted light microscope</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>Retiga-2000R microscope camera</td><td>QImaging</td><td>RET-2000R-F-M-12</td><td></td></tr><tr><td>Accusizer 780A Autodilution</td><td>PSS-NICOMP Particle Sizing Systems</td><td>Out of production</td><td></td></tr></tbody></table>

manufacture of concentrated, lipid-based oxygen microbubble emulsions by high shear homogenization and serial concentration

ガス充填マイクロバブルは超音波造影および薬物送達剤として開発されている。マイクロバブルは、超音波処理、機械的攪拌、マイクロ流体デバイス、または均質化を用いて界面活性剤を処理することにより製造することができる。最近では、脂質ベースの酸素マイクロバブル（のLOM）は、生命を脅かす低酸素血症を逆転、医療緊急時に静脈内に酸素を供給するように設計され、その後の臓器損傷、心停止、死亡を防止しています。我々は、閉ループ高剪断ホモジナイザーを使用して、高度に酸素化されたマイクロバブルのスケールアップ生産のための方法を提示する。プロセスは、90分での濃縮のLOM 2 L（90体積％）を生成することができる。 60体積％に希釈したときに得られた気泡は、約2ミクロンの平均直径、および血液のそれと一致するレオロジープロファイルを有する。この技法は、この技術はトランスレーショナルリサーチラボのために有用であり得ることを示唆している、高容量および高酸素純度のLOMを生成します。

高せん断均質化は、動物の研究のために十分のLOMの（ すなわち 1日の午後内で）効率的な生産を可能にし、技術的専門知識を必要としません。一旦熟練し、濃縮のLOMの最大2 Lは90分で製造することができる。 マイクロバブルのサイズ及び形態を光学顕微鏡により光オブスキュレーションにより評価した。のLOM10μlのサンプルを可視化した場合には、球状のLOMに注意?...

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Manufacture of Concentrated, Lipid-based Oxygen Microbubble Emulsions by High Shear Homogenization and Serial Concentration

我々は、高剪断均質化およびシリアル濃度を用いて、静脈内酸素供給用に設計された脂質ベースの酸素の微小気泡（のLOM）の大量製造するための方法を記載している。

濃縮された高せん断均質化およびシリアル濃度によって脂質系酸素マイクロバブルエマルジョンの製造

Gas-filled microbubbles have been developed as ultrasound contrast and drug delivery agents. Microbubbles can be produced by processing surfactants using ...

manufacture-concentrated-lipid-based-oxygen-microbubble-emulsions

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.9K ビュー.  Harvard Medical School. 我々は、高剪断均質化およびシリアル濃度を用いて、静脈内酸素供給用に設計された脂質ベースの酸素の微小気泡（のLOM）の大量製造するための方法を記載している。 

ビデオ: Manufacture of Concentrated, Lipid-based Oxygen Microbubble Emulsions by High Shear Homogenization and Serial Concentration

Introduction to the Ultrasound Targeted Microbubble Destruction Technique

In UTMD, bioactive molecules, such as negatively charged plasmid DNA vectors encoding a gene of interest, are added to the cationic shells of lipid microbubble contrast agents7-9. In mice these vector-carrying microbubbles can be administered intravenously or directly to the left ventricle of the heart. In larger animals they can also be infused through an intracoronary catheter. The subsequent delivery from the circulation to a target organ occurs by acoustic cavitation at a resonant frequency of the microbubbles. It seems likely that the mechanical energy generated by the microbubble destruction results in transient pore formation in or between the endothelial cells of the microvasculature of the targeted region10. As a result of this sonoporation effect, the transfection efficiency into and across the endothelial cells is enhanced, and transgene-encoding vectors are deposited into the surrounding tissue. Plasmid DNA remaining in the circulation is rapidly degraded by nucleases in the blood, which further reduces the likelihood of delivery to non-sonicated tissues and leads to highly specific target-organ transfection.

Ultrasound Targeted Microbubble Destruction (UTMD) can be used to direct site-specific delivery of bioactive molecules, including therapeutic genes, to target organs accessible to ultrasound, such as the heart and liver1-6.

超音波標的マイクロバブル破壊テクニック入門

In UTMD, bioactive molecules, such as negatively charged plasmid DNA vectors encoding a gene of interest, are added to the cationic shells of lipid ...

生物工学

Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform to study protein-protein and protein-lipid interactions3, monitor drug delivery4,5, and encapsulation4. Phospholipids naturally create curved lipid bilayers, distinguishing itself from a micelle.6 Liposomes are traditionally classified by size and number of bilayers, i.e. large unilamellar vesicles (LUVs), small unilamellar vesicles (SUVs) and multilamellar vesicles (MLVs)7. In particular, the preparation of homogeneous liposomes of various sizes is important for studying membrane curvature that plays a vital role in cell signaling, endo- and exocytosis, membrane fusion, and protein trafficking8. Several groups analyze how proteins are used to modulate processes that involve membrane curvature and thus prepare liposomes of diameters &lt;100 - 400 nm to study their behavior on cell functions3. Others focus on liposome-drug encapsulation, studying liposomes as vehicles to carry and deliver a drug of interest9. Drug encapsulation can be achieved as reported during liposome formation9. Our extrusion step should not affect the encapsulated drug for two reasons, i.e. (1) drug encapsulation should be achieved prior to this step and (2) liposomes should retain their natural biophysical stability, securely carrying the drug in the aqueous core. These research goals further suggest the need for an optimized method to design stable sub-micron lipid vesicles.
Nonetheless, the current liposome preparation technologies (sonication10, freeze-and-thaw10, sedimentation) do not allow preparation of liposomes with highly curved surface (i.e. diameter &lt;100 nm) with high consistency and efficiency10,5, which limits the biophysical studies of an emerging field of membrane curvature sensing. Herein, we present a robust preparation method for a variety of biologically relevant liposomes.
Manual extrusion using gas-tight syringes and polycarbonate membranes10,5 is a common practice but heterogeneity is often observed when using pore sizes &lt;100 nm due to due to variability of manual pressure applied. We employed a constant pressure-controlled extrusion apparatus to prepare synthetic liposomes whose diameters range between 30 and 400 nm. Dynamic light scattering (DLS)10, electron microscopy11 and nanoparticle tracking analysis (NTA)12 were used to quantify the liposome sizes as described in our protocol, with commercial polystyrene (PS) beads used as a calibration standard. A near linear correlation was observed between the employed pore sizes and the experimentally determined liposomes, indicating high fidelity of our pressure-controlled liposome preparation method. Further, we have shown that this lipid vesicle preparation method is generally applicable, independent of various liposome sizes. Lastly, we have also demonstrated in a time course study that these prepared liposomes were stable for up to 16 hours. A representative nano-sized liposome preparation protocol is demonstrated below.

This protocol describes an extrusion method for preparing lipid vesicles of sub-micron sizes with a high degree of homogeneity. This method uses a pressure-controlled system with controlled nitrogen flow rates for liposome preparation. The lipid preparation1,2, liposome extrusion, and size characterization will be presented herein.

ナノサイズの脂質小胞の調製のための一定の圧力制御押出法

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This emerging field engages engineers, chemists, biologists, and physicists to design and assemble basic biological components into complex, functioning systems from the bottom up. Such bottom-up systems could lead to the development of artificial cells for fundamental biological inquiries and innovative therapies1,2. Giant unilamellar vesicles (GUVs) can serve as a model platform for synthetic biology due to their cell-like membrane structure and size. Microfluidic jetting, or microjetting, is a technique that allows for the generation of GUVs with controlled size, membrane composition, transmembrane protein incorporation, and encapsulation3. The basic principle of this method is the use of multiple, high-frequency fluid pulses generated by a piezo-actuated inkjet device to deform a suspended lipid bilayer into a GUV. The process is akin to blowing soap bubbles from a soap film. By varying the composition of the jetted solution, the composition of the encompassing solution, and/or the components included in the bilayer, researchers can apply this technique to create customized vesicles. This paper describes the procedure to generate simple vesicles from a droplet interface bilayer by microjetting.

Microfluidic jetting against a droplet interface lipid bilayer provides a reliable way to generate vesicles with control over membrane asymmetry, incorporation of transmembrane proteins, and encapsulation of material. This technique can be applied to study a variety of biological systems where compartmentalized biomolecules are desired.

マイクロ流体ジェッティングを使用して、脂質二重層小胞の生成

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Fabricating High-viscosity Droplets using Microfluidic Capillary Device with Phase-inversion Co-flow Structure

The generation of monodisperse droplets with high viscosity has always been a challenge in droplet microfluidics. Here, we demonstrate a phase-inversion co-flow device to generate uniform high-viscosity droplets in a low-viscosity fluid. The microfluidic capillary device has a common co-flow structure with its exit connecting to a wider tube. Elongated droplets of the low-viscosity fluid are first encapsulated by the high-viscosity fluid in the co-flow structure. As the elongated low-viscosity droplets flow through the exit, which is treated to be wetted by the low-viscosity fluid, phase inversion is then induced by the adhesion of the low viscosity droplets to the tip of the exit, which results in the subsequent inverse encapsulation of the high-viscosity fluid. The size of the resultant high-viscosity droplets can be adjusted by changing the flow rate ratio of the low-viscosity fluid to the high-viscosity fluid. We demonstrate several typical examples of the generation of high-viscosity droplets with a viscosity up to 11.9 Pas, such as glycerol, honey, starch, and polymer solution. The method provides a simple and straightforward approach to generate monodisperse high-viscosity droplets, which may be used in a variety of droplet-based applications, such as materials synthesis, drug delivery, cell assay, bioengineering, and food engineering.

A phase-inversion co-flow device is demonstrated to generate monodisperse high-viscosity droplets above 1 Pas, which is difficult to realize in droplet microfluidics.

位相反転共同フロー構造を有するマイクロ流体デバイスをキャピラリーを用いた加工の高粘度液滴

The generation of monodisperse droplets with high viscosity has always been a challenge in droplet microfluidics. Here, we demonstrate a phase-inversion ...

化学

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane (PDMS) Co-axial Flow Focus Device

Double emulsions are useful in a number of biological and industrial applications in which it is important to have an aqueous carrier fluid. This paper presents a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic device capable of generating water/oil/water double emulsions using a coaxial flow focusing geometry that can be fabricated entirely using soft lithography. Similar to emulsion devices using glass capillaries, double emulsions can be formed in channels with uniform wettability and with dimensions much smaller than the channel sizes. Three dimensional flow focusing geometry is achieved by casting a pair of PDMS slabs using two layer soft lithography, then mating the slabs together in a clamshell configuration. Complementary locking features molded into the PDMS slabs enable the accurate registration of features on each of the slab surfaces. Device testing demonstrates formation of double emulsions from 14 &#181;m to 50 &#181;m in diameter while using large channels that are robust against fouling and clogging.

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane PDMS Co-axial Flow Focus Device

Microfluidic double emulsions generation typically involves devices with patterned wettability or custom-fabricated glass components. Here we describe the fabrication and testing of an all polydimethylsiloxane (PDMS) double emulsion generator that does not require surface treatment or complicated fabrication processes, and is capable of producing double emulsions down to 14 &#181;m.

ポリジメチルシロキサン（PDMS）同軸フローフォーカス・デバイスを使用したダブルエマルションの生成

Double emulsions are useful in a number of biological and industrial applications in which it is important to have an aqueous carrier fluid. This paper ...

Fabricating and Labeling Microbubbles with Fluorescent and Radioactive Tracers

Microbubbles are lipid-shelled, gas-filled particles that have evolved from vascular ultrasound contrast agents into revolutionary cancer therapy platforms. When combined with therapeutic focused ultrasound (FUS), they can safely and locally overcome physiological barriers (e.g., blood-brain barrier), deliver drugs to otherwise inaccessible cancers (e.g., glioblastoma and pancreatic cancer), and treat neurodegenerative diseases. The therapeutic arsenal of microbubble-FUS is advancing in new directions, including synergistic combination radiotherapy, multimodal imaging, and all-in-one drug loading and delivery from microbubble shells.
Labeling microbubbles with radiotracers is key to establishing these expanded theranostic capabilities. However, existing microbubble radiolabeling strategies rely on purification methodologies known to perturb microbubble physicochemical properties, use short-lived radioisotopes, and do not always yield stable chelation. Collectively, this creates ambiguity surrounding the accuracy of microbubble radioimaging and the efficiency of tumor radioisotope delivery.
This protocol describes a new one-pot, purification-free microbubble labeling methodology that preserves microbubble physicochemical properties while achieving &#62;95% radioisotope chelation efficiency. It is versatile and can be applied successfully across custom and commercial microbubble formulations with differing acyl lipid chain length, charge, and chelator/probe (porphyrin, DTPA, DiI) composition. It can be adaptively applied during ground-up microbubble fabrication and to pre-made microbubble formulations with modular customizability of fluorescence and multimodal fluorescence/radioactive properties. Accordingly, this flexible method enables the production of tailored, traceable (radio, fluorescent, or radio/fluorescent active) multimodal microbubbles that are useful for advancing mechanistic, imaging, and therapeutic microbubble-FUS applications.

This protocol outlines the fabrication of lipid microbubbles and a compatible one-pot microbubble radiolabeling method with purification-free &gt;95% labeling efficiency that conserves microbubble physicochemical properties. This method is effective across diverse lipid microbubble formulations and can be tailored to generate radioactive and/or fluorescent microbubbles.

蛍光および放射性トレーサーによるマイクロバブルの作製と標識

Microbubbles are lipid-shelled, gas-filled particles that have evolved from vascular ultrasound contrast agents into revolutionary cancer therapy ...

がん研究

Microfluidic Production of Lysolipid-Containing Temperature-Sensitive Liposomes

The presented protocol enables a high-throughput continuous preparation of low temperature-sensitive liposomes (LTSLs), which are capable of loading chemotherapeutic drugs, such as doxorubicin (DOX). To achieve this, an ethanolic lipid mixture and ammonium sulfate solution are injected into a staggered herringbone micromixer (SHM) microfluidic device. The solutions are rapidly mixed by the SHM, providing a homogeneous solvent environment for liposomes self-assembly. Collected liposomes are first annealed, then dialyzed to remove residual ethanol. An ammonium sulfate pH-gradient is established through buffer exchange of the external solution by using size exclusion chromatography. DOX is then remotely loaded into the liposomes with high encapsulation efficiency (&#62; 80%). The liposomes obtained are homogenous in size with Z-average diameter of 100 nm. They are capable of temperature-triggered burst release of encapsulated DOX in the presence of mild hyperthermia (42 &#176;C). Indocyanine green (ICG) can also be co-loaded into the liposomes for near-infrared laser-triggered DOX release. The microfluidic approach ensures high-throughput, reproducible and scalable preparation of LTSLs.

The protocol presents the optimized parameters for preparing thermosensitive liposomes using the staggered herringbone micromixer microfluidics device. This also allows co-encapsulation of doxorubicin and indocyanine green into the liposomes and the photothermal-triggered release of doxorubicin for controlled/triggered drug release.

リゾ脂質含有温度感受性リポソームのマイクロ流体生産

The presented protocol enables a high-throughput continuous preparation of low temperature-sensitive liposomes (LTSLs), which are capable of loading ...

Production of Membrane-Filtered Phase-Shift Decafluorobutane Nanodroplets from Preformed Microbubbles

There are many methods that can be used for the production of vaporizable phase-shift droplets for imaging and therapy. Each method utilizes different techniques and varies in price, materials, and purpose. Many of these fabrication methods result in polydisperse populations with non-uniform activation thresholds. Additionally, controlling the droplet sizes typically requires stable perfluorocarbon liquids with high activation thresholds that are not practical in vivo. Producing uniform droplet sizes using low-boiling point gases would be beneficial for in vivo imaging and therapy experiments. This article describes a simple and economical method for the formation of size-filtered lipid-stabilized phase-shift nanodroplets with low-boiling point decafluorobutane (DFB). A common method of generating lipid microbubbles is described, in addition to a novel method of condensing them with high-pressure extrusion in a single step. This method is designed to save time, maximize efficiency, and generate larger volumes of microbubble and nanodroplet solutions for a wide variety of applications using common laboratory equipment found in many biological laboratories.

This protocol describes a method of generating large volumes of lipid encapsulated decafluorobutane microbubbles using probe-tip sonication and subsequently condensing them into phase-shift nanodroplets using high-pressure extrusion and mechanical filtration.

プレフォームマイクロバブルからの膜濾過相シフトデカフルオロブタンナノ液滴の製造

There are many methods that can be used for the production of vaporizable phase-shift droplets for imaging and therapy. Each method utilizes different ...

Preparation and Characterization of Targeted Microbubbles

Targeting of microbubbles (ultrasound contrast agents for molecular imaging) has been researched for more than two decades. However, methods of microbubble preparation and targeting ligand attachment are cumbersome, complicated, and lengthy. Therefore, there is a need to simplify the targeted microbubble preparation procedure to bring it closer to clinical translation. The purpose of this publication is to provide a detailed description and explanation of the steps necessary for targeted microbubble preparation, functional characterization and testing. A sequence of the optimized and simplified procedures is presented for two systems: a biotin-streptavidin targeting pair model, and a cyclic RGD peptide targeting the recombinant &#945;v&#946;3 protein, which is overexpressed on the endothelial lining of the tumor neovasculature.
Here, we show the following: covalent coupling of the targeting ligand to a lipid anchor, assessment of the reagent quality, and tests that confirm the successful completion of the reaction; preparation of the aqueous precursor medium containing microbubble shell components, followed by microbubble preparation via amalgamation; assessment of the efficacy of lipid transfer onto the microbubble stabilizer shell; adjustment of microbubble size distribution by flotation at normal gravity to remove larger microbubbles that might be detrimental for in vivo use; assessment of microbubble size distribution by electrozone sensing; evaluation of targeted binding of the microbubbles to receptor-coated surface in a static binding assay test (in an inverted dish); and evaluation of targeted binding of the microbubbles to receptor-coated surface in a parallel plate flow chamber test.

The goal of this protocol is to prepare, purify and characterize gas-filled microbubbles (targeted contrast agents for ultrasound molecular imaging). Two targeting systems are described: biotinylated bubbles adherent to streptavidin, and cyclic RGD peptide microbubbles that bind to &#945;v&#946;3, a known tumor neovasculature biomarker.

Targeting of microbubbles (ultrasound contrast agents for molecular imaging) has been researched for more than two decades. However, methods of ...

Fabricating Highly Open Porous Microspheres (HOPMs) via Microfluidic Technology

Compared to bulk scaffolds and direct injection of cells alone, the injectable modular units have garnered enormous interest in repairing malfunctioned tissues due to convenience in the packaging of cells, improved cell retention, and minimal invasiveness. Moreover, the porous conformation of these microscale carriers could enhance the medium exchange and improve the level of nutrients and oxygen supplies. The present study illustrates the convenient fabrication of poly(lactic-co-glycolic acid)-based highly open porous microspheres (PLGA-HOPMs) by the facile microfluidic technology for cell delivery applications. The resultant monodispersed PLGA-HOPMs possessed particle sizes of ~400 &#181;m and open pores of ~50 &#181;m with interconnecting windows. Briefly, the emulsified oil droplets (PLGA solution in dichloromethane, DCM), wrapped with the 7.5% (w/v) gelatin aqueous phase, were introduced into the 1% (w/v) continuous flowing poly(vinyl alcohol) (PVA) aqueous solution through the coaxial nozzle in the customized microfluidic setup. Subsequently, the microspheres were subjected to solvent extraction and lyophilization procedures, resulting in the production of HOPMs. Notably, various formulations (concentrations of PLGA and porogen) and processing parameters (emulsifying power, needle gauge, and flow rate of dispersed phase) play crucial roles in the qualities and characteristics of the resulting PLGA HOPMs. Moreover, these architectures might potentially encapsulate various other biochemical cues, such as growth factors, for extended drug discovery and tissue regeneration applications.

Fabricating Highly Open Porous Microspheres HOPMs via Microfluidic Technology

The present protocol describes the fabrication of poly(lactic-co-glycolic acid)-based highly open porous microspheres (HOPMs) via the single-emulsion formulation based facile microfluidic technology. These microspheres have potential applications in tissue engineering and drug screening.

マイクロ流体技術 による 高開放多孔質ミクロスフェア(HOTM)の作製

Compared to bulk scaffolds and direct injection of cells alone, the injectable modular units have garnered enormous interest in repairing malfunctioned ...

濃縮された高せん断均質化およびシリアル濃度によって脂質系酸素マイクロバブルエマルジョンの製造

要約

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超音波標的マイクロバブル破壊テクニック入門

ナノサイズの脂質小胞の調製のための一定の圧力制御押出法

マイクロ流体ジェッティングを使用して、脂質二重層小胞の生成

位相反転共同フロー構造を有するマイクロ流体デバイスをキャピラリーを用いた加工の高粘度液滴

ポリジメチルシロキサン（PDMS）同軸フローフォーカス・デバイスを使用したダブルエマルションの生成

蛍光および放射性トレーサーによるマイクロバブルの作製と標識

リゾ脂質含有温度感受性リポソームのマイクロ流体生産

プレフォームマイクロバブルからの膜濾過相シフトデカフルオロブタンナノ液滴の製造

Preparation and Characterization of Targeted Microbubbles

マイクロ流体技術による高開放多孔質ミクロスフェア(HOTM)の作製

濃縮された高せん断均質化およびシリアル濃度によって脂質系酸素マイクロバブルエマルジョンの製造

要約

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超音波標的マイクロバブル破壊テクニック入門

ナノサイズの脂質小胞の調製のための一定の圧力制御押出法

マイクロ流体ジェッティングを使用して、脂質二重層小胞の生成

位相反転共同フロー構造を有するマイクロ流体デバイスをキャピラリーを用いた加工の高粘度液滴

ポリジメチルシロキサン（PDMS）同軸フローフォーカス・デバイスを使用したダブルエマルションの生成

蛍光および放射性トレーサーによるマイクロバブルの作製と標識

リゾ脂質含有温度感受性リポソームのマイクロ流体生産

プレフォームマイクロバブルからの膜濾過相シフトデカフルオロブタンナノ液滴の製造

Preparation and Characterization of Targeted Microbubbles

マイクロ流体技術 による 高開放多孔質ミクロスフェア(HOTM)の作製

マイクロ流体技術による高開放多孔質ミクロスフェア(HOTM)の作製