我々は彼らのイメージング顕微鏡設備の使用のために博士タオダンと彼女の研究室のメンバーの共同の努力に感謝します。我々はまた、子宮組織を私たちに提供するためのバイオレポジトリーおよび組織研究施設（BTRF）コア、ジェフ·ハーパー、バージニア大学の住民に感謝。私たちは、回路図の概要のヘルプはカロルSzlachtaに感謝します。

本稿で使用し子宮摘出標本は、IRB - HSR＃14424の番号が大学のIRB承認された倫理プロトコルの一致に集めた。 臨床ソースから1。サンプル取得<ol><li>開始前に政府と制度に基づく倫理指針と承認の文書を入手します。 </li><li>無菌状態のすべての手順を実施しています。 </li><li>サンプルはすぐに培養中に処理できない場合は、4℃で50ミリリットルチューブにメディア（RPMIまたはDMEM /高グルコース）中で、患者由来の組織を維持する。サンプルは、24時間の最大この状態で保存することができる。 </li><li> 1X滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で組織試料を3回洗浄し、洗浄の間、溶液を捨てる。 </li></ol>スクレイピング方式を使用して、プライマリ細胞株の2。準備<ol><li>成長培地（RPMI、10％ウシ胎仔血清および1％ペニシリン - streptomyを補充したDMEM /高グルコース4-10 mlを加えCIN）組織に、30分間ファンギゾン（0.25μg/ mlの最終濃度）を追加します。 </li><li>増殖培地を廃棄する。 </li><li> 1X PBSで2回組織を洗浄します。 </li><li>子宮筋層と子宮内膜層（図にさらなる説明のために図2A〜図2Cを参照）との間で区別するために6cmの細胞培養プレート上の組織を置く。子宮内膜を分離する。 </li><li> 6cmの細胞培養皿上に引っ掻きながらメスまたはカミソリの刃を用いて小片に組織を離断。これらの傷は、新興主要な子宮内膜細胞の付着を促進する。トリプシン法と比較して、より多くの組織を（近似図2Dを参照）が必要である。 </li><li>優しく、傷ディッシュ（組織片が見え、理想的に引っ掻き運動から固定化されます）に増殖培地の2ミリリットルを追加します。 </li><li>指定された細胞培養インキュベーター（37℃、5％CO 2）、プレート（単数または複数）を転送する。離れてOTHから、一次細胞株のための場所を指定するER細胞培養皿。初代培養は、感染および汚染に敏感です。 </li><li>毎日、光学顕微鏡下で細胞を調べます。細胞の小集団がスライスされた組織（図3Bを参照）の周囲から一日2または3で出現する必要があります。 </li><li> 、文化を維持し、1X PBSで優しく洗って3日ごとに新鮮な増殖培地（2ミリリットル）を追加する。時増殖速度が増加すると、追加の増殖培地（3-4 ml）を6cmの培養プレート（単数または複数）に添加することができる。 注意：洗濯やメディアの変更時には、組織片は、おそらく吸引されます。これは接着細胞の成長に影響を与えません。新しいコロニーが1週間後に出現する可能性は低いように組織片は、次の工程（2.10）により吸引しなければならない。 </li><li> 0.05％トリプシンを用いて80％コンフルエント（図3B参照）、通路- 6cmのプレートは、約75である場合。初代細胞は無限に継代することができません - 2または3のプレートがMAであるとすぐに、細胞の1プレートを下に凍結intained。複数の通路が必要な場合は、（参考文献3に概説されている）不死化プロトコルに従う。 </li></ol>トリプシン法を使用して、プライマリ細胞株の3。準備<ol><li>カナマイシン（0.03 mg / mlの最終濃度）を添加した0.25％トリプシン2mlに子宮内膜組織の小片（近似図2Dを参照）を配置します。 </li><li> 30分間回転台上で37℃で組織をインキュベートする。 </li><li>簡単に言えば、組織をボルテックスする。 </li><li> 2分間200〜400×gでサンプルを遠心分離し、上澄みを捨てる。 </li><li>新鮮なトリプシンおよびカナマイシンを追加します。 </li><li>時間回転させながら37℃で組織をインキュベートする。 </li><li> 5月10日秒のための組織をボルテックスする。 </li><li>トリプシンを不活性化する（10％ウシ胎児血清および1％ペニシリン - ストレプトマイシンを補充した）増殖培地を2mlを加える。 </li><li> 2〜3分間200〜400×gで遠心分離細胞。 </li><li>上清を捨て、成長の2ミリリットルを追加ペレット化した細胞への番目のメディア。 </li><li> 6cmの細胞培養皿にプレート。 スクレイピング方式を使用して、プライマリ細胞株を調製する工程2.5のようにプレートをこすることは必要ありませんが、初代培養の取り付けと成長を強化します。 </li><li>毎日、光学顕微鏡下で細胞を監視します。細胞（図3C参照）24〜48時間後に光学顕微鏡では通常表示されます。 </li><li>文化を維持するために、細胞を監視し、ステップ2.9のように2〜3日ごとにメディアを変更。 </li><li>細胞が75〜80％の集密度（図3cを参照）に達したときに通路に細胞は、0.05％、0.25％トリプシンを使用しています。 </li></ol> 4。追加分析のための組織（スナップ凍結し、ホルマリン固定）を保存する<ol><li> 1X PBSで2回サンプルを洗ってください。 </li><li>可能な限り液体として吸引除去する。 </li><li>スナップ凍結のため、（図2Fおよび2Gを参照してください）1.7遠心管に子宮内膜組織サンプルを置く。 1.7を配置遠心分離管10秒間液体窒素中またはまで、組織を凍結していることがわかる。 注：サンプルを調製する際に、直接液体窒素に触れないように注意してください。サンプルは、さらなる処理または分析するまで-80℃で保存することができる。 </li><li>ホルマリン固定のために、（図2H参照）子宮内膜組織の小片にカットし、10％緩衝ホルマリン中で亜鉛沈める。 24時間後、ホルマリンを破棄し、さらなる処理まで組織サンプルに70％エタノールを加える。 </li></ol> 5。免疫蛍光（IF） <ol><li>細胞固定<ol><li>培養スライドまたはプレート上の細胞を準備します。 </li><li>優しく、1×PBSで細胞を洗浄。 </li><li> 5分間予め冷却（4℃）メタノール及びアセトン（1:1の比で混合）を添加する。 </li><li>空気が進む前に、スライドを乾燥させます。必要に応じて、スライドは1〜2週間4℃で保存することができる。 </li></ol></li><li>処理IF <ol><li> 10分間、1X PBSで細胞を再水和する。 FOのためにllowingは回転プラットフォーム上のすべての洗浄およびインキュベーションを行って、1〜6を繰り返します。 </li><li> 1X PBSを使用してブロックを1％ウシ血清アルブミン（BSA）を補充し、室温（RT）で30分間、1％の種特異的血清（2 回目の抗体の供給源）。 </li><li> （抗体希釈用の製造業者の推奨を参照）一次抗体でインキュベートする。特異的な抗体のための材料を参照してください。ステップ5.2.2のように新鮮なブロッキング緩衝液中で一次抗体を希釈します。このインキュベーションはRTで、または一晩4℃で少なくとも2時間行うことができる</li><li> 5分ごとに1×PBSで3回洗浄する。 </li><li>二次抗体でインキュベートする（抗体希釈用の製造業者の推奨を参照してください）​​。ステップ5.2.2のように新鮮なブロッキング緩衝液中で二次抗体を希釈します。光退色を防止するために、光の非存在下でこの以降の処理を行うことが重要である。 </li><li> 5分ごとに1×PBSで3回洗浄する。 </li><li> ThoroughlYは、スライドを乾燥させます。 </li><li>封入剤およびDAPI対比溶液を加える。 </li><li>カバースリップを適用し、シール剤（複数可）を使用してエッジをシールする。スライドは2週間まで、暗所で4℃で保存することができる。 </li></ol></li></ol> 6。RNA抽出<ol><li>遠心分離により1×10 7細胞をペレット化。このプロトコルのすべての材料および試薬は無しRNaseする必要があります。 </li><li>溶解の1ミリリットルTRIZOL試薬中の細胞および核タンパク質複合体の解離を完了するために、室温で10分間均質化したサンプルをインキュベートする。 </li><li> TRIZOLの1ミリリットル当たり200μlのクロロホルムを追加します。 15秒間、手でよく振るし、室温で2〜3分間インキュベートする。 </li><li> 4℃で15分間、最大速度（15,000×g）で遠心分離する3つの層が発生します。 </li><li>新しいマイクロチューブに上部の水相を転送します。 RNA収量を高めるために1μlのグリコーゲンを追加します。しかしながら、このステップは必要なときに小RNAの量が予想される。 </li><li>水層にイソプロピルアルコール0.5ミリリットルを追加し、サンプルを3〜5回転倒。室温で10分間、サンプルをインキュベートする。収率を増加させるために、試料を30分間、-20℃または-80°Cに配置することができる。 </li><li> 4℃で10分間最大速度で遠心分離する</li><li>この時点で、RNAの小さなペレットが表示されるはずです。上清を捨てる。 </li><li> 75％エタノール1mlでRNAを洗ってください。 </li><li> 5分間最大速度で遠心し、上清を捨てる。サンプルは、無機汚染物質を取り除くためにもう一度洗浄することができますが、この手順は必要ありません。 </li><li> RNAのペレットが乾燥するまで簡単に言えば、（通常は7月10日分かかります）RNAペレットを乾燥させます。 注：One追加の工程は、無機物質を減少させ、乾燥時間を減少させるために使用することができる。追加分吸引残液の最大速度でエタノール洗浄、スピンサンプルから上清を捨てた後。ペレットを吸引しないように注意してください。 </li><li> RNAペレットのサイズに応じて、RNaseを含まない水にRNAを溶解する。ボリュームは、一般的に10〜50μLの範囲です。 </li><li> 10分間55℃でサンプルをインキュベートし、RNAの濃度を測定する。 </li><li>さらなる処理まで-20℃で保存したサンプル。 </li></ol> 7。逆転写<ol><li> H 2 Oで9μLの容量にサンプルRNA（1-3μgのを）持って来る</li><li> 10分間70℃に加熱するRNA。 </li><li>のdNTP5μlの（50μMの作業濃度）、N6のDNAオリゴの5μL（80μmの作用濃度）、5×AMVバッファーを5μl、およびAMVの1μL：AMVマスターミックスを生成するには、以下の試薬を組み合わせて。このマスターミックス溶液は、1サンプルあたりに設計されている。 </li><li>加熱されたRNAにマスターミックス16μLを加える。最終反応容量は25μl反応であろう。 </li><li> （第1段階）で90分間42℃で、（駅：逆転写のため、以下のPCR条件を使用し5分、さらなる処理まで（第3段階）、4℃ためシチズン2）95°C。 </li></ol> 8。リアルタイムPCR <ol><li> 表1に示すプライマーアニーリング温度、サイクル数、および試薬を用いてPCR反応を行う。 注：（ 材料会社、カタログ番号を参照）PCR試薬を使用する際に、製造業者の指示に従うことが理想的です。 </li></ol>図9（参考文献4および5由来） インビトロ脱落膜化プロトコル<ol><li>子宮内膜細胞をプレート。 </li><li> 75から85パーセントの集密度まで成長する。 </li><li>細胞がコンフルエントになった後、1×PBSで1回洗浄。 </li><li>すぐに、（フェノールを含まないRPMI 5％の木炭ストリップFBSおよび1％ペニシリン - ストレプトマイシンを補充した）ホルモンを含まない培地を追加します。 </li><li> 24時間後、1μMおよび8 - ブロモアデノシン3の最終濃度で酢酸メドロキシプロゲステロン（MPA）を補充したホルモンフリー培地 &#39;、5&#39;を追加-環状一リン酸（cAMP）を0.5mMの最終濃度で。 </li><li>少なくとも48時間後、反応を停止し、さらなる処理のために、プレート（単数または複数）を保存する。 </li></ol>

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著者らは、開示することは何もない。

他のグループについておよびコラゲナーゼ4,12,13,15-18を利用するほとんどが子宮内膜間質培養物を調製するための方法を適応している。本稿では、我々は経済的な理由とトリプシンの便利な利用可能性および/またはカミソリの刃のために私たちの研究室で利用され、どちらも2単純化された主要な子宮内膜間質培養法のための方法論と証拠を提供した。 我々の2つ?...

ヒト子宮コーパス3層、子宮外膜（又は漿膜）、子宮筋層及び子宮内膜から構成されている。これらの層のそれぞれを区別することは、子宮内膜細胞株を確立するための重要なステップである。子宮外膜は子宮の最も外側の層であり、薄い、漿液細胞からなる。子宮筋層の厚さの中間層であり、平滑筋細胞からなる。子宮内膜は、子宮の内層として同定され、上皮および間質細胞集団を含む。 子宮内膜は、さらに、その幹細胞集団は、約28日ごとに1 functionalis層を再増殖すると仮定されている基底層に細分される。ヒト子宮内膜のfunctionalis層は、ホルモンの循環に応じて、重要な生化学的および形態学的変化を受ける。これらのホルモンは、下垂体や卵巣から派生しています。 ザ·コー​​ディネートの生産と生殖周期におけるホルモンの結果のリリース。生殖周期は、潜在的な胚着床イベントの子宮内膜を作製するように設計されている。ヒトでは、生殖周期」は、月経周期」として知られており、3つの段階に分け - 増殖、分泌、および月経。分泌期がfunctionalis成熟によってマークされているのに対し、増殖期はfunctionalis子宮内膜層の増殖を伴う。具体的には、細胞外の変化、分泌物、および細胞分化は、潜在的な注入を知らせる。注入は分泌期の終了前に発生しない場合は、functionalis子宮内膜層は月経期の間に流されている。月経とfunctionalis層の脱落をトリガーするイベントの重要性はまだ議論されています。ヒトでは、月経が知られている特定の中間分泌期の分化事象の結果であると提起されている「自発的脱落膜化」2など。本稿では、両方の子宮内膜間質細胞の単離方法の詳細な方法論を提供し、これらのアプローチの有効性を実証するために、免疫蛍光、デジタル画像の組み合わせを使用する。加えて、我々は一般的に適用される子宮内膜間質細胞の単離を確認するために、自発的な脱落膜化のインビトロモデルにおいて使用される。

<table><tbody><tr><td>0.25 Trypsin or 0.05% Trypsin&amp;nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SH3023602 or SH30004202</td><td></td></tr><tr><td>1.7 micro Centrifuge Tube&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Genesee Scientific</td><td>22-272A</td><td></td></tr><tr><td>1 &amp;micro;l, 20 &amp;micro;l, 200 ml and 1,000 &amp;micro;l Pipette&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Genesee Scientific</td><td>24-401,24-402, 24-412, 24-430</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Conical Tube&amp;nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Conical Tube&amp;nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>6 cm Cell Culture Dish&amp;nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>12-556-002</td><td></td></tr><tr><td>8 well Chambers&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-4162</td><td></td></tr><tr><td>Acetate&amp;nbsp;</td><td>Fisher scientific</td><td>C4-100</td><td></td></tr><tr><td>AMV RT Enzyme/Buffer&amp;nbsp;</td><td>Bio Labs</td><td>M077L</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP-1605-100</td><td></td></tr><tr><td>Buffered Zinc Formalin&amp;nbsp;</td><td>Thermo</td><td>59201ZF</td><td></td></tr><tr><td>Charcoal strip FBS&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>NC9019735</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1145-1</td><td></td></tr><tr><td>Cover slip&amp;nbsp;</td><td>Fisher Brand</td><td>12-544D</td><td></td></tr><tr><td>Cyclic AMP (cAMP)&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>B7880</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/High Glucose&amp;nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SH30243FS</td><td></td></tr><tr><td>dNTP&amp;nbsp;</td><td>Bioline</td><td>BIO-39025</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Anti Goat -TRITC&amp;nbsp;</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-3855</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Serum&amp;nbsp;</td><td>Jackson&amp;rsquo;s lab</td><td>017-000-002</td><td></td></tr><tr><td>E Cadherin Antibody&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Epitomics</td><td>1702-1</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-1</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-600-511</td><td></td></tr><tr><td>Fungizone Amphotericin B&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15290-018</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH Probe&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>HS99999905</td><td></td></tr><tr><td>Glycogen&amp;nbsp;</td><td>5Prime</td><td>2301440</td><td></td></tr><tr><td>Goat Anti Mouse - FITC&amp;nbsp;</td><td>Jackson&amp;rsquo;s Lab</td><td>115-096-003</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2618-1</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP906-5</td><td></td></tr><tr><td>Medroxyprogesterone acetate (MPA)&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M1629</td><td></td></tr><tr><td>MeOH (Methanol)&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A4-08-1</td><td></td></tr><tr><td>Mounting Media (w/DAPI)&amp;nbsp;</td><td>Vector Labratories</td><td>H-1500</td><td></td></tr><tr><td>N6 DNA Oligos&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Number 15 Scraper&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>371615</td><td></td></tr><tr><td>Pan Cytokeratin&amp;nbsp; Mouse mAB&amp;nbsp;</td><td>Cell Signaling</td><td>4545</td><td></td></tr><tr><td>PBS (phosphate buffered saline)&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP-399-4</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin Glutamine Solution 100X&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SV30082.01</td><td></td></tr><tr><td>PML Anti Goat Anti body&amp;nbsp;</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-9862</td><td></td></tr><tr><td>Primer(s)&amp;nbsp;</td><td>Eurofins</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI&amp;nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SH30027FS</td><td></td></tr><tr><td>RPMI (Phenol free)&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11835</td><td></td></tr><tr><td>Sybr Green&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-4162</td><td></td></tr><tr><td>Taqman&amp;nbsp;</td><td>Thermo</td><td>AB-4138</td><td></td></tr><tr><td>Trizol&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Vimentin Antibody&amp;nbsp;</td><td>Epitomics</td><td>4211-1</td><td></td></tr></tbody></table>

two methods for establishing primary human endometrial stromal cells from hysterectomy specimens

多くの努力が、インビトロ細胞培養系で確立するために専念している。これらのシステムは、in vivoでの膨大な数のプロセスをモデル化するように設計されている。人間の子宮内膜のサンプルから生じる細胞培養システムも例外ではありません。アプリケーションでは、通常のサイクリックな生理的プロセスからこのような婦人科癌、感染症、生殖不備などの子宮内膜の病変の範囲です。ここでは、外科的に切除、子宮内膜子宮摘出標本からの一次子宮内膜間質細胞を確立するための2つの方法を提供する。第一の方法は、「削り法」と呼ばれ、第2の方法と呼ばれるのに対して、外科的または剃刀の刃を用いて機械的掻き取りを組み込んで、「トリプシン法」この後者の方法は、細胞の分離および原発を促進するために、トリプシンの酵素活性を使用し細胞伸長。私たちは、デジタル画像や顕微鏡を通してステップバイステップの方法論を示している。我々はまた、提供します：定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（定量PCR）及び免疫蛍光（IF）を介して、子宮内膜間質細胞株を検証するための電子例。

プロトコルセクションで強調したように、ヒト組織を処理し、準備する際にすべての政府の下での方法、制度的、および倫理指針を実施するようにしてください。 この原稿に含まれる一次子宮内膜培養物を確立するために使用される「スクレイピング方法」の一般的なワークフロー（ 図1A）および「トリプシン法」（ 図1B）を示す?...

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Two Methods for Establishing Primary Human Endometrial Stromal Cells from Hysterectomy Specimens

子宮摘出標本からの一次子宮内膜間質細胞培養系を確立することは、貴重な生物学的な手法と先行研究の目的の広大な配列を追求する重要なステップである。ここでは、ヒト患者の外科的に切除された子宮内膜組織からの間質培養物を確立するために使用される2つの方法を記載する。

子宮摘出標本から初代ヒト子宮内膜間質細胞の確立するための2つの方法

Many efforts have been devoted to establish in vitro cell culture systems. These systems are designed to model a vast number of in vivo processes. Cell ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

22.6K ビュー.  University of Virginia. 子宮摘出標本からの一次子宮内膜間質細胞培養系を確立することは、貴重な生物学的な手法と先行研究の目的の広大な配列を追求する重要なステップである。ここでは、ヒト患者の外科的に切除された子宮内膜組織からの間質培養物を確立するために使用される2つの方法を記載する。 

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Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. Although many efforts have been made to reveal the underlying mechanisms of decidualization, the exact signaling between the epithelial cells that are in contact with the embryo and the underlying stromal cells remains poorly understood. Therefore, studying decidualization in a way that takes both the epithelial and stromal cells into account could improve our knowledge about the molecular details of decidualization. For this purpose, in vivo models of artificial decidualization are physiologically the most relevant; however, manipulation of intercellular communication is limited. Currently, in vitro cultures of endometrial stromal cells are being used to investigate the modulation of decidualization by several signaling molecules. Conventionally, human or mouse endometrial stromal cells are used. However, the availability of human samples is very often limited. Furthermore, the use of murine tissues is accompanied with variety in the method of culturing. This study presents a validated and standardized method to obtain pure Endometrial Epithelial Cell (EEC) and Stromal Cell (ESC) cultures using adult intact mice treated with estrogen for three consecutive days. The protocol is optimized to improve the yield, viability, and purity of the cells and was further extended in order to study decidualization in a coculture of EEC and ESC. This model may be suitable to exploit the importance of both cell types in decidualization and to evaluate the contribution of significant signaling molecules secreted by EEC or ESC during the intercellular communication.

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

This study presents a standardized and validated method for the isolation and culture of primary mouse endometrial stromal and epithelial cells, which can be used in a coculture system to study in vitro decidualization.

マウス子宮内膜上皮と間質細胞の単離のために<em&gt;インビトロ</em&gt;脱落膜化

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. ...

発生生物学

Obtaining Cancer Stem Cell Spheres from Gynecological and Breast Cancer Tumors

Cancer stem cells (CSC) are a small population with self-renewal and plasticity which are responsible for tumorigenesis, resistance to treatment and recurrent disease. This population can be identified by surface markers, enzymatic activity and a functional profile. These approaches per se are limited, due to phenotypic heterogeneity and CSC plasticity. Here, we update the sphere-forming protocol to obtain CSC spheres from breast and gynecological cancers, assessing functional properties, CSC markers and protein expression. The spheres are obtained with single-cell seeding at low density in suspension culture, using a semi-solid methylcellulose medium to avoid migration and aggregates. This profitable protocol can be used in cancer cell lines but also in primary tumors. The tridimensional non-adherent suspension culture thought to mimic the tumor microenvironment, particularly the CSC-niche, is supplemented with epidermal growth factor and basic fibroblast growth factor to ensure CSC signaling. Aiming for robust identification of CSC, we propose a complementary approach, combining functional and phenotypic evaluation. Sphere-forming capacity, self-renewal and sphere projection area establish CSC functional properties. Additionally, characterization comprises flow cytometry evaluation of the markers, represented by CD44+/CD24- and CD133, and Western blot, considering ALDH. The presented protocol was also optimized for primary tumor samples, following a sample digestion procedure, useful for translational research.

The aim of this methodology is to identify cancer stem cells (CSC) in cancer cell lines and primary human tumor samples with the sphere-forming protocol, in a robust manner, using functional assays and phenotypic characterization with flow cytometry and Western blot.

婦人科腫瘍および乳がん腫瘍から癌幹細胞球体を取得する

Cancer stem cells (CSC) are a small population with self-renewal and plasticity which are responsible for tumorigenesis, resistance to treatment and ...

がん研究

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

The differentiation of human endometrial stromal cells (HESC) from fibroblast-like appearance into secretory decidua is a transformation required for embryo implantation into the uterine lining of the maternal womb. Improper decidualization has been established as a root cause for implantation failure and subsequent early embryo miscarriage. Therefore, understanding the molecular mechanisms underlying decidualization is advantageous to improving the rate of successful births. In vivo based studies of artificial decidualization are often limiting due to ethical dilemmas associated with human research, as well as translational complications within animal models. As a result, in vitro assays through primary cell culture are often utilized to explore the modulation of decidualization via hormones. This study provides a detailed protocol for the isolation of HESC and subsequent artificial decidualization via the supplementation of hormones to the culturing medium. Further, this study provides a well-designed method to knockdown any gene of interest by utilizing lipid-based siRNA transfections. This protocol permits the optimization of culture purity as well as product yield, thereby maximizing the ability to utilize this model as a reliable method to understand the molecular mechanisms underlying decidualization, and the subsequent quantification of secreted agents by decidualized endometrial stromal cells.

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

This study presents a validated and optimized procedure for the isolation and culture of human endometrial stromal cells to conduct in vitro decidualization assay. Further, this study provides a detailed method to efficiently knockdown a specific gene using siRNAs in human endometrial stromal cells.

エストロージェン体外用ひと子宮内膜間質細胞の分離

The differentiation of human endometrial stromal cells (HESC) from fibroblast-like appearance into secretory decidua is a transformation required for ...

Method for Obtaining Primary Ovarian Cancer Cells From Solid Specimens

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a valuable tool for understanding ovarian cancer, their use has many limitations. These include the lack of heterogeneity and the plethora of genetic alterations associated with extended in vitro passaging.&#160;Here we describe a method that allows for rapid establishment of primary ovarian cancer cells form solid clinical specimens collected at the time of surgery. The method consists of subjecting clinical specimens to enzymatic digestion for 30 min. The isolated cell suspension is allowed to grow and can be used for downstream application including drug screening. The advantage of primary ovarian cancer cell lines over established ovarian cancer cell lines is that they are representative of the original specific clinical specimens they are derived from and can be derived from different sites whether primary or metastatic ovarian cancer.

This study describes a detailed method for isolation and characterization of primary ovarian cancer cells from solid clinical specimens. Ovarian cancer clinical specimens are subjected to enzymatic digestion to obtain viable, fibroblast-free epithelial ovarian cancer (EOC) cells highly suitable for downstream applications.

ソリッド検体からの原発性卵巣癌細胞を得る方法

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a ...

医学

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can also become diseased and cause morbidity and even death. Model systems to study human endometrial biology have been limited to in vitro culture systems of single cell types. In addition, the epithelial cells, one of the major cell types of the endometrium, do not propagate well or retain their physiological traits in culture, and thus our understanding of endometrial biology remains limited. We have generated, for the first time, endometrial organoids that consist of both epithelial and stromal cells of the human endometrium. These organoids do not require any exogenous scaffold materials and specifically organize so that epithelial cells encompass the spheroid-like structure and become polarized with stromal cells in the center that produce and secrete collagen. Estrogen, progesterone and androgen receptors are expressed in the epithelial and stromal cells and treatment with physiological levels of estrogen and testosterone promote the organization of the organoids. This new model system can be used to study normal endometrial biology and disease in ways that were not possible before.

A protocol to generate human primary endometrial organoids that consist of epithelial and stromal cells and retain characteristics of the native endometrial tissue is presented. This protocol describes methods from uterine tissue acquisition to the histologic processing of endometrial organoids.

多細胞ヒト初等子宮内膜オルガノイドの生成

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...

Modeling the Early Steps of Ovarian Cancer Dissemination in an Organotypic Culture of the Human Peritoneal Cavity

The pattern of ovarian cancer metastasis is markedly different from that of most other epithelial tumors, because it rarely spreads hematogenously. Instead, ovarian cancer cells exfoliated from the primary tumor are carried by peritoneal fluid to metastatic sites within the peritoneal cavity. These sites, most notably the abdominal peritoneum and omentum, are organs covered by a mesothelium-lined surface. To investigate the processes of ovarian cancer dissemination, we assembled a complex three-dimensional culture system that reconstructs the lining of the peritoneal cavity in vitro. Primary human fibroblasts and mesothelial cells were isolated from human omentum. The fibroblasts were then mixed with extracellular matrix and covered with a layer of the primary human mesothelial cells to mimic the peritoneal and omental surfaces encountered by metastasizing ovarian cancer cells. The resulting organotypic model is, as shown, used to examine the early steps of ovarian cancer dissemination, including cancer cell adhesion, invasion, and proliferation. This model has been used in a number of studies to investigate the role of the microenvironment (cellular and acellular) in early ovarian cancer dissemination. It has also been successfully adapted to high throughput screening and used to identify and test inhibitors of ovarian cancer metastasis.

Here, we present a protocol to construct a three-dimensional in vitro model of the lining of the peritoneal cavity, composed of primary human mesothelial cells and fibroblasts layered with extracellular matrix, as a tool to investigate ovarian cancer cell adhesion, invasion, and proliferation.

ヒト腹腔器官培養における卵巣癌普及の初期段階のモデル化

The pattern of ovarian cancer metastasis is markedly different from that of most other epithelial tumors, because it rarely spreads hematogenously. ...

Establishing 3D Endometrial Organoids from the Mouse Uterus

Endometrial tissue lines the inner cavity of the uterus and is under the cyclical control of estrogen and progesterone. It is a tissue that is composed of luminal and glandular epithelium, a stromal compartment, a vascular network, and a complex immune cell population. Mouse models have been a powerful tool to study the endometrium, revealing critical mechanisms that control implantation, placentation, and cancer. The recent development of 3D endometrial organoid cultures presents a state-of-the-art model to dissect the signaling pathways that underlie endometrial biology. Establishing endometrial organoids from genetically engineered mouse models, analyzing their transcriptomes, and visualizing their morphology at a single-cell resolution are crucial tools for the study of endometrial diseases. This paper outlines methods to establish 3D cultures of endometrial epithelium from mice and describes techniques to quantify gene expression and analyze the histology of the organoids. The goal is to provide a resource that can be used to establish, culture, and study the gene expression and morphological characteristics of endometrial epithelial organoids.

This protocol describes methodologies to establish mouse endometrial epithelial organoids for gene expression and histological analyses.

マウス子宮からの3D子宮内膜オルガノイドの確立

Endometrial tissue lines the inner cavity of the uterus and is under the cyclical control of estrogen and progesterone. It is a tissue that is composed of ...

生物学

Generation and Characterization of Rat Uterus Organoids from Rat Endometrial Epithelial Stem Cells

Endometrial organoids offer valuable insights into the development and pathophysiology of endometrial diseases and serve as platforms for drug testing. While human and mouse endometrial organoids have been developed, research on rat endometrial organoids remains limited. Given that rats can better simulate certain endometrial pathologies, such as intrauterine adhesions, this study aimed to establish rat endometrial organoids. We present a detailed protocol for the isolation and culture of rat endometrial epithelial stem cells (reESCs) and the generation of rat endometrial organoids. Using a refined reESCs expansion medium, we successfully isolated and stably expanded reESCs, demonstrating their long-term culture potential. The reESC-generated organoids exhibited typical structural and functional characteristics of the endometrium, including hormone responsiveness. Our results showed that rat endometrial organoids could be cultured over a long term with stable proliferation, maintaining the glandular structure, cell polarity, and functional characteristics of the endometrial epithelium. This novel rat-derived endometrial organoid model provides a valuable platform for studying endometrial diseases and testing therapeutic interventions, with potential applications across various mammalian species.

Here, we present a protocol to isolate and culture rat endometrial epithelial stem cells (reESCs), generating rat endometrial organoids. This method facilitates in vitro studies of endometrial diseases, enabling gene editing and other cellular manipulations.

Endometrial organoids offer valuable insights into the development and pathophysiology of endometrial diseases and serve as platforms for drug testing. ...

<meta charset="utf8"></head><body>胚の着床メカニズムを調査するための3Dプリントされた足場モデル

Co-culture Model Using Two Types of Adherent Cell Lines

Embryo implantation is affected by the interactions among different cell types in the mother-embryo interface. The direct and indirect communications between various cell types within the decidua are crucial for regulating endometrial receptivity; however, the molecular mechanisms mediating this interaction are still unclear. In this regard, a model to study the implantation process is needed to establish a comprehensive in vitro model that can recapitulate the biology of endometrial epithelium-stroma interaction. This model is composed of regular cell-culture plates and a matching scaffold, which is generated by three-dimensional (3D) printing from low-cost materials. Here, we detail a set of protocols for model construction, cell preparation, cell seeding, cell culture, observation, and evaluation. Furthermore, we have included representative results with cells exhibiting good growth conditions under the microscope. This study aimed to develop in vitro models that would mimic the interaction between endometrial stromal cells and epithelial cells, as well as between trophoblast cells and endometrial cells.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:上皮-間質および胚の相互作用を研究するためのin vitro子宮内膜モデル

The protocol shows a novel in vitro experimental model that can recapitulate the biology of two kinds of adherent cell lines with a three-dimensional (3D)-printed scaffold. The construction of this model and operating procedures, from cell preparation and cell culture to analysis and evaluation, are described.

2種類の接着細胞株を用いた共培養モデル

Embryo implantation is affected by the interactions among different cell types in the mother-embryo interface. The direct and indirect communications ...

子宮摘出標本から初代ヒト子宮内膜間質細胞の確立するための2つの方法

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マウス子宮内膜上皮と間質細胞の単離のために

婦人科腫瘍および乳がん腫瘍から癌幹細胞球体を取得する

エストロージェン体外用ひと子宮内膜間質細胞の分離

ソリッド検体からの原発性卵巣癌細胞を得る方法

多細胞ヒト初等子宮内膜オルガノイドの生成

ヒト腹腔器官培養における卵巣癌普及の初期段階のモデル化

マウス子宮からの3D子宮内膜オルガノイドの確立

Generation and Characterization of Rat Uterus Organoids from Rat Endometrial Epithelial Stem Cells

2種類の接着細胞株を用いた共培養モデル

2種類の接着細胞株を用いた共培養モデル