子宮内膜は、ホルモンに応答して毎月変化する組織です。ホルモンの不均衡は、胚の付着を防ぎ、また癌のような病気を引き起こす可能性があります。私たちのプロトコルは、生理学的な方法で女性の体の外で研究できるように子宮内膜を再構築します。
この技術の主な利点は、2つのホルモン応答性細胞タイプ、特に体のように組織化して振る舞う上皮細胞と間質細胞で構成される細胞の3D構造を提供することです。オルガノイドは組織の挙動をよりよく模倣することができるので、最終的には異なる薬物をテストするために使用することができます。子宮内膜オルガノイドは、肥満および多嚢胞性卵巣症候群を含む癌の現在知られている危険因子の直接的な影響を研究するために使用することができる。
私たちのオルガノイドは、2つの細胞タイプ間のパラクリン作用の重要性を強調しています。十分な量の組織から始めるのが重要です。上皮細胞と間質細胞の適切な密度を得ることは難しい場合があります。
また、オルガノイドは非常に小さく、IHC染色で視覚化するのが難しい場合があります。この手順の視覚化は、それらを見た後に理解しやすいいくつかのステップがあるため、重要です。これらには、子宮の適切な組織層を取得し、組み合わせる細胞の適切な密度を取得し、アガロース型を播種することが含まれます。
細胞分離を開始する前に、オルガノイドを収容するメーカーの指示に従って1.5%アガロースマイクロモールドを鋳造し、平衡化する。バイオセーフティキャビネットでは、無菌技術を使用して摂氏37度の酵素溶液を調製し、0.2マイクロメートルのシリンジフィルターを使用して溶液を15ミリリットルの円錐チューブにフィルターします。メスを使用して、子宮生検から子宮内膜を削り取り、組織を非常に小さな部分にミンチする。
酵素溶液を含む15ミリリットルの円錐管にみじん切りにしたての組織を入れる。キャップを閉じ、チューブの上部をワックスフィルムで包み、汚染を防ぎます。チューブを水浴またはインキュベーターに37°Cで30分間ゆっくりと揺さぶります。
この後、50ミリリットルの円錐チューブに20ミクロンの細胞ストレーナーの上に100ミクロンの細胞ストレーナーを積み重ねる。2つのストレーナーを通して溶液をフィルターします。HBSSで15ミリリットル円錐形チューブをリンスし、すべての細胞が収集されていることを確認するために、ストレーナーを通してこの洗浄を入れます。
その後、20ミクロンの細胞ストレーナーを新しい50ミリリットルの円錐形チューブに反転させ、1%ペニシリンとストレプトマイシンを補ったオルガノイド培地20ミリリットルで上皮細胞をストレーナーから洗い流します。円錐管を5分間500Gで遠心分離する。採取した間質細胞については、上清を取り除き、赤血球のリシスバッファーの10ミリリットルでペレットを再懸濁します。
摂氏37度で10~15分インキュベートします。これらの細胞を500Gで5分間遠心分離する。上清を取り除き、オルガノイド培地の200〜300マイクロリットルでペレットを再懸濁します。
収集した上皮細胞の場合は、上清を取り除き、オルガノイド培地の100マイクロリットルでペレットを再懸濁する。1.5%のアガロース型を平衡化した後、アガロース型の外側にあるオルガノイド培地を取り除き、アガロース皿の細胞播種室から培地を慎重に除去できるように組織培養板を傾ける。上皮細胞と間質細胞の懸濁液を顕微鏡で見て、懸濁液にオルガノイド培地を追加し、懸濁液が密度でほぼ等しくなるように一度に100マイクロリットルのみを添加するようにします。
次に、間質細胞の一部を上皮細胞の3つの部分と体積で組み合わせます。結合した細胞懸濁液のピペット50マイクロリットルをアガロース型の細胞播種チャンバーに入れる。アガロース型が細胞で満たされたら、24ウェルプレートの井戸に400マイクロリットルの新鮮なオルガノイド培地を慎重に加えます。
5%の二酸化炭素で摂氏37度でインキュベートし、オルガノイド培地500マイクロリットルで2日ごとに培地を交換するようにします。7日後, 上皮細胞と間質細胞の組織を促進するために 0.1 ナノモルエストラジオールと 0.8 ナノモルテストステロンを補うものに培地を変更します。.まず、沸騰させて1.5%のアガロースをPBSに溶解する。
液体アガロースを温水のビーカーに入れ、約50°Cまで冷却します。解剖顕微鏡の下で、24ウェルプレートを傾け、慎重にアガロース型の外側から培地をピペットアウトします。次に、アガロース型の内部から慎重に培地をピペットアウトし、オルガノイドを破壊することを避けます。
70~75マイクロリットルの暖かいアガロースをアガロース皿のチャンバーに慎重に加え、オルガノイドを乱さないと注意する。プレートを摂氏4度で5分間冷まします。この後、24ウェルプレートの各ウェルに4%パラホルムアルデヒドを加え、密閉されたアガロース型全体を摂氏4度で一晩固定します。
翌日、パラフィン埋め込み処理の準備が整うまで、プレートを摂氏4度で70%エタノールに保管します。RNAの単離を開始するには、解剖顕微鏡の下でプレートを見てください。プレートを傾け、慎重にアガロース型のチャンバーから培地をピペットアウトします。
新鮮なオルガノイド培地の1ミリリットルをアガロース型に直接強制的にピペット化して、オルガノイドがマイクロウェルから洗い流され、あまりにも多くの気泡を作り出さないように注意する。同じ媒体を使用して、この力強いピペット処理を一度繰り返します。この後、オルガノイドを含む培地をすべて収集する。
500Gで遠心分離機をオルガノイドを回収し、RNA抽出に進む。本研究では、内膜の上皮細胞および間質細胞から成るヒト子宮内膜オルガノイドは、外因性足場材料を使用せずに生成される。組織学的処理のために、子宮内膜オルガノイドを含むアガロース型はアガロースで密封され、続いて4%パラホルムアルデヒドを一晩で固定する。
これらの型は標準的なパラフィン埋め込み用に処理され、切断され、染色され、神学、蛍光免疫、または免疫体化学のために染色されます。エオシン染色におけるヘマトキシリンは、外側と中央の細胞の単層を有するスフェロイド様構造を明らかにする。子宮内膜細胞、上皮細胞、および間質細胞の細胞特異的マーカーは、中央に間質細胞を有するオルガノイドを取り巻く上皮細胞を明らかにする。
子宮内膜生理学のマーカーは、子宮内膜オルガノイドがネイティブ組織の特定の特徴を保持していることを確認する。コラーゲンブルーと細胞を赤く染色するトライクローム染色は、間質細胞が存在する中心内のコラーゲンの存在を示し、天然組織と同様の間質細胞によるコラーゲンの活性産生および分泌を示す。さらに、免疫ヒストリカル染色は、上皮細胞および間質細胞の両方にエストロゲン受容体、アンドロゲン受容体、およびプロゲステロン受容体の存在を明らかにする。
下流の実験に十分なオルガノイドを持つために、細胞を密にプレートすることが重要です。これはいくつかの練習を取るでしょう。子宮内膜オルガノイドは、異なる条件下で培養し、免疫組織化学や免疫蛍光染色などの実験のために収穫してタンパク質発現を研究したり、RNAが遺伝子発現を研究するために収穫したりすることができます。
私たちの研究室では、子宮内膜がホルモンレベルの変化にどのように反応するかを調査し、子宮内膜過形成や癌につながる可能性があります。これらのオルガノイドをホルモンの長期的な治療に使用し、多嚢胞性卵巣症候群に見られる過剰なテストステロンなどの病理学的条件を追加したり、脂肪細胞からのシグナルを使用して肥満誘発子宮内膜変化を研究することができます。ヒト組織は生体に有害であると考えられ、適切な予防措置を講じることが重要です。
