このプロトコルは、子宮内膜オルガノイドの培養のためにマウスの子宮から高純度の子宮上皮を分離するための段階的な方法論を示すため、重要です。この方法は、酵素的および機械的解離を効率的に利用して子宮上皮を単離する。これらの技術は、単離された上皮に由来する子宮内膜上皮オルガノイドを確立、治療、および分析するために合理化されました。
使用前にゲルマトリックスを氷上で約1〜2時間解凍することから始めます。次に、ハサミを使用して腹部を正中線切開し、皮膚をそっと剥がして下にある腹膜層を露出させることにより、安楽死させたマウスを解剖します。腹部脂肪パッドをそっと脇に動かして子宮角を見つけ、子宮頸管接合部で子宮角を保持してから、腸間膜脂肪に沿って切断します。
マウスの子宮を解剖した後、小さなハサミで子宮角から脂肪組織を完全に取り除きます。完了したら、各子宮角をそれぞれ約4〜5ミリメートルの小さな断片に切ります。1つの子宮からのすべての子宮片を、0.5ミリリットルの1%トリプシンを含む24ウェルプレートの1ウェルに入れる。
次に、24ウェルプレートを摂氏37度の加湿組織培養インキュベーターで約1時間インキュベートし、下にある間質から子宮内膜上皮を酵素的に分離します。インキュベーション後、子宮の破片を1ミリリットルのダルベッコリン酸緩衝溶液またはDPBSを含む35ミリメートルの組織培養プレートに移します。次に、子宮片片の一端を鉗子で保持し、ピペットチップを断片を縦方向に静かに走らせ、子宮管のもう一方の端から上皮を絞り出すことにより、解剖顕微鏡下で子宮上皮を子宮管から分離します。
次に、子宮片から分離した上皮シートを解剖顕微鏡で観察します。次に、1ミリリットルのピペットを使用して、すべての上皮シートを同じ1.5ミリリットルのチューブに静かに移します。解離した上皮シートを375 x gで5分間遠心分離することによりペレット化した。
細胞ペレットを乱すことなく上清を注意深く除去し、細胞ペレットを0.5ミリリットル/ミリリットルのコラゲナーゼと1ミリリットルあたり2ミリリットルのDNA溶液に再懸濁します。ピペットで上下に約10回、または単一細胞懸濁液が得られるまで行います。次に、0.5ミリリットルのDMEM F / 12と10%ウシ胎児血清またはFBSと抗生物質を加え、細胞を375 x gで5分間遠心分離します。
上清を除去し、1ミリリットルのDMEM/F12と10%FBSと抗生物質で細胞を再懸濁し、細胞を遠心分離します。準備ができるまでゲルマトリックスを氷の上に置きます。次に、遠心分離機細胞から上清を取り除き、気泡を導入せずにゲルマトリックスの20倍の体積を用いて細胞ペレットを再懸濁した。
ゲルマトリックス細胞懸濁液を室温で約10分間沈降させます。ゲルマトリックス細胞懸濁液が半固体ゲルになったら、先端が200マイクロリットルのワイドボアを有するP200マイクロピペットを使用し、25マイクロリットルのゲルマトリックス細胞懸濁液を穏やかに吸引します。12ウェルプレートのウェルあたり3つの別々の25マイクロリットルのドームを分注し、ゲルマトリックスを15分間硬化させ、摂氏37度の加湿組織培養インキュベーターで硬化させます。
ゲルマトリックスが硬化した後、ゲルマトリックスドームを含む各ウェルに750マイクロリットルのオルガノイド培地を加え、加湿組織培養インキュベーター内で摂氏37度でインキュベーターします。マウス子宮内膜オルガノイドの位相差画像は、上皮細胞と間質細胞分離により、反対の細胞型の汚染が10%〜15%以下のサンプルが得られることを示しました。子宮内膜上皮細胞は、3〜4日以内にオルガノイドに組み立てられました。
切片化したホルマリン固定パラフィン包埋子宮内膜オルガノイドをヘマトキシリン染色とエオジン染色で可視化し、オルガノイドの内腔である上皮と中空中心の単層を表示しました。蛍光顕微鏡イメージングは、オルガノイド中のすべての細胞がサイトケラチン8陽性であり、DAPIを含むことを示し、子宮内膜オルガノイドの固定、埋め込み、および処理が抗体ベースの免疫染色に適合することを示しています。リアルタイム定量PCRは、10ナノモルのエストラジオールによる刺激が上皮オルガノイドにおけるリポカリン2、ラクトフェリン、およびプロゲステロン受容体の発現を増加させることを示し、子宮内膜上皮オルガノイドを使用してエストラジオールに応答する遺伝子発現変化を測定することに成功したことを示しています。
機械的解離ステップ中に子宮内膜上皮の明確な分離が得られるようにすることが重要です。子宮管から出てくる上皮を観察できるはずです。他の方法には、ゲルマトリックスへの封入による上皮オルガノイドの樹立が含まれる。
必要に応じて、間質コンパートメントをさらに消化して、3D上皮間質共培養を作成することができます。この方法は、子宮内膜の再生を制御するシグナルに関する質問に答えるのに役立ちます。子宮内膜症、妊娠喪失、癌などの女性の病気の治療に役立つ可能性があります.
