著者らの研究室での作業は一般的な医学研究所（GM41628）からの助成金によってグレーターカンザスシティコミュニティ財団のヘレン·ネルソン医学研究基金からの医学研究のためのStowers研究所への補助金によってサポートされています。

全身またはFLAGエピトープタグINO80またはその他INO80複合体のサブユニットの変異型を発現するHEK293安定細胞株の1世代と文化<ol><li>全長または変異ヒトINO80 ATPアーゼまたはインフレーム、N末端FLAGエピトープタグを持つ哺乳動物発現ベクターpcDNA5 / FRTに別INO80サブユニットをコードするcDNAクローン。 </li><li>先に進む前に、DNA配列決定により挿入されたcDNAの配列を確認。 </li><li>トランスフェクションを行うために、DMEM（ダルベッコ改変イーグル培地）、5％のグルタミンを含有する培地中で10cmの組織培養皿中で、HEK293細胞でのFlpし、成長し、10％FBS（ウシ胎児血清）。 </li><li>細胞は、〜70％のコンフルエンシーに達したときに、総容積は、各組織培養皿に40適切なpcDNA5 / FRT発現プラスミドのFuGENE6トランスフェクション試薬μlの、0.5μgの、およびFlpリコンビナーゼリコンビナーゼをコードするpOG44を、9.5μgのの混合物を添加800μlに。 </li><li> 48時間後、トリプシン処理し、split 10cmの皿に1:30の比率で細胞、および3 5％グルタミン、10％FBS、および100μg/ mlのハイグロマイシンBを含むDMEM中でそれらを成長 - 4週間。 （ - 5日間、通常、3日毎）が黄色に回転し始めるたびに、培地を変更します。 </li><li> FLAG標識タンパク質の最高レベルを表す陽性クローンを同定するために、個別のハイグロマイシンB耐性コロニーを選択し、24ウェルプレートの単一のウェルに移す。 <ol><li>細胞を5分間、1,000×gでの遠心分離により〜1mlのPBS、ペレットに各ウェルから80％の密集度、収穫細胞に達すると。 </li><li>上清を除去した後、SDS-PAGE試料緩衝液60μlの中で細胞ペレットを再懸濁する。 </li><li> SDSページおよびFLAGの発現をモニターするためのウェスタンブロッティングに再懸濁細胞ペレットの件名半分はベイトタンパク質をタグ付け。今後の分析のために、残りの半分を保存します。 </li></ol></li><li>何FLAGタグ付きヒトINO80タンパク質は、細胞溶解物において検出されない場合、最初のクローン細胞POPUを展開15cmの組織培養皿に24ウェルプレートの単一のウェルから細胞をプレーティングすることによって、更に設置と。 <ol><li> 15cmの皿、50mlの円錐チューブに氷冷PBS中で、コンフルエント細胞に近い再懸濁し、転送から細胞を採取する。 </li><li>追加のPBSを添加することによって最終体積50mlにもたらす。 </li><li>ペレットを5分間、1,000×gで細胞および上清をできるだけ多く除去する。 </li><li> Lys450緩衝液（20mM HEPES-NaOHでpHを7.9、450 mMの塩化ナトリウム、0.5％トリトンX-100、10mMのKCl、4mMのMgCl 2を 、0.2mMのEDTA、10％グリセロール、1mMのDTT、1mlの細胞ペレットを再懸濁200μMのPMSF、および1：1,000プロテアーゼ阻害剤カクテル）。 注：ここでは、他の場所は、必ずすぐに実験を開始する前に、バッファに、DTT、PMSF、およびプロテアーゼ阻害剤カクテルを追加します。 </li><li>抗FLAGアガロースゲル20μlのを使用して、結果として全細胞溶解物から免疫沈殿物FLAGタグタンパク質、およびウェスタンブロッティングによってFLAG溶出液を分析します。 [IMMUNの詳細については、oprecipitation手順は、手順5を参照してください] </li></ol></li><li>希望クローン細胞株12の凍結ストックを準備し、使用するまで液体窒素中で保管してください。 </li></ol>ローラーボトル中で2成長するHEK293細胞株 INO80複合体の大規模調製のために、培養細胞を10 - 20ローラーボトル;各ローラーボトルからの典型的な収量は、パックされた細胞の約1 mlである。 <ol><li>各ローラーボトルに、ハイグロマイシンBをせずに200ミリリットルDMEM、5％のグルタミンおよび10％ウシ血清を追加</li><li>各ローラーボトルにシングルほぼコンフルエント15cmの皿からの細胞のすべてを転送する</li><li> 37℃ローラーボトルインキュベーターにローラーボトルを配置し、0.2 rpmで回転する。 </li><li>細胞は〜70％の集密度に達すると、捨てる、中を捨てる。 </li><li>各ボトルに〜氷50mlの冷PBSを追加します。水平にボトルを持ち、静かに細胞単層を緩め旋回。 </li><li> 250ミリリットルプラストに再懸濁した細胞を移しIC円錐ボトルや氷の上の場所。 </li><li>ボトルにボトルから順次に転送、追加のPBSでローラーボトルをすすぐ。リンス液はもはや明確な（典型的には約5瓶をリンスするために使用された後に）しない場合には、細胞懸濁液に加える。 </li><li> 10分間400×gでの遠心分離によって細胞をペレット化。 </li><li>静かに、PBS中で細胞を再懸濁シングル250ミリリットルコニカル瓶にそれらを組み合わせて、さらに処理するまで氷上に保つ。 </li></ol>もう一つのFLAGタグINO80のサブユニットを発現する細胞においてINO80のサブユニットの3 siRNA介在ノックダウン単一のサブユニットを欠いINO80 subcomplexesを得るためには、安定的にshRNAを発現するsiRNA処理した細胞または細胞からINO80複合体を精製するために、FLAG-免疫精製を使用しています。ここでいう「逆」のsiRNA（低分子干渉RNA）のトランスフェクションプロトコルは、15cmの皿で成長するHEK293細胞のために最適化される。プロトコルは、細胞や笙のシングル15cmのディッシュ用です必要な細胞の数に応じてそれに応じてスケールアップすることがULD。 siRNAで処理した細胞からINO80複合体の生化学的に有用な量を用意するためには、40 15cmの皿で増殖させた培養物まで拡張する必要があり;パックされた細胞ペレットを4ml - これらは、およそ2が得られる。 <ol><li>安定的に15cmの皿で近く密集するまでINO80複合体の所望のサブユニットを発現するHEK293細胞を成長させる。 </li><li> siRNAの再懸濁緩衝液の容積の追加（20ミリモルのKCl、6mMのHEPES、pHが7.5、および0.2mMのMgCl 2）で十分に凍結乾燥したsiRNAを含むチューブに対するsiRNAの50μMのストック溶液を調製した。ソリューションを上にピペットで数回上下およびsiRNAが完全に溶解されていることを確認するために室温で30分間ニューテーター上でインキュベートする。 </li><li> siRNAおよびトランスフェクション試薬を含むトランスフェクションカクテルを準備します。非常に穏やかに混合しながら低血清培地32μlのリポフェクタミンRNAiMAXトランスと、50μMsiRNAストック溶液10μlを混合し、のOpti-MEM 4ミリリットルに追加。アル低すべての試薬は、使用前に室温に平衡化する。 </li><li>室温で30分間、混合物をインキュベートする。 </li><li> FLP-でHEK293細胞を安定にトランスフェクションのために必要なINO80サブユニットを発現して準備します。 <ol><li> ステップ3.4のインキュベーションの間、RT PBSで一度15cmの皿で細胞を洗浄する。 </li><li> PBSを除去した後、彼らはプレートを持ち上げ始めるちょうどまで、1ミリリットルのトリプシンで細胞を処理。 </li><li>すぐに細胞をトリプシン処理し、穏やかに混合するために完全培地（DMEM + 5％グルタミン+ 10％FBS）の10ミリリットルを追加します。室温で5分間1,000×gでの遠心分離によって細胞を回収します。 </li><li> 〜4ミリリットル完全培地中に細胞ペレットを再懸濁し、血球計数器を用いて細胞を再懸濁カウント。 </li><li> 〜5.4×10 6 / mlの濃度に完全培地で細胞を希釈する。 </li></ol></li><li>各15cmの皿に、4ミリリットルのトランスフェクションカクテルに続いて15ミリリットル完全培地を追加します。培地およびトランスフェクションカクテルを確保するために、静かに旋回されthoroughly混合。最後に、細胞懸濁液1ミリリットルを追加し、再度均一に細胞を分散させるために穏やかに旋回。 </li><li> 37℃、5％CO 2インキュベーターで培養し、60時間後、静かに、氷冷PBS中で再懸濁細胞を培地を除去し、核抽出物を調製するためにすぐに進みます。 </li></ol>核抽出物4。準備この手順は、ディグナム13のプロトコルから変更されて、細胞ペレットを開始するのサイズに応じて拡大または縮小することができる。典型的には、パックされた細胞ペレット収率1mlの最終核抽出物を1ml。全ての緩衝液は氷冷でなければならず、適切なコールドルームが利用できない場合、すべてのステップは低温室で、または氷上で行うべきである。 <ol><li>核の単離： <ol><li>静かに、適切な大きさ（15または50ミリリットル）に細胞を移す4℃で10分間千×gで円錐管とスピンを卒業しました。 </li><li>上清を除去し、充填細胞ペルの体積を測定てみましょう。パックされた細胞の1mlを〜3×10 8個のHEK293細胞に相当する。 </li><li> 5充填細胞緩衝液Aのボリューム（1,000プロテアーゼインヒビターカクテル10のHEPES、pHは7.9、1.5のMgCl 2、10mMのKClおよびたて1のDTT、200μMのPMSFを加え、1）を追加します。穏やかにピペッティングすることにより細胞ペレットを再懸濁する。 </li><li>正確に10分間氷上でインキュベートする。 </li><li> 4℃で10分間、1,000×gで細胞をペレット、上清を除去します。 </li><li>細胞ペレットのサイズは、緩衝液A中でのインキュベーションの間に2倍まで増加するはず</li><li>緩衝液Aの2つの充填細胞体積の細胞を再懸濁し、適切なサイズのDounce組織ホモジナイザーに細胞懸濁液を移す。パックされた細胞の2ml未満で開始した場合、7ミリリットルホモジナイザーを使用します。 2のために - 4mlの詰まった細胞、15ミリリットルホモジナイザーを使用します。と詰まった細胞の10以上ミリリットルのために、40ミリリットルホモジナイザーを使用しています。 </li><li>ダウンスホモジナイザー国連のLOOSEガラス乳棒で細胞懸濁液を均質化ゴマ細胞の90％が1％トリパンブルーで陽性に染色。 </li><li> （ 材料/機器の表を参照）、JA-17または類似のローターで、4℃で20分間、25000×gで45ミリリットルの高速遠心管とスピンにサスペンションを転送します。 </li><li>核ペレットから、サイトゾルタンパク質または分画中に核から漏れタンパク質を含む上清を取り除く。 </li></ol></li><li>塩で核を抽出。 <ol><li>緩衝液C（20mMのHEPES、pHが7.9、25％グリセロール、1.5のMgCl 2、0.2mMのEDTA、および新たに添加1のDTT、200μMのPMSF、および1：1,000プロテアーゼインヒビターカクテル）が追加核ペレットに。血球容積（〜1×10 9個 ）を開始するごとに3ミリリットル、2.5 mlのBuffer Cを使う。 </li><li>ガラス棒またはピペットを用いて、チューブの壁から核ペレットを取り除くし、適切なサイズのダウンスホモジナイザーに混合物全体を移す。 </li><li>目を均質化することによって核を再懸濁LOOSE乳棒2打された電子の混合物である。 </li><li>チルドビーカーに再懸濁核分画を転送します。サスペンションが深い少なくとも0.5 cmのビーカーいっぱいになりますようにビーカーを選択してください。 </li><li>穏やかに氷上ピペットまたはガラス棒で懸濁液を攪拌しながら徐々5 M NaClを滴下することによって0.42 M NaClの懸濁液の塩濃度を増加させ、クロマチンまたは他の不溶性構造から核タンパク質を抽出する;一度すべての5M NaClが添加された、溶液は非常に粘性またはゲル状になるべきである。 M NaClを以下の式に従って0.42 MのNaClの最終濃度に溶液をもたらすために必要とされる5の体積を計算する。 <img alt="式（1）" fo:content-width="4.5in" src="/files/ftp_upload/51720/51720equation1.jpg" width="500" /></li><li>慎重にタイプ45のTi Oのためにタイプ70.1 Tiローターのために10ミリリットルのポリカーボネートチューブに、粘性の懸濁液を転送（または同等）、または70ミリリットルのポリカーボネートボトル同じようなローター（材料/機器の表を参照してください）​​R。 70ミリリットルのボトルを使用している場合は10ミリリットルチューブを使用する場合はキャップアセンブリをパラフィルムでしっかりとシール。 </li><li>ゆっくりと旋回装置を用いて30分間、4℃で密封されたチューブを揺する。 </li><li> 45型Ti又は4℃で12万×gで30分間、70.1 Tiローターでサンプルをスピン。 </li><li>シングルプラスチックチューブやボトルに上清を移す。この上清を核抽出物であり、ペレットは、クロマチンと他の核の破片が含まれています。 </li><li> 、使いやすい量に核抽出物を分割し、液体窒素中で凍結し、-80℃で保管してください。 </li></ol></li></ol>人間INO80またはINO80 Subcomplexes 5。免疫親和性精製<ol><li>凍結した核抽出、凍結した材料は、スラリーになるまで手の間ベンチやロールチューブに抽出物を含有する場所管を解凍します。抽出物が完全にトンになるまで、氷の上または低温室で試験管を置くhawed。 </li><li> 10ミリリットルのポリカーボネート超遠心管に解凍した核抽出物を移し、凍結 - 解凍サイクルの間に形成した沈殿物を除去するタイプ70.1 Tiローターまたは同等の4℃で2​​0分間、100,000×gでスピン。 </li><li> 15ミリリットルコニカルチューブに上清を移す。千プロテアーゼ阻害剤カクテル：1のDTT、200μMのPMSF、および1の最終濃度に新鮮DTT、PMSF、およびプロテアーゼ阻害剤カクテルを追加します。 </li><li> 、免疫精製のための抗FLAGアガロースを準備端は清潔なメスで切断した後のチップを用いてP200または類似のピペ​​ットを用いて、1.5mlのマイクロチューブに抗FLAGアガロースビーズの50％スラリー200μlのを転送するにはまたはかみそりの刃。 </li><li> 30秒間8,000×gで卓上微量遠心分離によりビーズをペレット。上清を除去し、Lys450緩衝液1ml中にビーズを再懸濁することによりビーズを洗浄し、30秒間8,000×gでビーズをペレット化。 Bを洗うさらに2回EADS。 </li><li>最後はきれいなメスまたはカミソリの刃と、同じチップを用いて、トランスファーで切断した後のチップを備えたP200または同様の調整可能なボリュームピペットを用いて、核抽出物を約100μlにおける洗浄し、抗FLAGアガロースビーズを再懸濁抽出物を含有する15ミリリットルコニカルチューブに再懸濁ビーズ。ビーズの全てまで数回繰り返す15mlチューブに移してきた。 </li><li>実験室での回転装置上でゆっくりと回転させながら、4℃で4時間抽出/ビーズ混合物をインキュベートする。オプション：混入DNAを除去するために25単位/ mlの濃度でベンゾナーゼ含めます。 </li><li> 4℃で5分間1,000×gでの遠心分離によってアガロースFLAGを収集します。 </li><li> 10ミリリットルLys450に再懸濁穏やかに旋回装置に揺らしながら、4℃で5分間インキュベート、洗浄する。 4℃で5分間千×gでビーズをペレット化。 </li><li> 1.5mlのマイクロチューブにLys450および転送ビーズ150μlの - 100に再懸濁。株式会社すべてのビーズをマイクロ遠心管に移しされるまで、Lys450150μlの - ntinueは100と15ミリリットルコニカルチューブを洗浄します。 </li><li>微量4℃で30秒間、8,000×gでビーズをスピンダウン。 1ミリリットルEB100緩衝液（10mM HEPES pHは7.9、10％グリセロール、100mMのNaCl、1.5mMのMgCl 2、0.05％トリトンX-100、および新たに添加1mMのDTT、200μMのPMSFで一回1ミリリットルLys450で三回以上洗浄し、1：1,000プロテアーゼ阻害剤カクテル）。 </li><li>結合したタンパク質を溶出するために、0.25 mg / mlの1×FLAGペプチドを含む200μlのEB100バッファーを追加します。ニューテーター上で4℃でそれぞれ30分間インキュベートする。 </li><li>微量4℃で30秒間、8,000×gでビーズをペレット化。新しいマイクロチューブに溶出INO80複合体を含む、上清を移し。 </li><li>溶出を4回繰り返し、一つのチューブにすべての上清をプールする。 </li><li>溶出されたタンパク質画分から残留FLAG-アガロースビーズを除去するために、空のスピンカラムを通して溶出液を通過させる。 </li><li>溶出したタンパク質画分を濃縮〜10倍超遠心フィルター装置（50,000分子量カットオフ）を使用して。 </li><li> FLAGペプチドを削除するには、2脱塩カラムを通して濃縮されたタンパク質画分を順次渡します。 </li><li>液体窒素中で凍結し、-80℃で保存し、20μlのアリコートに精製され、脱塩タンパク質画分を分割する。 </li><li>銀染色ゲル上またはウェスタンブロッティングによりINO80またはINO80のsubcomplexesのサブユニット組成を分析し、標準として既知濃度の組換えINO80サブユニットの調製物を用いて半定量的ウェスタンブロッティングによってそれらの濃度を推定する。 </li></ol>

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著者は、彼らが競合する金融利害がないことを宣言します。

高等真核生物から多サブ哺乳類のクロマチンリモデリング複合体の構造と機能の研究は、変異型サブユニットを含むか、完全に特定のサブユニットを欠いているような複合体の生化学的に有用な量を準備することの難しさによって妨げられてきた。技術的なハードルがいくつかあります：最初に、哺乳動物細胞における遺伝子操作は技術的に困難で時間がかかるしています。そのゲノムが容?...

進化的に保存されたSNF2ファミリークロマチンリモデリング複合体はクロマチン組織とDNAのアクセシビリティ1の重要な調節因子である。これらのリモデリング複合体は常にいくつかのケースでは、さまざまなアクセサリータンパク質で組み立て、マルチサブユニットの巨大分子集合体を形成し、中央SNF2様ATPアーゼサブユニットを含む。 ATP依存性クロマチンリモデリングプロセスの分子的詳細を研究するためには、複合体の活動サブユニットおよび/またはドメイン構造の所定のサブセットの寄与を理解することが重要である。このような分析は、特定のタンパク質サブユニットまたはドメイン構造を欠いている高度に精製された変異体の複合体を生成する能力が必要です。 ATP依存性クロマチンリモデリング複合体の以前の構造-機能研究が広く（参考文献1-4等参照）により、酵母ゲノムの優れた操作性に酵母モデル系に焦点を当てている。の保全を考えるオーソロガスモデリング複合体のうち、サブユニット組成と機能性、酵母リモデリング複合体の構造と機能の研究は、高等真核生物における対応に重要な洞察を提供してきました。それにもかかわらず、リモデリング複合体の中でかなりの種特異的な違いは、保存されたサブユニットの保存されたドメイン内の利得または種特異的サブユニットの喪失、保存されたサブユニットの種特異的なドメインの損益、および配列変動に起因する、存在します。このような差異は、原理的には高等真核細胞が新たな分子および細胞環境に適応する必要性によって駆動することができる。それはATP依存性クロマチンリモデリングプロセスの基本的なメカニズムに光を投げかけて、だけでなく、そのクロマチン構造メカニズムに貴重な洞察を提供することができませんという理由だけでこのように、高等真核生物のリモデリング複合体のサブユニットはヌクレオソームのリモデリングプロセスに寄与するかを理解することは、価値があるHIG内および遺伝子発現彼女の真核生物が規制されている。 これまでのところ、生化学的に定義されたクロマチンリモデリング複合体とsubcomplexesを得ることが困難に一部起因マルチサブ哺乳類のクロマチンリモデリング複合体の限られた構造的および機能的研究が行われている。私たちは、野生型またはINO80 5-7の変異型（ 図1）タグ付き免疫親和性精製を安定的にN末端​​FLAGエピトープを発現するヒト細胞から無傷INO80またはINO80 subcomplexesを調製するために使用される下記の手順を用いてこれらの問題を部分的に回避している。ヒト細胞から無傷INO80複合体を得るために、のFlp介在組換えを安定INO80複合体8-10のサブユニットをコードするFLAGエピトープタグ付きcDNAを発現するトランスジェニックHEK293細胞株を生成するために使用される。 INO80サブユニットの過剰発現がいくらか毒性であり得るため、単離および選択的共同下クローン細胞系を維持するために必要であるnditions大規模な細胞培養の増殖のために必要な多くの通路の間に安定した導入遺伝子発現を保証する。サブユニットのサブセットのみが含まれている小さなINO80のsubcomplexesを得るために、正常に2つのアプローチを使用した（ 図2A、B）。まず、当社は安定的に特定のサブユニット5との相互作用に必要なドメインを欠いているINO80の変異型を発現するHEK293 FLP-Inの細胞株を作製。または、siRNAによるノックダウンは、適切なFLAGタグINO80サブユニット（未発表データ）を発現する細胞から目的のサブユニットを枯渇させるために使用されます。最後に、人間INO80複合体を精製するために、FLAGアガロースベースのクロマトグラフィー11は、効果的に精製されたINO80またはINO80 subcomplexesを含む最終画分に細胞質ゾル汚染タンパク質の存在を減らし、核抽出物からINO80を含む画分を濃縮するために使用されます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="890">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Name of Reagent/Material</td>
			<td style="width:212px;">Company</td>
			<td style="width:147px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:173px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td style="width:212px;">Cellgro</td>
			<td style="width:147px;">10-013-CV</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutamax-I (stablized glutamine)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">35050-079</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>SAFC</td>
			<td style="width:147px;">12176C</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FuGENE6 transfection reagent&#160;&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td style="width:147px;">E2312</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hygromycin B, sterile in PBS</td>
			<td>AG Scientific</td>
			<td style="width:147px;">H-1012-PBS</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pcDNA5/FRT vector</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">V6010-20</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Flp-In HEK293 cells&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">R780-07</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">pOG44 Flp-Recombinase Expression Vector</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">V600520</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EZview&#160; Red ANTI-FLAG&#160; M2 Affinity Gel&#160;</td>
			<td style="width:212px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">F2426</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">calf serum</td>
			<td>SAFC</td>
			<td style="width:147px;">12138C</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TARGETplus SMARTsiRNA pool</td>
			<td>Dharmacon / Thermo Scientific</td>
			<td style="width:147px;">various</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5x siRNA resuspension buffer&#160;</td>
			<td>Dharmacon / Thermo Scientific</td>
			<td style="width:147px;">#B-002000-UB-100</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipofectamine RNAiMAX&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">13778</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Opti-MEM Reduced Serum Medium&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">51985-091</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS&#160;</td>
			<td style="width:212px;">Cellgro</td>
			<td style="width:147px;">45000</td>
			<td style="width:173px;">VWR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">TrypLE (trypsin)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">12604</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1x FLAG Peptide</td>
			<td style="width:212px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">F3290</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro Bio-Spin Chromatography Column</td>
			<td style="width:212px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:147px;">737-5021</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amicon Ultra Centrifugal Filter Device (50k MWCO)</td>
			<td style="width:212px;">Amicon</td>
			<td style="width:147px;">UFC805024&#160;</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zeba Desalting Columns&#160;</td>
			<td style="width:212px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:147px;">89882</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Anti-FLAG M2 antibody, mouse</td>
			<td style="width:212px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">F3165</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Anti-FLAG M2 antibody, rabbit</td>
			<td style="width:212px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">F7425</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td style="width:212px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">P8340</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">benzonase&#160;</td>
			<td>Novagen</td>
			<td style="width:147px;">70664</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;"></td>
			<td style="width:212px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Equipment</td>
			<td style="width:212px;">Company</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wheaton Dounce Tissue Grinders</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td style="width:147px;">06-435C&#160;</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">JS-4.2 rotor in a J6 centrifuge&#160;</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:147px;">339080</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">JA-17 rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:147px;">369691</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10 ml polycarbonate tubes&#160;</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:147px;">355630</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70 ml polycarbonate bottles&#160;</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:147px;">355655</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Type 45 Ti rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:147px;">339160</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Type 70.1 Ti rotor&#160;</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:147px;">342184</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Clay Adams Nutator Mixer</td>
			<td style="width:212px;">BD Diagnostics</td>
			<td style="width:147px;">15172-203&#160;</td>
			<td style="width:173px;">VWR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glas-Col Tube/Vial Rotator</td>
			<td style="width:212px;">Glas-Col</td>
			<td style="width:147px;">099A RD4512</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR thermal cycler PTC 200</td>
			<td>MJ Research</td>
			<td style="width:147px;">PTC 200</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">roller bottle incubator</td>
			<td style="width:212px;">Bellco biotechnology</td>
			<td style="width:147px;">353348</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Immobilon-FL Transfer Membrane 7 x 8.4</td>
			<td style="width:212px;">Millipore</td>
			<td style="width:147px;">IPFL07810</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">lubricated 1.5ml microcentrifuge tubes&#160;</td>
			<td style="width:212px;">Costar</td>
			<td style="width:147px;">3207</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and purification of human ino80 chromatin remodeling complexes and subcomplexes

INO80クロマチンリモデリング複合体は、ATP依存性ヌクレオソームのリモデリングを触媒することによってヌクレオソームのダイナミクスとDNAのアクセシビリティを調節する。人間INO80複合体は、触媒サブユニットとの複合体のアセンブリのための足場とを兼ねINO80、SNF2様ATPアーゼを含む14のタンパク質サブユニットから構成されています。他のサブユニットと、彼らはINO80複合体のクロマチンリモデリング活性に寄与するメカニズムの機能は、人間の細胞または異種発現系にINO80サブアセンブリを生成するという課題に一部、よくわかっていないままである。このJOVEプロトコルは、サブユニットまたはサブユニットのサブセットを欠いている人間INO80クロマチンリモデリングsubcomplexesの精製を可能にする手順について説明します。 N末端のFLAGエピトープはINO80するcDNAを安定的にタグ付けされたヒト胚腎臓（HEK）のFlp介在組換えを用いて293細胞株に導入される。 INO80複合体のサブユニットのサブセットがb側にある場合でeは削除された、人はこれらのサブユニットの組み立てに必要なプラットフォームを欠いている代わりに、変異体​​INO80タンパク質を発現。イベントでは、個別のサブユニットが枯渇する場合には、安定的にFLAGを発現するHEK 293細胞株に、このサブユニットをターゲットに1トランスフェクトするのsiRNAはINO80 ATPアーゼは、タグ付き。核抽出物を調製し、FLAG免疫沈降はINO80誘導体を含有するタンパク質画分を濃縮するために行われる。精製INO80のsubcomplexesの組成物は、その後、免疫ブロッティング、銀染色、および質量分析などの方法を用いて分析することができる。このプロトコルに従って生成INO80およびINO80 subcomplexesは、添付JOVEプロトコルに記載されているさまざまな生化学的アッセイを用いて分析することができる。ここに記載される方法は、任意の哺乳動物マルチサブユニットクロマチンリモデリングの構造的および機能的特性の研究及び改変する複合体に適合させることができる。

図1は 、生成、精製、およびヒトINO80 ATP依存性クロマチン再構築複合体を特徴付けるために使用される手順を要約したフローチャートを示す。 図2および図3に示すように、これらの手順は、それによってINO80の酵素活性にこれらの不足しているサブユニットの寄与のその後の生化学的な分析を可能にする、さまざまなサブユニットを...

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Generation and Purification of Human INO80 Chromatin Remodeling Complexes and Subcomplexes

このプロトコルは、野生型と人間INO80クロマチンリモデリング複合体の変異型を生成し、精製するための手順を説明します。エピトープはINO80サブユニットのバージョンが安定してHEK293細胞で発現されタグ付けされ、サブユニットの特定のセットを欠いている完全な複合体と複合体を、免疫親和性クロマトグラフィーによって精製される。

発生と人間INO80クロマチンリモデリング複合体とSubcomplexesの精製

INO80 chromatin remodeling complexes regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Human INO80 ...

generation-purification-human-ino80-chromatin-remodeling-complexes

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Biology

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DNA and Chromosome Structure

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9.7K ビュー.  Stowers Institute for Medical Research. このプロトコルは、野生型と人間INO80クロマチンリモデリング複合体の変異型を生成し、精製するための手順を説明します。エピトープはINO80サブユニットのバージョンが安定してHEK293細胞で発現されタグ付けされ、サブユニットの特定のセットを欠いている完全な複合体と複合体を、免疫親和性クロマトグラフィーによって精製される。 

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Purification and Visualization of Influenza A Viral Ribonucleoprotein Complexes

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A nucleoprotein (NP) into viral ribonulceoprotein particles (vRNPs). The influenza vRNPs are enclosed within the viral envelope. During cell entry, however, these vRNP complexes are released into the cytoplasm, where they gain access to the host nuclear transport machinery. In order to study the nuclear import of influenza vRNPs and the replication of the influenza genome, it is useful to work with isolated vRNPs so that other components of the virus do not interfere with these processes. Here, we describe a procedure to purify these vRNPs from the influenza A virus. The procedure starts with the disruption of the influenza A virion with detergents in order to release the vRNP complexes from the enveloped virion. The vRNPs are then separated from the other components of the influenza A virion on a 33-70% discontinuous glycerol gradient by velocity sedimentation. The fractions obtained from the glycerol gradient are then analyzed on via SDS-PAGE after staining with Coomassie blue. The peak fractions containing NP are then pooled together and concentrated by centrifugation. After concentration, the integrity of the vRNPs is verified by visualization of the vRNPs by transmission electron microscopy after negative staining. The glycerol gradient purification is a modification of that from Kemler et al. (1994)1, and the negative staining has been performed by Wu et al. (2007).2

The genome of the influenza A virus consists of eight separate complexes of RNA and proteins, termed viral ribonucleoprotein complexes (vRNPs). This paper describes the glycerol gradient purification and transmission electron microscopy visualization of influenza A vRNPs.

インフルエンザウイルスリボ核タンパク質複合体の精製と可視化

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A ...

生物学

Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of glucose monitoring and new insulin formulations, many individuals still develop devastating secondary complications. Pancreatic islet transplantation can restore near normal glucose control in diabetic patients 1, without the risk of serious hypoglycemic episodes that are associated with intensive insulin therapy. Providing sufficient islet mass is important for successful islet transplantation. However, donor characteristics, organ procurement and preservation affect the isolation outcome 2. At University of Illinois at Chicago (UIC) we developed a successful isolation protocol with an improved purification gradient 3. The program started in January 2004 and more than 300 isolations were performed up to November 2008. The pancreata were sent in cold preservation solutions (UW, University of Wisconsin or HTK, Histidine-Tryptophan Ketoglutarate) 4-7 to the Cell Isolation Laboratory at UIC for islet isolation. Pancreatic islets were isolated using the UIC method, which is a modified version of the method originally described by Ricordi et al 8. As described in Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue, human pancreas was trimmed, cannulated, perfused, and digested. After collection and at least 30 minutes of incubation in UW solution, the tissue was loaded in the cell separator (COBE 2991, Cobe, Lakewood, CO) for purification 3. Following purification, islet yield (expressed as islet equivalents, IEQ), tissue volume, and purity was determined according to standard methods 9. Isolated islets were cultured in CMRL-1066 media (Mediatech, Herndon, VA), supplemented with 1.5% human albumin, 0.1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 1 ml of Ciprofloxacin, 5 ml o f 1M HEPES, and 14.5 ml of 7.5% Sodium Bicarbonate in T175 flasks at 37&deg;C overnight culture before islets were transplanted or used for research.

Achieving high quality and appropriate quantity of human islets is one of the prominent prerequisites for successful islet transplantation. In this video, we describe step by step the procedures for human pancreatic islet isolation (part II: purification and culture of human islets) using a modified automated method.

人間の膵島単離：パートII：ヒト膵島の精製と​​文化

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

クーマシー有機溶媒および酢酸のないG - 250でゲル中のタンパク質の染色

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal (ICC) Network in Mice

The interstitial cells of Cajal (ICC) are mesenchymal derived "pacemaker cells" of the gastrointestinal (GI) tract that generate spontaneous slow waves required for peristalsis and mediate neuronal input from the enteric nervous system1. Different subtypes of ICC form distinct networks in the muscularis of the GI tract 2,3. Loss or injury to these networks is associated with a number of motility disorders4. ICC cells express the KIT receptor tyrosine kinase on the plasma membrane and KIT immunostaining has been used for the past 15 years to label the ICC network5,6. Importantly, normal KIT activity is required for ICC development5,6. Neoplastic transformation of ICC cells results in gastrointestinal stromal tumor (GIST), that frequently harbor gain-of-function KIT mutations7,8. We recently showed that ETV1 is a lineage-specific survival factor expressed in the ICC/GIST lineage and is a master transcriptional regulator required for both normal ICC network formation and for of GIST tumorigenesis9. We further demonstrate that it cooperates with activating KIT mutations in tumorigenesis. Here, we describe methods for visualization of ICC networks in mice, largely based on previously published protocols10,11. More recently, the chloride channel anoctamin 1 (ANO1) has also been characterized as a specific membrane marker of ICC11,12. Because of their plasma membrane localization, immunofluorescence of both proteins can be used to visualize the ICC networks. Here, we describe visualization of the ICC networks by fixed-frozen cyrosections and whole mount preparations.

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal ICC Network in Mice

The interstitial cells of Cajal (ICC) are the pacemaker cells of the gastrointestinal (GI) tract. They form complex networks between smooth muscle cells and post-ganglionic neuronal fibers to regulate GI contractility. Here, we present immunofluorescence methods cross-sectional and whole-mount visualization of murine ICC networks.

マウスにおけるカハール（ICC）ネットワークの間質細胞の可視化

The interstitial cells of Cajal (ICC) are mesenchymal derived "pacemaker cells" of the gastrointestinal (GI) tract that generate spontaneous slow waves ...

Preparation, Purification, and Characterization of Lanthanide Complexes for Use as Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging

Polyaminopolycarboxylate-based ligands are commonly used to chelate lanthanide ions, and the resulting complexes are 
useful as contrast agents for magnetic resonance imaging (MRI). Many commercially available ligands are especially useful because they contain 
functional groups that allow for fast, high-purity, and high-yielding conjugation to macromolecules and biomolecules via amine-reactive 
activated esters and isothiocyanate groups or thiol-reactive maleimides. While metalation of these ligands is considered common 
knowledge in the field of bioconjugation chemistry, subtle differences in metalation procedures must be taken into account when 
selecting metal starting materials. Furthermore, multiple options for purification and characterization exist, and selection of the most 
effective procedure partially depends on the selection of starting materials. These subtle differences are often neglected in published 
protocols. Here, our goal is to demonstrate common methods for metalation, purification, and characterization of lanthanide complexes 
that can be used as contrast agents for MRI (Figure 1). We expect that this publication will enable biomedical scientists to incorporate 
lanthanide complexation reactions into their repertoire of commonly used reactions by easing the selection of starting materials and 
purification methods.

We demonstrate the metalation, purification, and characterization of lanthanide complexes. The complexes described here can be conjugated to macromolecules to enable tracking of these molecules using magnetic resonance imaging.

磁気共鳴イメージングのための準備、精製、および造影剤として使用するための希土類錯体のキャラクタリゼーション

Polyaminopolycarboxylate-based ligands are commonly used to chelate lanthanide ions, and the resulting complexes are 
useful as contrast agents for ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

RNA精製によってクロマチンの単離（チャープ）

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Generation, Purification, and Characterization of Cell-invasive DISC1 Protein Species

Protein aggregation is seen as a general hallmark of chronic, degenerative brain conditions like, for example, in the neurodegenerative diseases Alzheimer's disease (A&beta;, tau), Parkinson's Disease (&alpha;-synuclein), Huntington's disease (polyglutamine, huntingtin), and others. Protein aggregation is thought to occur due to disturbed proteostasis, i.e. the imbalance between the arising and degradation of misfolded proteins. Of note, the same proteins are found aggregated in sporadic forms of these diseases that are mutant in rare variants of familial forms.
Schizophrenia is a chronic progressive brain condition that in many cases goes along with a permanent and irreversible cognitive deficit. In a candidate gene approach, we investigated whether Disrupted-in-schizophrenia 1 (DISC1), a gene cloned in a Scottish family with linkage to chronic mental disease1, 2, could be found as insoluble aggregates in the brain of sporadic cases of schizophrenia3. Using the SMRI CC, we identified in approximately 20 % of cases with CMD but not normal controls or patients with neurodegenerative diseases sarkosyl-insoluble DISC1 immunoreactivity after biochemical fractionation. Subsequent studies in vitro revealed that the aggregation propensity of DISC1 was influenced by disease-associated polymorphism S704C4, and that DISC1 aggresomes generated in vitro were cell-invasive5, similar to what had been shown for A&beta;6, tau7-9, &alpha;-synuclein10, polyglutamine11, or SOD1 aggregates12. These findings prompted us to propose that at least a subset of cases with CMD, those with aggregated DISC1 might be protein conformational disorders.
 Here we describe how we generate DISC1 aggresomes in mammalian cells, purify them on a sucrose gradient and use them for cell-invasiveness studies. Similarly, we describe how we generate an exclusively multimeric C-terminal DISC1 fragment, label and purify it for cell invasiveness studies. Using the recombinant multimers of DISC1 we achieve similar cell invasiveness as for a similarly labeled synthetic &alpha;-synuclein fragment. We also show that this fragment is taken up in vivo when stereotactically injected into the brain of recipient animals.

The generation, purification and cell invasion of intracellular, cytoplasmic full length DISC1 protein aggresomes from cell cultures and of a labeled, multimeric recombinant DISC1 protein fragment in E. coli are described. Cell invasiveness is shown for recipient cells in cell culture and for neurons in vivo after stereotactical brain inoculation.

細胞侵襲DISC1タンパク質種の生成、精製とキャラクタリゼーション

Protein aggregation is seen as a general hallmark of chronic, degenerative brain conditions like, for example, in the neurodegenerative diseases ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation (ChIP) and massively parallel sequencing can be utilized to identify the repertoire of mammalian DNA sequences bound by transcription factors in vivo. "Next-generation" genome sequencing technologies provide 1-2 orders of magnitude increase in the amount of sequence that can be cost-effectively generated over older technologies thus allowing for ChIP-seq methods to directly provide whole-genome coverage for effective profiling of mammalian protein-DNA interactions.
For successful ChIP-seq approaches, one must generate high quality ChIP DNA template to obtain the best sequencing outcomes. The description is based around experience with the protein product of the gene most strongly implicated in the pathogenesis of type 2 diabetes, namely the transcription factor transcription factor 7-like 2 (TCF7L2). This factor has also been implicated in various cancers.
Outlined is how to generate high quality ChIP DNA template derived from the colorectal carcinoma cell line, HCT116, in order to build a high-resolution map through sequencing to determine the genes bound by TCF7L2, giving further insight in to its key role in the pathogenesis of complex traits.

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

The combination of chromatin immunoprecipitation and ultra-high-throughput sequencing (ChIP-seq) can identify and map protein-DNA interactions in a given tissue or cell line. Outlined is how to generate a high quality ChIP template for subsequent sequencing, using experience with the transcription factor TCF7L2 as an example.

ハイスループットシーケンシングのための高品質クロマチン免疫沈降DNAテンプレート（チップ-SEQ）の生成

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and the control of gene transcription in the cell nucleus. The kindlins are ~75 kDa multidomain proteins and bind to an NPxY motif and upstream T/S cluster of the integrin &#946;-subunit cytoplasmic tail. The hematopoietically-important kindlin isoform, kindlin-3, is critical for platelet aggregation during thrombus formation, leukocyte rolling in response to infection and inflammation and osteoclast podocyte formation in bone resorption. Kindlin-3&#39;s role in these processes has resulted in extensive cellular and physiological studies. However, there is a need for an efficient method of acquiring high quality milligram quantities of the protein for further studies. We have developed a protocol, here described, for the efficient expression and purification of recombinant murine kindlin-3 by use of a baculovirus-driven expression system in Sf9 cells yielding sufficient amounts of high purity full-length protein to allow its biophysical characterization. The same approach could be taken in the study of the other mammalian kindlin isoforms.

Kindlins are fundamental to cell adhesion through integrins but studies of them have been hampered by the difficulty encountered in expressing them recombinantly in bacterial hosts. We describe here methods for their efficient production in baculovirus-infected insect cells.

生物物理学研究のための昆虫細胞からの効率的な生産と組換えマウスKindlin-3の精製

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

Biochemical Assays for Analyzing Activities of ATP-dependent Chromatin Remodeling Enzymes

Members of the SNF2 family of ATPases often function as components of multi-subunit chromatin remodeling complexes that regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Biochemically dissecting the contributions of individual subunits of such complexes to the multi-step ATP-dependent chromatin remodeling reaction requires the use of assays that monitor the production of reaction products and measure the formation of reaction intermediates. This JOVE protocol describes assays that allow one to measure the biochemical activities of chromatin remodeling complexes or subcomplexes containing various combinations of subunits. Chromatin remodeling is measured using an ATP-dependent nucleosome sliding assay, which monitors the movement of a nucleosome on a DNA molecule using an electrophoretic mobility shift assay (EMSA)-based method. Nucleosome binding activity is measured by monitoring the formation of remodeling complex-bound mononucleosomes using a similar EMSA-based method, and DNA- or nucleosome-dependent ATPase activity is assayed using thin layer chromatography (TLC) to measure the rate of conversion of ATP to ADP and phosphate in the presence of either DNA or nucleosomes. Using these assays, one can examine the functions of subunits of a chromatin remodeling complex by comparing the activities of the complete complex to those lacking one or more subunits. The human INO80 chromatin remodeling complex is used as an example; however, the methods described here can be adapted to the study of other chromatin remodeling complexes.

Here we describe biochemical assays that can be used to characterize ATP-dependent chromatin remodeling enzymes for their abilities to 1) catalyze ATP-dependent nucleosome sliding, 2) engage with nucleosome substrates, and 3) hydrolyze ATP in a nucleosome- or DNA-dependent manner.

ATP依存性クロマチンリモデリング酵素の活性を分析するための生化学的アッセイ

Members of the SNF2 family of ATPases often function as components of multi-subunit chromatin remodeling complexes that regulate nucleosome dynamics and ...