معتمدة كو BK وموستاتا RC من قبل هنري ديل زمالة السير من ويلكوم ترست وأندرسون، رولف ويدعمه مجلس البحوث الطبية (MRC). ويدعم فينك J من قبل ويلكوم ترست برنامج الدكتوراه لمدة 4 سنوات.

وظلت كل الفئران المستخدمة في بروتوكول التالي في ظروف خالية من مسببات الأمراض المحددة، وأجريت كافة الإجراءات وفقا للوائح المملكة المتحدة زارة الداخلية. 1. إعداد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد وسائل الاعلام 1 ساعة قبل الاستخدام (انظر الجدول رقم 1 وقائمة المواد لمزيد من التفاصيل) وقبل دافئة في 37 ° C حمام الماء لا يقل عن 10 دقيقة قبل الاستخدام. </li></ol> 2. زراعة الأمعاء الصغيرة (SI) Organoids ملاحظة: ما لم ينص على خلاف ذلك، يتم تنفيذ جميع حضانات عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 في حاضنة مرطب. المعدات والكواشف ملامسة الخلايا الحية يجب أن تكون معقمة. ما قبل ارتفاع درجات الحرارة لوحة زراعة الأنسجة أمر مهم لأنه يمنع مصفوفة الطابق السفلي (Matrigel أو BME) قطرات من الانتشار خارج عند البذر. أيضا، يجب أن تبقى المصفوفة الطابق السفلي على الجليد في جميع الأوقات. تخزينها في -20 درجة مئوية، وذوبان الجليدعلى الجليد قبل الاستخدام. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل الأقبية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لعزل الأمعاء الدقيقة تضحية الماوس وفقا للقواعد واللوائح الوطنية، ثم وضع الحيوان على ظهرها، ويغسل البطن مع الايثانول 70٪. إجراء شق طولي خط الوسط من الفخذ إلى عظمة القص. أولا، وقطع الجلد والنسيج تحت الجلد ثم. إزالة الأمعاء الدقيقة من الأعور إلى المعدة. أقبية معزولة عن الاثني عشر، الصائم واللفائفي يمكن استخدامها لثقافة عضي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الأمعاء الدقيقة المعزولة مع تبريد قبل الفوسفات مخزنة المالحة دون الكالسيوم أو المغنيسيوم (PBS0). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع الأنسجة في قطع 3-5 سم طويلة واستخدام مقص لقطع عليه فتح طوليا. نشر الأنسجة باستخدام ملقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كشط الزوائد باستخدام ساترة. سوف الحذر، الكثير من القوة تتسبب في الأنسجة المسيل للدموع، وسوف تقلل من العائد من الخبايا في الخطوات التالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الأنسجة لأنبوب 50 مل تحتوي على تبريده قبل PBS0 النقيبز ملقط. غسل شظايا الأنسجة من خلال اهتزاز قوي وتغيير PBS0. كرر 2-3x أو حتى يحول PBS0 أقل غائم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الأنسجة في أنبوب 50 مل تحتوي على 30 مل من PBS0 مع 1 ملم حمض ethylenediaminetetraacetic (EDTA) لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية على الأسطوانة أنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هزة بقوة الأنبوب ونقل الأنسجة لأنبوب 50 مل أخرى تحتوي على 30 مل من PBS0 مع 5 ملي EDTA. سوف 1 ملم EDTA الحل (سابقا تحتوي على الأنسجة) تحتوي على خليط من الخبايا والزغب. هذا جزء غير مناسب لزرع البذور من organoids لأنها غالبا ما تحتوي على نسبة عالية من الزغب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الأنسجة مزيد مدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية على الأسطوانة أنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هزة بقوة الأنبوب وجمع الحل في نظيفة أنبوب 50 مل. تأكيد وجود أقبية وتقدير عدد، على سبيل المثال، عن طريق عد الخبايا في 50 ميكرولتر بواسطة المجهر الضوئي. حساب حجم اللازمة للحصول 50-100 الخبايا ونقلها إلى 1.5 مل رالتعليم الأساسي للجميع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور في 300 x ج لمدة 5 دقائق. تجاهل طاف، resuspend وبيليه في 50 ميكرولتر من الطابق السفلي المصفوفة، والبذور في 24 لوحة جيدا قبل تحسنت. احتضان لوحة في ثقافة حاضنة الأنسجة ل5-15 دقيقة حتى تتصلب مصفوفة الطابق السفلي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تراكب مع 500 ميكرولتر المتوسطة ENR (انظر الجدول 1). ما يقرب من 24 ساعة بعد بذر organoids سوف تظهر الكيسي شكل جولة صغيرة وبعد 2-3 أيام أخرى في مهدها الهياكل تصبح مرئية. تغيير إلى وسائل الإعلام ENR جديدة كل 3 أيام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرور عضي ثقافات كل 7 أيام. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الركض والحفاظ Organoids <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على organoids عن طريق تحديث وسائل الاعلام كل 3 أيام والمرور 1: 3 أو 1: 5 والتجويف يصبح مليئة الخلايا الميتة، تقريبا كل 7 أيام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كسر الطابق السفلي مع مصفوفة قبة المتوسطة باستخدام 1 مل pipetman طرف وتحويلها من البئر إلى أنبوب 1.5 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ميكانيكيا فصل في organoids من خلال pipetting للpproximately 50X باستخدام غرامة (على سبيل المثال، 200 ميكرولتر) تقلب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور في 300 x ج لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل طاف و resuspend بيليه في الطابق السفلي 150-250 ميكرولتر من المصفوفة. البذور في مرحلة ما قبل درجة حرارة 24 لوحة جيدا (50 ميكرولتر من الطابق السفلي مصفوفة / جيد). قبل البذر ماصة مصفوفة الطابق السفلي إلى أعلى وأسفل مرة واحدة لمعطف جدار الحافة. ماصة ببطء لتجنب فقاعات والبذور في منتصف البئر لمنع مصفوفة الطابق السفلي من الانتشار خارج. هو المطلوب للحصول على قبة سرداب مصفوفة في وسط البئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان في حاضنة ثقافة الأنسجة ل5-15 دقيقة حتى تتصلب مصفوفة الطابق السفلي. تراكب مع 500 ميكرولتر سائل الإعلام ENR لكل بئر. </li></ol></li></ol> 3. ما قبل الإصابة علاج SI Organoids ويوضح الشكل 1 الإجراء التنبيغ: ملاحظة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الصرف ENR إلى ENRWntNic (انظر الجدول 1) المتوسط ​​وتنمو في organoids رالمتوسطة له مدة لا تقل عن 3 أيام أو حتى أنها تبنت التشكل الكيسي. Wnt3a يزيد من عدد الخلايا الجذعية وبانيت بينما نيكوتيناميد (NIC) يحسن كفاءة الثقافة. </li></ol> الإنتاج 4. الفيروسات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وهناك حاجة واحدة 150 مم طبق من خلايا البلاتين-E في العدوى. البذور حوالي 5 × 10 6 خلايا مع وسائل الإعلام 15-18 مل (DMEM + 10٪ FBS) في حضور بوروميسين (1 ميكروغرام / مل) وblasticidin (10 ميكروغرام / مل). بالنقل الخلايا بعد 2-3 أيام، وعندما وصلت إلى 70-80٪ confluency. تغيير متوسطة إلى DMEM + 10٪ FBS دون بوروميسين وblasticidin قبل ترنسفكأيشن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 30 ميكروغرام من الحمض النووي للفيروسات، وبناء 240 ميكرولتر من polyethylenimine (PEI) لفصل أنابيب تحتوي على 1 مل من غروب-MEM. خلط واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميع الحلين ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 20-30 دقيقة. يضاف خليط الكامل إلى المتوسط ​​الخلايا البلاتين-E ويهز بعناية بلاتالبريد لضمان التوزيع العادل للالمجمعات الحمض النووي PEI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا البلاتين-E مع خليط ترنسفكأيشن بين عشية وضحاها وتحديث المتوسطة في اليوم التالي. إبقاء الخلايا في الوسيلة الجديدة لمدة 2 أيام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع سوى المتوسطة في أنبوب فالكون 50 مل، وتمريرها من خلال 0.45 ميكرون تصفية وأجهزة الطرد المركزي في 8000 x ج في 4 درجة مئوية لمدة 12-16 ساعة. تجاهل طاف و resuspend بيليه في 250 ميكرولتر من تنبيغ المتوسطة (انظر الجدول 1). </li></ol> 5. عضي جزء التحضير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للإصابة واحد وهناك حاجة أيضا واحدة من 24 لوحة جيدا. كسر الطابق السفلي مع مصفوفة قبة المتوسطة باستخدام 1 مل pipetman طرف وتحويلها إلى أنبوب 1.5 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام غيض حجم الدقيقة (على سبيل المثال، 200 نصائح ميكرولتر) لتعطيل ميكانيكيا organoids من خلال pipetting ل(30-50x). فإن الحل يصبح غائما ويجب أن يكون هناك organoids كله مرئية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة، 900 x ج لمدة 5 دقائق<html> . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل طاف و resuspend بيليه في 500 ميكرولتر من ثقافة الخلية الصف البروتيني المؤتلف (على سبيل المثال، TrypLE). احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. التالية الحضانة التحقق من حجم شظايا عضي باستخدام المجهر الضوئي، عد عدد الخلايا في جزء. شظايا تحتوي على 5-10 خلايا مثالية. إذا كانت الغالبية العظمى من شظايا تحتوي على عدد أكبر من الخلايا ويمكن زيادة فترة حضانة من 2 دقيقة في المرة الواحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنهاء عملية التفكك من خلال إضافة 500 ميكرولتر من ENR المتوسطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة، 900 x ج لمدة 5 دقائق. إزالة طاف بيليه والحفاظ على الجليد أو 4 درجات مئوية. </li></ol> 6. فيروسات الرجعية تنبيغ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجمع بين شظايا عضي مع 250 ميكرولتر من الحل فيروسات (من القسم 4.5) في بئر واحدة من 48 لوحة جيدا. المزيج بلطف pipetting البطيء باستخدام 1 مل طرف pipetman. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ختم لوحة مع parafilm. </li></ol>ه &quot;&gt; 7. Spinoculation والتصفيحات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لوحة في 32 درجة مئوية، 600 x ج، لمدة 1 ساعة. إزالة بعناية Parafilm واحتضان لوحة في ثقافة حاضنة الأنسجة لمدة 6 ساعة. </li></ol> 8. البذر من شظايا المصابة عضي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل شظايا عضي المصابين وسائل الإعلام التنبيغ من البئر إلى أنبوب 1.5 مل، وتدور في 900 x ج لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل طاف ووضع الأنبوب الذي يحتوي على بيليه على الجليد لمدة 5 دقائق لتبرد. إضافة 100 ميكرولتر من الطابق السفلي مصفوفة و resuspend بيليه بواسطة pipetting ببطء صعودا وهبوطا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطرات بذرة &quot;الطابق السفلي مصفوفة -cell مزيج &#39;50 ميكرولتر في 24 لوحة جيدا الجديدة. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 5-15 دقائق حتى يتصلب الطابق السفلي المصفوفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة وسائط التنبيغ دون polybrene إلى الآبار واحتضان لوحة في حاضنة زراعة الأنسجة. تغيير وسائل الاعلام كل 2-3 أيام. </li></ol> 9. اختيار <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء حد ذاتهفصل من الكتاب المقدس بعد 2-3 أيام من خلال إضافة بوروميسين (1 ميكروغرام / مل) إلى وسائل الإعلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما بدأت شظايا لتشكيل organoids استبدال وسائل الإعلام مع وسائل الإعلام تنبيغ ENR تستكمل مع بوروميسين (1 ميكروغرام / مل). </li></ol> 10. بعد الإصابة علاج SI Organoids <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة transduced organoids وفقا ل&quot;الركض والحفاظ organoids&quot; بروتوكول (القسم 2.2.1). بعد 1-2 أسابيع من organoids SI سيستعيد هياكلها الناشئة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد ظهور الهياكل الناشئة لحث على التعبير عن ميرنا أو [كدنا] بإضافة 4 hydroxytamoxifen (4 OHT) في تركيز العمل من 1 ميكرومتر. لاحظ أن هذه الخطوة هي صالحة فقط في حالة استخدام ناقلات فيروسات من Addgene (pMSCV-loxp-dsRed-loxp-EGFP-بورو-WPRE (32702)، pMSCV-loxp-dsRed-loxp-3xHA-بورو-WPRE (32703)، وpMSCV -FLIP-بورو-dsRed-GFP-ميرنا (32704)) وorganoids التعبير عن لجنة المساواة العرقية-ERT2. </li></ol> 11. تأكيد العدوى وEXPRession / قمع الجينات في المصالح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا باستخدام ناقلات فيروسات من Addgene (32702، 32703 و 32704) ويمكن التأكد من كفاءة ترنسدوكأيشن من خلال رصد dsRed التعبير. وعلاوة على ذلك، فإن التعبير أو قمع الجينات في المصالح يمكن التأكد من البقعة الغربية، وذلك باستخدام GFP أو حاتمة 3xHA (لoverexpression الجينات) وQPCR (لضربة قاضية الجينات)، كما يتمثل في كو وآخرون 4. </li></ol>

<ol>
	<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li><li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+self-organizing+mini-guts+from+a+single+intestinal+stem+cell:+mechanism+and+applications.">Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications.</a> Science. 340, 1190-1194 (2013).</li><li>Stelzner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nomenclature+for+intestinal+in+vitro+cultures.+American+journal+of+physiology.">A nomenclature for intestinal in vitro cultures. American journal of physiology.</a> Gastrointestinal and liver physiology. 302, G1359-G1363 (2012).</li><li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures.">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nature. 9, 81-83 (2012).</li><li>Schwank, G., Andersson-Rolf, A., Koo, B. K., Sasaki, N., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+BAC+Transgenic+Epithelial+Organoids.">Generation of BAC Transgenic Epithelial Organoids.</a> PloS one. 8, e76871 (2013).</li><li>Mustata, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr4+is+required+for+Paneth+cell+differentiation+and+maintenance+of+intestinal+stem+cells+ex+vivo.">Lgr4 is required for Paneth cell differentiation and maintenance of intestinal stem cells ex vivo.</a> EMBO reports. 12, 558-564 (2011).</li><li>Lau, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr5+homologues+associate+with+Wnt+receptors+and+mediate+R-spondin+signalling.">Lgr5 homologues associate with Wnt receptors and mediate R-spondin signalling.</a> Nature. 476, 293-297 (2011).</li><li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+suppressor+RNF43+is+a+stem-cell+E3+ligase+that+induces+endocytosis+of+Wnt+receptors.">Tumour suppressor RNF43 is a stem-cell E3 ligase that induces endocytosis of Wnt receptors.</a> Nature. 488, 665-669 (2012).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5/R-spondin+axis.">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> The EMBO journal. 32, 2708-2721 (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+single+Lgr5++liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration.">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494, 247-250 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose. The authors have no conflict of interest declared.

<html> لتحقيق كفاءة عالية التنبيغ جوانب معينة حاسمة. واحد هو المعالجة المسبقة لorganoids ENRWntNic مع وسائل الإعلام إلى أن اعتماد شكل جولة الكيسي. وهذا يزيد من عدد الخلايا الجذعية، وبالتالي فرصة الحصول على التكامل مستقر من التحوير، وكذلك زيادة معدل بقاء organoids SI في جميع أنحاء الداخلي ترنسدوكأيشن. معلمة أخرى هي فترة حضانة التالية spinoculation. النتائج حضانة قصيرة جدا أو طويلة جدا في ضعف كفاءة ترنسدوكأيشن وبقاء الفقراء من organoids، على التوالي. الخطوة spinoculation ليست ضرورية على الرغم من أنها زيادة كبيرة في نسبة organoids transduced. أخيرا، فيروس عالية عيار هو المفتاح لالتنبيغ ناجحة. هذا يعتمد على نوع من التعبئة والتغليف خط الخلية والفيروسات. مزيج من البلاتين-E خط الخلية والفئران الفيروس الخلايا الجذعية (MSCV)، وجد لإنتاج عيار مرتفع بما يكفي لتنبيغ organoids. ve_content &quot;&gt; وفيما يلي نصائح لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها التي قد تساعد على تحقيق التنبيغ ناجحة. أولا، إذا كان ترنسفكأيشن خط خلية التعبئة والتغليف والفقراء، تأكد من أن confluency من الخلايا ما بين 70-80٪ وأن فترة حضانة لل خليط مجمع PEI الحمض النووي بين 20-30 دقيقة. إن بقاء organoids خلال التنبيغ يعتمد إلى حد كبير على حجم قطعة. يسبب trypsinization طويل جدا معظم أجزاء تتألف من أقل من 3 خلايا وبالتالي يقلل البقاء مشابه للعضو. عامل آخر هو نشاط WNT المتوسطة مكيفة، إذا كان النشاط منخفضة جدا يعزز ذلك من خلال إضافة CHIR99021 في تركيز العمل من 5 ميكرومتر يمكن أن تزيد من البقاء على قيد الحياة. يمنع CHIR99021 GSK3، مما أدى إلى زيادة الإشارات WNT. وعلاوة على ذلك، Y-27362، والذي يمنع يضاف anoikis إلى وسائل الإعلام التنبيغ لتحسين البقاء على قيد الحياة عضوي الشكل، منذ تتعطل وorganoids إلى شظايا (1-10 تحتوي على خلايا) قبل ترنسدوكأيشن. و60، المذكورة أعلاه، ينبغي أن فترة حضانة بعد spinoculation لا تتجاوز 6 ساعة. وأخيرا، إذا لوحظ ضعف التنبيغ ينبغي النظر في العوامل المذكورة أعلاه التأثير على عيار الفيروسي والحد من حجم إدراج لناقلات فيروسات. كفاءة ضربة قاضية تعتمد بشكل كبير على ميرنا. منذ كفاءة يختلف مع مزيج من الجينات المستهدفة وميرنا يجدر أداء شاشة الكفاءة لتحديد تلك التي تعمل على أفضل وجه. وتقتصر هذه التقنية على الظواهر الظهارية للنظام مشابه للعضو. في المستقبل قد يكون من الممكن لدراسة الأمراض المعدية أو بوساطة جهاز المناعة من خلال ثقافة مشتركة من مسببات الأمراض أو إعادة مع مكونات مشتقة من الجهاز المناعي، على التوالي. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تحمل الفيروسات القهقرية فقط إدراج من حجم صغير نسبيا. بالتالي، لا بد من استبعاد المناطق التنظيمية التي تحدث بشكل طبيعي، وبالتالي التعبير عن التحوير لا يمكن أن تحاكي منالجين الذاتية. كما ذكر أعلاه، وكفاءة ضربة قاضية تعتمد على الجينات المستهدفة وميرنا. إذا لم يكن هناك ميرنا بكفاءة ضربة قاضية مناسبة يمكن العثور عليه قد تحد من استخدام هذه التقنية لهذا الجين المستهدف معين. نظريا، organoids متوافقة مع جميع تقنيات التلاعب موحدة تستخدم في خطوط الخلايا. كان تنبيغ فيروسات الأسلوب الأول ورود أنباء عن 4، ومؤخرا أصبح BAC (كروموسوم اصطناعي البكتيرية) -transgenesis المتاحة 5. يبلغ مجموع الوقت جيل من 2-3 أسابيع، وبعد ترنسفكأيشن من البلازميد الفيروسي في خط خلية التعبئة والتغليف، وهو أسرع بكثير من جيل لالمعدلة وراثيا (TG) الماوس. من خلال الحفاظ على الجسم الحي في سرداب-زغابة العمارة في حين تحتوي الخلايا الجذعية وكذلك جميع الأنساب الخلايا المتمايزة للظهارة المعوية، ونظام الثقافة عضوي الشكل يسد الفجوة بين الحيوان TG وزراعة الخلايا المستخدمة سابقا. <pالطبقة = &quot;jove_content&quot;&gt; بروتوكول الموصوفة هنا يوفر طريقة لإجراء تحليل المظهري من الأديم الباطن ظهارة في المختبر من خلال gain- وloss- الدراسات ظيفة. وهذا يجعل من الممكن لمعالجة المسائل ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية في البالغين بيولوجيا الخلايا الجذعية، مع ضرورة الحد الأدنى من الفئران TG. على سبيل المثال، جيل من الفئران خروج المغلوب الشرطية يمكن تجنبها باستخدام organoids المستمدة من المسوخ حديثي الولادة مع الفتك فترة ما حول الولادة 6. بالإضافة إلى ذلك، هذه التقنية يمكن تطبيقها على organoids المستمدة من الفئران خروج المغلوب المحددة سابقا لدراسة دور paralogues عن طريق أداء 7،8 ضربة قاضية إضافية. بعد إنشاء organoids الأمعاء الصغيرة، والتكيف البروتوكول الثقافة الأصلي سمح لزراعة البنكرياس والكبد والقولون والمعدة ظهائر 9-11. وعلاوة على ذلك، تم اشتقاق organoids الأمعاء البشرية وorganoids الورم الخزعات الإنسان العادي، عدن الأساسيOMA وسرطان القولون والمستقيم الخزعات 10. يمكن تمديدها بسهولة بالغة بروتوكول عدوى فيروسية لهذه الأنواع من organoids ويوفر وسيلة غير مسبوقة من إجراء دراسات وظيفية في الأنسجة البشرية المستمدة. أخذت معا، تنبيغ فيروسات من organoids الأمعاء الصغيرة مصدرا قيما للتحقيق في صيانة الخلايا الجذعية، والتمايز، وقرار مصير الخلية، وكذلك إشارات الخلية والخلية الخلوي التفاعلات.

وهناك حاجة الإنتاجية العالية الوراثة وظيفية لزيادة التفاهم البيولوجي لدينا من الجسم، لتحسين العلوم الأساسية والطب الحالي. وكانت الوراثة الماوس معيار الذهب للتحقيق وظيفة الجينات في الجسم الحي، على الرغم من أنه يتطلب وقتا طويلا ومكلفا. خطوط الخلايا، ويجري اختيار المشتركة الأخرى، لديها قدرة إنتاجية أعلى بينما تكون أقل تكلفة. ومع ذلك، يتم عرقلة من قبل عدم قدرتهم على إنتاج المكروية المناسبة وبالتالي الاستجابات الفسيولوجية ينظر في الجسم الحي. وبالتالي، هناك حاجة لا لبس فيها لنظام نموذج سهل التعامل، والذي يسمح التكلفة / الوقت كفاءة إنتاجية عالية التحليل حين محاكاة الاستجابات الفسيولوجية في الجسم الحي لوحظ في التجارب المعدلة وراثيا (TG) الماوس. لظهارة الأديم الباطن نظام واحد نموذج من هذا القبيل ظهر في عام 2009 1. بين المعرفة المكتسبة من اكتشاف الخلايا الجذعية المعوية Lgr5 إيجابية ومعلومات حول مكانة المقابلة لمصفوفة العوامل والنمو خارج الخلوية اللازمة لصيانة الخلايا الجذعية. استخدام هذه المعلومات أصبح من الممكن إنشاء &quot;-الشجاعة الصغيرة&quot; المعروف أيضا باسم organoids 2. مؤخرا تم اقتراح تسمية الإجماع عليها في المختبر الثقافات، حيث يشار إلى organoids باسم &#39;enteroids&#39;، 3. مثل خطوط الخلايا، وorganoids تتوسع من نوعها وسهلة لعلاج بروابط مع ومثبطات. ومع ذلك، بدلا من أن تكون ثنائية الأبعاد هم هياكل ثلاثية الأبعاد التنظيم الذاتي التي تحتفظ المنظمة سرداب-زغابة وكذلك الخلايا الجذعية والأنساب خلية متمايزة من الأمعاء الدقيقة (SI). Organoids تتكون من طبقة واحدة من الخلايا الظهارية التي تحيط منطقة اللمعية. جاحظ الهياكل مهدها تتوافق مع الخبايا المعوية صغيرة تحتوي على مقصورة الخلايا الجذعية. بدءا من غيض من هيكل الناشئين الخلايا الاصلية تفرق لأنها ميلصر نحو بطانة الظهارية، حيث يتم تسليط خلايا متباينة عضال في التجويف. بالمقارنة مع خطوط الخلايا، وهذا النظام خارج الحي يلخص بشكل وثيق فسيولوجيا العادي وبالتالي فهو نظام نموذجي واعد للظهارة الأمعاء الصغيرة. في هذا الفيديو من بروتوكول تنبيغ فيروسات، فإننا نقدم وسيلة تمكن فيفو السابقين دراسات وظائف الجينات في هذا النظام مشابه للعضو ثقافة الرواية. نبدأ بوصف عضي الثقافة بطريقة خطوة بخطوة، والاستمرار من خلال إظهار جيل من الفيروسات القهقرية تليها الإجراء ترنسدوكأيشن. وأخيرا، هناك قسم للمشورة إضافية لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها. ميزة هذا الأسلوب هو أنه يمكن الجمع بين التصوير الحي أو فحص المخدرات لدراسة التوازن والقرارات مصير الخلية والتفاعلات خلية خلية في الظهارة المعوية. بسبب عمارتها البسيطة ومعدل دوران سريع، organoids تمثل نموذجا مثاليا قystem لدراسة بيولوجيا الخلايا الجذعية البالغة. وبالإضافة إلى ذلك يمكن تطبيق تنبيغ فيروسات لorganoids المستمدة من الفئران المعدلة وراثيا مقررة سلفا وكذلك عينات من المرضى الإنسان. مع اقتراب الضربة القاضية في واضعا التدريجي لا يمكن أن يمتد إلى البشر، وorganoids الإنسان SI يشكل بديلا جذابا. وباختصار، من خلال التلاعب الجيني تنبيغ فيروسات يسمح تحليل المظهري في organoids الأمعاء الصغيرة المستمدة من الفئران أو عينات الأنسجة البشرية، وبالتالي استكمال الوراثة الماوس وخطوط الخلايا أثناء فتح آفاقا جديدة للدراسات في الأنسجة البشرية المستمدة. تنبيغ فيروسات يمكن gain- والدراسات الخسارة من وظيفة التي يتعين القيام بها في نظام الثقافة عضوي الشكل 4. هذا يجعله مصدرا قيما للتحقيق وظيفة الجين، الكبار بيولوجيا الخلايا الجذعية والمرض في حين يجري وفقا لثلاثة روبية (تخفيض، والصقل، واستبدال).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1090">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:220px;">Advanced DMEM/F12&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">12634-034</td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Glutamax 100x&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">35050-068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Hepes 1M&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Penicillin- Streptomycin 100x</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">B27 supplement 50x</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">N2 supplement 100x&#160;</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">n-Acetylcysteine 500 mM&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">mouse EGF 500 &#181;g/ml</td>
			<td>Invitrogen Biosource</td>
			<td>PMG8043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">mouse Noggin 100 &#181;g/ml&#160;&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">R-Spondin conditioned medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The conditioned media is generated&#160; from HEK293 cells, for details see Sato and Clevers 2013</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Wnt conditioned medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The conditioned media is generated&#160; from L cells, for details see Sato and Clevers 2013</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Nicotinamide 1 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Y-27632 10 &#181;M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polybrene 8 &#181;g/ml)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9268-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;">Standard BD Matrigel matrix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356231</td>
			<td style="width:595px;">Basement Matrix Extract (Cultrex PathClear BME Reduced Growth Factor Type 2, 3533-005-02 ) 
			supplied by AMSBIO can be used as an alterntive.</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:220px;">24 well plate</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>662960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">48 well plate</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>677980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">CHIR99021</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3734-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Platinum- E cells</td>
			<td>Cell biolabs</td>
			<td>RV-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Puromycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A1113802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">Blasticidin</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A1113902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">Polyethyleneimine (PEI)</td>
			<td style="width:157px;">Polysciences</td>
			<td style="width:119px;">23966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">opti-MEM</td>
			<td style="width:157px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">51985-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">TrypLE</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">Parafilm</td>
			<td style="width:157px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P7793-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">4-OHT</td>
			<td style="width:157px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H7904</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture

الخلايا الجذعية Lgr5 إيجابية يمكن أن تستكمل مع نمو أساسي العوامل صندوق تعديل العولمة الأوروبي، كوز صغير، وR-Spondin، والذي يسمح لنا أن ثقافة أي وقت مضى توسيع هياكل الظهارية 3D الأولية في المختبر. كل من الهندسة المعمارية والفسيولوجية خصائص هذه &quot;الشجاعة-مصغرة&quot;، كما دعا organoids، تشبه نظرائهم في الجسم الحي. وهذا يجعلها نظام نموذجا جذابا للظهارة الأمعاء الصغيرة. باستخدام تنبيغ فيروسات، وعلم الوراثة وظيفية ويمكن الآن أن يقوم بها overexpression الجين المشروط ضربة قاضية. يوضح هذا الفيديو الإجراء الثقافة عضي، وتوليد الفيروسات القهقرية، وتنبيغ فيروسات من organoids لمساعدة تحليل المظهري للظهارة المعوية صغيرة في المختبر. هذا النظام نموذج عضوي النمط رواية بالاشتراك مع فيروسات التعبير الجيني بوساطة يوفر أداة قيمة للتحليل السريع للوظيفة الجينات في المختبر دون الحاجة إلى costlجيل نعم وتستغرق وقتا طويلا للحيوانات المعدلة وراثيا.

Organoids جاهزة للتقسيم عند مظلمة التجويف المركزي بسبب وجود الخلايا الميتة (الشكل 2). بعد 2-3 أيام من organoids قبل المعالجة ينبغي أن تعتمد التشكل الكيسي جولة (الشكل 3). وهذا يزيد من عدد الخلايا الجذعية، وتعزيز فرص الحصول على التكامل مستقر. حجم بيليه الفيروسي قد تختلف التالية الطرد المركزي من طاف الفيروسي، وعلى الأرجح بسبب مساهمة متفاوتة من الحطام الخلية إلى حجم بيليه. وقد لوحظ عدم وجود ارتباط واضح على كفاءة ترنسدوكأيشن. خلال إجراءات الاختيار organoids غير transduced سيموتون، في حين أن تلك التي لديها سيبقى التكامل مستقر. بروتين فلوري من الارتجاعي MSCV-EGFP يمكن ملاحظتها في الخلايا الناشئة من الباقين على قيد الحياة organoids، والتي لها التشكل الكيسي، ضمن 2-3 أيام بعد التنبيغ (الشكل 4). <img alt<html> = &quot;الشكل 1&quot; FO: محتوى العرض = &quot;6in&quot; SRC = &quot;/ الملفات / ftp_upload / 51765 / 51765fig1highres.jpg&quot; العرض = &quot;600&quot; /&gt; الشكل 1. الرسم التخطيطي الإجراء تنبيغ فيروسات. قبل organoids العدوى تستخدم ENRWntNic إلى أن اعتماد بنية الكيسي (الخطوة 1) ما قبل المعالجة. وتستخدم خلايا البلاتين-E كخط خلية التعبئة والتغليف، ويتم تربيتها حتى تصل إلى 70-80٪ confluency. بعد ذلك و transfected أنهم مع بناء فيروسات باستخدام PEI. ويتم حصاد الفيروسات في وقت لاحق 2 أيام (الخطوة 2). وtrypsinized Organoids للحصول على شظايا تحتوي على 1-10 الخلايا (الخطوة 3)، ثم يصاب (الخطوة 4). spinoculation التالية لزيادة كفاءة العدوى (الخطوة 5)، والمصنف شظايا عضي المصابة (الخطوة 6) و 2-3 أيام في وقت لاحق اختيار الحيوانات المستنسخة إيجابية مع التكامل مستقر يمكن أن يؤديها (الخطوة 7). 1765fig2highres.jpg &quot;العرض =&quot; 500 &quot;/&gt; الشكل 2. الصورة التمثيلية للorganoids بعد 4-6 أيام من الثقافة. يتم تعبئة التجويف مع الخلايا الميتة، مما يجعلها تبدو مظلمة. Organoids في هذه المرحلة هم على استعداد لتكون passaged. <img alt="الرقم 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51765/51765fig3highres.jpg" width="500" /> الرقم 3. الصورة التمثيلية للorganoids الأمعاء صغير مثقف في ENRWntNic سائل الإعلام لمدة 3-4 أيام، وorganoids اعتماد التشكل الكيسي. <img alt="الرقم 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51765/51765fig4highres.jpg" width="500" /> الرقم 4. الصورة التمثيلية للorganoids الأمعاء الصغيرة (أ) أن تظهر الفيروسي التعبير التحوير (ب، EGFP). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> أدفاnced DMEM / F12 + + + </td></tr><tr><td colspan="2"> تخزينها في 4 درجة مئوية لمدة 4 أسابيع </td></tr><tr><td> متقدم DMEM / F12 </td><td> 500 مل </td></tr><tr><td> Glutamax 100X </td><td> 5 مل </td></tr><tr><td> HEPES 1 M </td><td> 5 مل </td></tr><tr><td> المضادات الحيوية 100X </td><td> 5 مل </td></tr><tr><td colspan="2"> ENRWntNic المتوسطة (20 مل) </td></tr><tr><td colspan="2"> تخزينها في 4 درجة مئوية لمدة 2 أسابيع </td></tr><tr><td> DMEM متقدم / F12 + + + </td><td> 7.2 مل </td></tr><tr><td> ملحق B27 (50X) </td><td> 400 ميكرولتر </td></tr><tr><td> N2 ملحق (100X) </td><td> 200 ميكرولتر </td></tr><tr><td> ن أسيتيل (500 ملم) </td><td> 50 ميكرولتر </td></tr><tr><td> الماوس EGF (500 ميكروغرام / مل) </td><td> 2 ميكرولتر </td></tr><tr><td> الماوس كوز صغير (100 ميكروغرام / مل) </td><td> 20 ميكرولتر </td></tr><tr><td> R-Spondin كونديتioned المتوسطة </td><td> 2 مل </td></tr><tr><td> Wnt3a المتوسطة مكيفة </td><td> 10 مل </td></tr><tr><td> نيكوتيناميد (1 M) </td><td> 200 ميكرولتر </td></tr><tr><td colspan="2"> التنبيغ المتوسطة (20 مل) </td></tr><tr><td colspan="2"> إعداد جديدة </td></tr><tr><td> ENRWntNic المتوسطة </td><td> 20 مل </td></tr><tr><td> Y-27632 (10 ميكرومتر) </td><td> 20 ميكرولتر </td></tr><tr><td> Polybrene (8 ميكروغرام / مل) </td><td> 20 ميكرولتر </td></tr><tr><td colspan="2"> ENR المتوسطة (20 مل) </td></tr><tr><td colspan="2"> تخزينها في 4 درجة مئوية لمدة 4 أسابيع </td></tr><tr><td> DMEM متقدم / F12 + + + </td><td> 17.4 مل </td></tr><tr><td> ملحق B27 (50X) </td><td> 400 ميكرولتر </td></tr><tr><td> N2 ملحق (100X) </td><td> 200 ميكرولتر </td></tr><tr><td> ن أسيتيل (500 ملم) </td><td> 50 ميكرولتر </TD&gt; </tr><tr><td> الماوس EGF (500 ميكروغرام / مل) </td><td> 2 ميكرولتر </td></tr><tr><td> الماوس كوز صغير (100 ميكروغرام / مل) </td><td> 20 ميكرولتر </td></tr><tr><td> R-Spondin المتوسطة مكيفة </td><td> 2 مل </td></tr><tr><td colspan="2"> وسائل الاعلام لخلايا البلاتين-E (500 مل) </td></tr><tr><td colspan="2"> تخزينها في 4 درجة مئوية لمدة 12 أسبوعا </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 449.45 مل </td></tr><tr><td> الجنين مصل بقري (FBS) </td><td> 50 مل </td></tr><tr><td> بوروميسين (1 ميكروغرام / مل) </td><td> 50 ميكرولتر </td></tr><tr><td> Blasticidin (10 ميكروغرام / مل) </td><td> 500 ميكرولتر </td></tr></tbody></table> الجدول تكوين 1. الاعلامي للمتقدم DMEM / F12 + + + المتوسطة ENRWntNic، تنبيغ المتوسطة، ENR المتوسطة والمتوسطة للخلايا البلاتين-E.

Watch this Scientific Journal Video about A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture at JoVE.com

A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

هذا البروتوكول يفسر-Lgr5 POSITVE الثقافة عضي الأولية والأداء اللاحق للتنبيغ فيروسات. وهذا يتيح overexpression جنة المساواة العرقية، أو محرض ضربة قاضية من التحوير تسليمها ويسمح الدراسات الوظيفية التي يتعين الاضطلاع بها في الرواية في المختبر عضوي النمط نظام نموذجي.

بروتوكول الفيديو من عدوى فيروسات الرجعية في الابتدائية المعوية عضي الثقافة

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding ...

a-video-protocol-retroviral-infection-primary-intestinal-organoid

Research

JoVE Journal

Biology

29.5K Views.  University of Cambridge.  هذا البروتوكول يفسر-Lgr5 POSITVE الثقافة عضي الأولية والأداء اللاحق للتنبيغ فيروسات. وهذا يتيح overexpression جنة المساواة العرقية، أو محرض ضربة قاضية من التحوير تسليمها ويسمح الدراسات الوظيفية التي يتعين الاضطلاع بها في الرواية في المختبر عضوي...

Video: A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes (A. aegypti) and Infection Phenotype Determination

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of the virus in the mosquito tissues. This protocol is routinely used for studying mosquito-virus interactions, especially for identification of novel host factors that are able to determine vector competence. The entire experiment must be conducted in a BSL2 laboratory. Similar to Plasmodium falciparum infections, proper attire including gloves and lab coat must be worn at all times. After the experiment, all the materials that came in contact with the virus need to be treated with 75% ethanol and bleached before proceeding with normal washing. All other materials need to be autoclaved before discarding them.

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes A. aegypti and Infection Phenotype Determination

Once a gene is identified as potentially refractory for the dengue virus, it must be evaluated for it's role in preventing viral infections within the mosquito. This protocol illustrates how the extent of dengue infections of mosquitoes can be assayed. The techniques for growing up the virus in culture, membrane feeding mosquitoes human blood, and assaying viral titers in the mosquito midgut are demonstrated.

بروتوكول للعدوى حمى الضنك في البعوض (بعوض ألف) ، وتحديد النمط الظاهري العدوى

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of ...

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the inner ear (fig 1). Hair cells in the developing cochlea, which are the mechanosensory cells of the auditory system, are aligned in one row of inner hair cells and three (in the base and mid-turns) to four (in the apical turn) rows of outer hair cells that span the length of the organ of Corti. Hair cells transduce sound-induced mechanical vibrations of the basilar membrane into neural impulses that the brain can interpret. Most cases of sensorineural hearing loss are caused by death or dysfunction of cochlear hair cells.
An increasingly essential tool in auditory research is the isolation and in vitro culture of the organ explant 1,2,9. Once isolated, the explants may be utilized in several ways to provide information regarding normative, anomalous, or therapeutic physiology. Gene expression, stereocilia motility, cell and molecular biology, as well as biological approaches for hair cell regeneration are examples of experimental applications of organ of Corti explants.
This protocol describes a method for the isolation and culture of the organ of Corti from neonatal mice. The accompanying video includes stepwise directions for the isolation of the temporal bone from mouse pups, and subsequent isolation of the cochlea, spiral ligament, and organ of Corti. Once isolated, the sensory epithelium can be plated and cultured in vitro in its entirety, or as a further dissected micro-isolate that lacks the spiral limbus and spiral ganglion neurons. Using this method, primary explants can be maintained for 7-10 days. As an example of the utility of this procedure, organ of Corti explants will be electroporated with an exogenous DsRed reporter gene. This method provides an improvement over other published methods because it provides reproducible, unambiguous, and stepwise directions for the isolation, microdissection, and primary culture of the organ of Corti.

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti.

This procedure describes a method for the isolation and culture of the murine organ of Corti with or without the spiral limbus and spiral ganglion neurons. We also demonstrate a method for the expression of an exogenous reporter gene in the organ of Corti explant by electroporation.

الابتدائية الثقافة وElectroporation البلازميد الجهاز الفئران كورتي.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

العزلة والثقافة الأساسي في الخلايا الكبدية الجرذ

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Retroviral Infection of Murine Embryonic Stem Cell Derived Embryoid Body Cells for Analysis of Hematopoietic Differentiation

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for investigating the development of early hematopoietic progenitor cells (HPCs). Gene expression in ESCs can be manipulated by several techniques that allow the role for individual molecules in development to be determined. One difficulty is that expression of specific genes often has different phenotypic effects dependent on their temporal expression. This problem can be circumvented by the generation of ESCs that inducibly express a gene of interest using technology such as the doxycycline-inducible transgene system. However, generation of these inducible cell lines is costly and time consuming. Described here is a method for disaggregating ESC-derived embryoid bodies (EBs) into single cell suspensions, retrovirally infecting the cell suspensions, and then reforming the EBs by hanging drop. Downstream differentiation is then evaluated by flow cytometry. Using this protocol, it was demonstrated that exogenous expression of a microRNA gene at the beginning of ESC differentiation blocks HPC generation. However, when expressed in EB derived cells after nascent mesoderm is produced, the microRNA gene enhances hematopoietic differentiation. This method is useful for investigating the role of genes after specific germ layer tissue is derived.

Manipulating temporal gene expression in differentiating embryonic stem cells (ESCs) can be achieved using inducible gene systems. However, generation of these cell lines is costly and time consuming. This protocol achieves rapid expression of a transgene in differentiating ES-derived cells and subsequent analysis of downstream hematopoietic differentiation.

عدوى فيروسات الفئران الجنينية الجذعية المستمدة خلية خلايا الجسم مضغي لتحليل التمايز لدم

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for ...

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and composed of mature enterocytes, goblet cells and enteroendocrine cells; and crypts, residing proximal to the submucosa and the muscularis, harboring adult stem and progenitor cells and mature Paneth cells, as well as stromal and immune cells of the crypt microenvironment. Until the last few years, in vitro studies of small intestine was limited to cell lines derived from either benign or malignant tumors, and did not represent the physiology of normal intestinal epithelia and the influence of the microenvironment in which they reside. Here, we demonstrate a method adapted from Sato et al. (2009) for culturing primary mouse intestinal crypt organoids derived from C57BL/6 mice. In addition, we present the use of crypt organoid cultures to assay the crypt metabolic profile in real time by measurement of basal oxygen consumption, glycolytic rate, ATP production and respiratory capacity. Organoids maintain properties defined by their source and retain aspects of their metabolic adaptation reflected by oxygen consumption and extracellular acidification rates. Real time metabolic studies in this crypt organoid culture system are a powerful tool to study crypt organoid energy metabolism, and how it can be modulated by nutritional and pharmacological factors.

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Small intestinal crypt organoids cultured ex vivo provide a tissue culture system that recapitulates growth of crypts dependent on stem cells and their niche. We established a method to assay the metabolic profile in real time in primary mouse crypt organoids. We found organoids maintain physiological properties defined by their source.

تحليل الوقت الحقيقي ايض الملف في<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; الثقافات ماوس المعوية سرداب عضي

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and ...

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth factors. Since organoids are highly similar to the original tissue in terms of homeostatic stem cell differentiation, cell polarity and presence of all terminally differentiated cell types known to the adult intestinal epithelium, they serve as an essential resource in experimental research on the epithelium. The possibility to express transgenes or interfering RNA using lentiviral or retroviral vectors in organoids has increased opportunities for functional analysis of the intestinal epithelium and intestinal stem cells, surpassing traditional mouse transgenics in speed and cost. In the current video protocol we show how to utilize transduction of small intestinal organoids with lentiviral vectors illustrated by use of doxycylin inducible transgenes, or IPTG inducible short hairpin RNA for overexpression or gene knockdown. Furthermore, considering organoid culture yields minute cell counts that may even be reduced by experimental treatment, we explain how to process organoids for downstream analysis aimed at quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry. Techniques that enable transgene expression and gene knock down in intestinal organoids contribute to the research potential that these intestinal epithelial structures hold, establishing organoid culture as a new standard in cell culture.

In this video protocol we give a step by step explanation of lentiviral transduction in organoids of primary intestinal epithelium and of processing and downstream analysis of these cultures by quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry.

بروتوكول لLentiviral تنبيغ وتحليل المصب من المعوية Organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

عزل وثقافة الكرياتينية الماوس الرئيسية من حديثي الولادة والفأر الكبار الجلد

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Apoptosis Induction and Detection in a Primary Culture of Sea Cucumber Intestinal Cells

Primary cultured cells are used in a variety of scientific disciplines as exceptionally important tools for the functional evaluation of biological substances or characterization of specific biological activities. However, due to the lack of universally applicable cell culture media and protocols, well described cell culture methods for marine organisms are still limited. Meanwhile, the commonly occurring microbial contamination and polytropic properties of marine invertebrate cells further impede the establishment of an effective cell culture strategy for marine invertebrates. Here, we describe an easy-to-handle method for culturing intestinal cells from sea cucumber Apostichopus japonicus; additionally, we provide an example of in vitro apoptosis induction and detection in primary cultured intestinal cells. Moreover, this experiment provides details about the appropriate culture medium and cell collection method. The described protocol is compatible with a variety of widely available tissue samples from marine organisms including Echinodermata, Mollusca, and Crustacea, and it can provide sufficient cells for multiple in vitro experimental applications. This technique would enable researchers to efficiently manipulate primary cell cultures from marine invertebrates and to facilitate the functional evaluation of targeted biological materials on cells.

This protocol provides an easy-to-handle method to culture the intestinal cells from sea cucumber Apostichopus japonicus and is compatible with a variety of widely available tissue samples from marine organisms including Echinodermata, Mollusca, and Crustacea.

الحث المبرمج والكشف في الثقافة الاساسيه للخلايا المعوية الخيار البحر

Primary cultured cells are used in a variety of scientific disciplines as exceptionally important tools for the functional evaluation of biological ...

Organoid-Derived Epithelial Monolayer: A Clinically Relevant In Vitro Model for Intestinal Barrier Function

In the past, intestinal epithelial model systems were limited to transformed cell lines and primary tissue. These model systems have inherent limitations as the former do not faithfully represent original tissue physiology, and the availability of the latter is limited. Hence, their application hampers fundamental and drug development research. Adult stem-cell-based organoids (henceforth referred to as organoids) are miniatures of normal or diseased epithelial tissue from which they are derived. They can be established very efficiently from different gastrointestinal (GI) tract regions, have long-term expandability, and simulate tissue- and patient-specific responses to treatments in vitro. Here, the establishment of intestinal organoid-derived epithelial monolayers has been demonstrated along with methods to measure epithelial barrier integrity, permeability and transport,&#160;antimicrobial protein secretion, as well as histology. Moreover, intestinal organoid-derived monolayers can be enriched with proliferating stem and transit-amplifying cells as well as with key differentiated epithelial cells. Therefore, they represent a model system that can be tailored to study the effects of compounds on target cells and their mode of action. Although organoid cultures are technically more demanding than cell lines, once established, they can reduce failures in the later stages of drug development as they truly represent in vivo epithelium complexity and interpatient heterogeneity.

Here, we describe the preparation of human organoid-derived intestinal epithelial monolayers for studying intestinal barrier function, permeability, and transport. As organoids represent original epithelial tissue response to external stimuli, these models combine the advantages of expandability of cell lines and the relevance and complexity of primary tissue.

الطبقة الظهارية الأحادية المشتقة من المواد العضوية: نموذج ذو صلة سريريا في المختبر لوظيفة الحاجز المعوي

In the past, intestinal epithelial model systems were limited to transformed cell lines and primary tissue. These model systems have inherent limitations ...

Culture Methods to Study Apical-Specific Interactions using Intestinal Organoid Models

The lining of the gut epithelium is made up of a simple layer of specialized epithelial cells that expose their apical side to the lumen and respond to external cues. Recent optimization of in vitro culture conditions allows for the re-creation of the intestinal stem cell niche and the development of advanced 3-dimensional (3D) culture systems that recapitulate the cell composition and the organization of the epithelium. Intestinal organoids embedded in an extracellular matrix (ECM) can be maintained for long-term and self-organize to generate a well-defined, polarized epithelium that encompasses an internal lumen and an external exposed basal side. This restrictive nature of the intestinal organoids presents challenges in accessing the apical surface of the epithelium in vitro and limits the investigation of biological mechanisms such as nutrient uptake and host-microbiota/host-pathogen interactions. Here, we describe two methods that facilitate access to the apical side of the organoid epithelium and support the differentiation of specific intestinal cell types. First, we show how ECM removal induces an inversion of the epithelial cell polarity and allows for the generation of apical-out 3D organoids. Second, we describe how to generate 2-dimensional (2D) monolayers from single cell suspensions derived from intestinal organoids, comprised of&#160;mature and differentiated cell types. These techniques provide novel tools to study apical-specific interactions of the epithelium with external cues in vitro and promote the use of organoids as a platform to facilitate precision medicine.

Here we present two protocols that allow the modeling of intestinal apical-specific interactions. Organoid-derived intestinal monolayers and Air-Liquid Interface (ALI) cultures facilitate the generation of well-differentiated epithelia accessible from both luminal and basolateral sides, whereas polarity-inverted intestinal organoids expose their apical side and are amenable to high throughput assays.

أساليب الثقافة لدراسة التفاعلات Apical محددة باستخدام نماذج الجهاز المعوي

The lining of the gut epithelium is made up of a simple layer of specialized epithelial cells that expose their apical side to the lumen and respond to ...