Koo BK וMustata RC נתמך על ידי סר הנרי דייל המלגה מקרן Wellcome ואנדרסון-רולף נתמך על ידי המועצה למחקר הרפואי (MRC). פינק J נתמך על ידי הדוקטור-התכנית של 4 שנות Wellcome Trust.

כל העכברים המשמשים בפרוטוקול הבא הוחזקו בתנאי הפתוגן ללא ספציפיים, וכל ההליכים בוצעו על פי תקנות משרד פן בריטניה. .1 הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שעה 1 תקשורת מראש של שימוש (ראה טבלה 1 ורשימה של חומרים לפרטים נוספים) וטרום חמה באמבט מים 37 מעלות צלזיוס לפחות 10 דקות לפני השימוש. </li></ol> .2 Culturing מעי דק (SI) Organoids הערה: אלא אם כן צוין אחרת, כל incubations מבוצע על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור humidified. ציוד וחומרים כימיים באים במגע עם תאי חיים חייבים להיות סטרילי. טרום מחמם את צלחת תרבית רקמה חשובה כמו זה מונע מטריצת המרתף (Matrigel או BME) טיפות מלהתפשט החוצה כאשר זריעה. כמו כן, מטריצת המרתף צריך להיות כל הזמן על קרח בכל העת. חנות ב -20 ° C והפשרהעל קרח לפני השימוש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידוד מאורות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבידוד של המעי הדק להקריב את העכבר על פי הכללים והתקנות הלאומיים, ואז למקם את החיה על הגב שלה ולשטוף את הבטן עם אתנול 70%. בצע חתך קו האמצע אורך מהמפשעה לעצם החזה. ראשית, לחתוך את העור ולאחר מכן הרקמה התת עורית. הסר את המעי דק מcecum בבטן. מאורות מבודדים מהתריסריון, מעי ריק ומעי עקום יכולים לשמש לתרבות organoid. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את המעי דק המבודדים עם פוספט שנאגר מלוח מקורר מראש ללא סידן או מגנזיום (PBS0). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את הרקמה לחתיכות ארוכות 3-5 סנטימטר ולהשתמש במספריים לחתוך אותו לפתוח אורכים. מורחים את הרקמה באמצעות מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אל תגרד את villi באמצעות coverslip. זהירות, כוח רב מדי יגרום לרקמה לקרוע ויפחית את התשואה של מאורות בביצוע שלבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת הרקמה לצינור 50 מ&quot;ל מכיל usin PBS0 מקורר מראשמלקחיים גרם. שטוף את שברי הרקמה באמצעות טלטול נמרץ ולשנות את PBS0. חזור על 2-3x או עד PBS0 הופך פחות מעונן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הרקמה בצינור 50 מ&quot;ל המכיל 30 מ&quot;ל של PBS0 עם 1 מ&quot;מ חומצת ethylenediaminetetraacetic (EDTA) ל30 דקות ב 4 ° C על רולר צינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במרץ לנער הצינור ולהעביר את הרקמה למשנהו צינור 50 מ&quot;ל המכיל 30 מ&quot;ל של PBS0 עם 5 מ&quot;מ EDTA. פתרון 1 mM EDTA (המכיל בעבר הרקמה) מכיל תערובת של מאורות וvilli. חלק זה אינו מתאים לזריעה של organoids כפי שלעתים קרובות מכיל אחוז גבוה של villi. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הרקמות נוספת עבור שעה 1 על 4 מעלות צלזיוס בהרי צינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במרץ לנער את הצינור ולאסוף את הפתרון בצינור 50 מ&quot;ל נקי. לאשר את קיומו של מאורות ולהעריך את המספר, למשל, על ידי ספירת מאורות ב50 μl על ידי מיקרוסקופ אור. לחשב את הנפח הדרוש כדי להשיג 50-100 מאורות ולהעביר אותו לt 1.5 מ&quot;לUbe. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין XG 300 5 דקות. בטל supernatant, resuspend גלולה ב50 μl של מטריצת מרתף, וזרע בצלחת 24 גם מראש חימם. דגירה את הצלחת בתרבית רקמת חממה ל5-15 דקות כל כך מטריצת מרתף polymerizes. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שכבה עם 500 בינוני ENR μl (ראה טבלה 1). כ 24 שעות לאחר זריעת organoids יציג צורת פיברוזיס עגולה קטנה ואחרי עוד 2-3 ימים ניצני מבנים להיות גלויות. שינוי לתקשורת ENR הטרי כל 3 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבר organoid תרבויות כל 7 ימים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Passaging וOrganoids שמירה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור organoids ידי רענון התקשורת בכל 3 ימים והמעבר 1: 3 או 1: 5 כלומן מתמלא בתאים מתים, בערך כל 7 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשבור את כיפת מטריצת המרתף עם מדיום באמצעות 1 מ&quot;ל קצה pipetman ולהעביר אותו מהבאר לצינור 1.5 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבחינה מכאנית לנתק את organoids דרך pipettingpproximately 50x באמצעות קנס (למשל, 200 μl) קצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין XG 300 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant וresuspend גלולה ב150-250 μl של מטריצת מרתף. זרע במראש חימם צלחת 24 גם (50 μl של מטריצת מרתף / טוב). לפני זריעת פיפטה מטריצת המרתף למעלה ולמטה פעם אחת למעייל הקיר של הקצה. פיפטה לאט כדי למנוע בועות וזרע באמצע גם כדי למנוע את מטריצת המרתף מלהתפשט החוצה. זה רצוי להגיע כיפה של מטריצת מרתף במרכז הבאר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בתרבית רקמת חממה ל5-15 דקות כל כך מטריצת מרתף polymerizes. שכבה עם תקשורת ENR 500 μl בכל טוב. </li></ol></li></ol> .3 טרום זיהום הטיפול בSI Organoids הערה: איור 1 מדגים את הליך התמרה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Exchange ENR לENRWntNic (ראה טבלה 1) בינוני ולגדול organoids בtהמדיום שלו למשך התקופה מינימאלית של 3 ימים או עד שהם אימצו מורפולוגיה פיברוזיס. Wnt3a מגדיל את מספר תאי גזע ופנט בעוד Nicotinamide (NIC) משפר את יעילות התרבות. </li></ol> הפקת .4 וירוס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחת 150 צלחת מ&quot;מ של תאי הפלטינה-E נחוצה לזיהום. זרע כ 5 x 10 6 תאים עם תקשורת 15-18 מ&quot;ל (DMEM + 10% FBS) בנוכחות puromycin (1 מיקרוגרם / מ&quot;ל) וblasticidin (10 מיקרוגרם / מ&quot;ל). Transfect תאים אחרי 2-3 ימים, כאשר הם הגיעו ל70-80 confluency%. לשנות את המדיום לDMEM + 10% FBS ללא puromycin וblasticidin לפני transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 30 מיקרוגרם של מבנה DNA retroviral ו240 μl של polyethylenimine (PEI) כדי להפריד בין צינורות המכילים 1 מ&quot;ל של opti-MEM. לערבב דגירה בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בריכת שני פתרונות ודגירה בטמפרטורת חדר למשך 20-30 דקות. מוסיף את התערובת המלאה למדיום של תאי הפלטינה-E ולנער את פלאט בזהירותדואר כדי להבטיח חלוקה שווה של מתחמי DNA-PEI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאי הפלטינה-E עם תערובת transfection הלילה ולרענן את המדיום למחרת. שמור את התאים במדיום החדש עבור 2 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף רק את המדיום בצינור פלקון 50 מ&quot;ל, להעביר אותו דרך מסנן וצנטריפוגות 0.45 מיקרומטר ב8,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 12-16 שעה. בטל supernatant וresuspend גלולה ב250 μl של מדיום התמרה (ראה טבלה 1). </li></ol> .5 Organoid קטע הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזיהום אחד יש צורך גם אחד מצלחת 24 גם. לשבור את כיפת מטריצת המרתף עם מדיום באמצעות 1 מ&quot;ל קצה pipetman ולהעביר אותו לצינור 1.5 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בקצה עדין יותר נפח (לדוגמא, 200 טיפים μl) לשבש מכאני organoids באמצעות פיפטה (30-50x). הפתרון יהיה מעונן ולא כל organoids צריך להיות גלוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה בטמפרטורת חדר, 900 XG למשך 5 דקות<html> . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant וresuspend גלולה ב500 μl של פרוטאז הכיתה תרבית תאי רקומביננטי (למשל, TrypLE). לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. לאחר דגירה לבדוק את הגודל של שברי organoid באמצעות מיקרוסקופ אור, סופר את מספר תאים לכל בר. שברים המכילים 5-10 תאים הם אידיאליים. אם רוב הברים מכילים מספר גבוה יותר של תאי זמן הדגירה יכול להיות מוגבר על ידי 2 דקות בכל פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסיים את תהליך הניתוק על ידי הוספת 500 μl של מדיום ENR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה בטמפרטורת חדר, 900 XG למשך 5 דקות. הסר את supernatant ולשמור את הכדור על קרח או 4 ° C.. </li></ol> .6 Retroviral התמרה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשלב שברי organoid עם 250 μl של פתרון retroviral (מסעיף 4.5) ובאחד מצלחת 48 היטב. מערבבים בעדינות על ידי pipetting האיטי באמצעות 1 מ&quot;ל קצה pipetman. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את הצלחת עם Parafilm. </li></ol>דואר &quot;&gt; 7. Spinoculation וציפוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה את הצלחת ב32 ° C, 600 XG, עבור שעה 1. מוציא בזהירות את Parafilm ודגירה את הצלחת בתרבית רקמת חממה במשך 6 שעות. </li></ol> .8 זריעה של שברי Organoid מאשרום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את שברי organoid הנגועים ותקשורת התמרה מהבאר לצינור 1.5 מ&quot;ל, וספין ב900 XG למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ולשים את הצינור המכיל גלולה על קרח למשך 5 דקות למגניבות. הוספה של מטריצת מרתף 100 μl וresuspend גלולה ידי pipetting לאט למעלה ולמטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפות זרע &#39;מטריצת מרתף -cell לערבב&#39; 50 μl בצלחת 24 גם חדשה. דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס למשך 5-15 דקות עד שמתמצק מטריצת מרתף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מדיה התמרה ללא polybrene לבארות ודגירה את הצלחת בתרבית רקמת חממה. שינוי בתקשורת בכל 2-3 ימים. </li></ol> .9 בחירה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל selection אחרי 2-3 ימים על ידי הוספת puromycin (1 מיקרוגרם / מ&quot;ל) לתקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר שברים מתחילים להיווצר organoids להחליף את תקשורת התמרה עם תקשורת ENR בתוספת puromycin (1 מיקרוגרם / מ&quot;ל). </li></ol> 10. הודעה זיהום הטיפול בOrganoids SI <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות transduced organoids פי &quot;Passaging ושמירת organoids&quot; פרוטוקול (סעיף 2.2.1). לאחר 1-2 שבועות organoids SI יהיה להחזיר את מבני הניצנים שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות ההופעה של מבני ניצנים לגרום הביטוי של מירנה או cDNA על ידי הוספת 4 hydroxytamoxifen-(4-OHT) בריכוז עבודה של 1 מיקרומטר. שים לב שצעד זה תקף רק אם נעשה שימוש בוקטורי retroviral מAddgene (pMSCV-loxP-dsRed-loxP-eGFP-Puro-wpre (32,702), pMSCV-loxP-dsRed-loxP-3xHA-Puro-wpre (32703), וpMSCV -FLIP-Puro-dsRed-GFP-מירנה (32,704)) וorganoids להביע Cre-ERT2. </li></ol> 11. אישור הזיהום וExpression / דיכוי של הגן של עניין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם אתם משתמשים בוקטורי retroviral מAddgene (32,702, 32703 ו32,704) יעילות התמרה יכולה להיות מאושרת על ידי תצפית של ביטוי dsRed. יתר על כן, הביטוי או הדיכוי של הגן של עניין יכול להיות מאושר על ידי מערב כתם, באמצעות GFP או epitope 3xHA (לביטוי יתר של גן) וqPCR (למציאת גן), כפי שהודגם באל Koo et 4. </li></ol>

<ol>
	<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li><li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+self-organizing+mini-guts+from+a+single+intestinal+stem+cell:+mechanism+and+applications.">Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications.</a> Science. 340, 1190-1194 (2013).</li><li>Stelzner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nomenclature+for+intestinal+in+vitro+cultures.+American+journal+of+physiology.">A nomenclature for intestinal in vitro cultures. American journal of physiology.</a> Gastrointestinal and liver physiology. 302, G1359-G1363 (2012).</li><li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures.">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nature. 9, 81-83 (2012).</li><li>Schwank, G., Andersson-Rolf, A., Koo, B. K., Sasaki, N., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+BAC+Transgenic+Epithelial+Organoids.">Generation of BAC Transgenic Epithelial Organoids.</a> PloS one. 8, e76871 (2013).</li><li>Mustata, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr4+is+required+for+Paneth+cell+differentiation+and+maintenance+of+intestinal+stem+cells+ex+vivo.">Lgr4 is required for Paneth cell differentiation and maintenance of intestinal stem cells ex vivo.</a> EMBO reports. 12, 558-564 (2011).</li><li>Lau, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr5+homologues+associate+with+Wnt+receptors+and+mediate+R-spondin+signalling.">Lgr5 homologues associate with Wnt receptors and mediate R-spondin signalling.</a> Nature. 476, 293-297 (2011).</li><li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+suppressor+RNF43+is+a+stem-cell+E3+ligase+that+induces+endocytosis+of+Wnt+receptors.">Tumour suppressor RNF43 is a stem-cell E3 ligase that induces endocytosis of Wnt receptors.</a> Nature. 488, 665-669 (2012).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5/R-spondin+axis.">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> The EMBO journal. 32, 2708-2721 (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+single+Lgr5++liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration.">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494, 247-250 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose. The authors have no conflict of interest declared.

<html> כדי להשיג היבטים מסוימים יעילות התמרה גבוהה הם קריטיים. אחת מהן הוא הטיפול המקדים של organoids עם תקשורת ENRWntNic עד שהם לאמץ צורת פיברוזיס עגולה. זה מגדיל את מספר תאי גזע ובכך את הסיכוי להשגת אינטגרציה יציבה של transgene, כמו גם להגדיל את שיעור ההישרדות של organoids SI לאורך כל הליך התמרה. פרמטר נוסף הוא זמן הדגירה הבא spinoculation. תוצאות דגירה קצרות מדי או ארוכות מדי ביעילות ירודה התמרה והישרדות נמוכה של organoids, בהתאמה. צעד spinoculation הוא לא חיוני למרות שזה מגדיל את אחוז organoids transduced באופן משמעותי. לבסוף, וירוס גבוה כייל הוא מפתח לתמרה מוצלחת. זה תלוי בסוג של שורת תאי אריזה ווירוס. השילוב של שורת תאי הפלטינה-E ווירוס בתאי גזע עכברי (MSCV), נמצא לייצר כייל גבוה מספיק עבור התמרה של organoids. ve_content &quot;&gt; להלן טיפים לפתרון בעיות אשר עשוי לסייע להשגת התמרה מוצלחת. ראשית, אם transfection של שורת תאי אריזה הוא עני, לוודא כי confluency של התאים הוא בין 70-80% וכי זמן הדגירה של התערובת נקווה PEI-DNA היא בין 20-30 דקות. ההישרדות של organoids במהלך התמרה מאוד תלויה בגודל שבר. trypsinization הארוך מדי גורם לרוב שברים מורכב מפחות מ -3 תאים, ובכך מקטין את שרידות organoid. גורם נוסף הוא הפעילות של המדיום המותנה Wnt, אם הפעילות היא נמוכה מדי לחיזוקו באמצעות תוספת של CHIR99021 בריכוז עבודה של 5 מיקרומטר יכול להגדיל את ההישרדות. CHIR99021 מעכבת GSK3, וכתוצאה מכך גם סיגנלים של Wnt מוגברים. יתר על כן, Y-27362, המונע anoikis מתווסף לתקשורת התמרה כדי לשפר את שרידות organoid, מאז organoids הם שיבשו לברים (המכיל 1-10 תאים) לפני התמרה. כ60; שהוזכרו לעיל, זמן הדגירה לאחר spinoculation לא יעלה על 6 שעות. לבסוף, אם התמרה עניה הוא ציין הגורמים האמורים להשפיע על כייל הנגיף ואת מגבלת הגודל של להכניס לוקטור retroviral צריכים להיחשב. היעילות של מציאה תלויה מאוד במירנה. מאז היעילות משתנה עם השילוב של גן המטרה ומירנה זה שווה ביצוע מסך יעילות לזהות את אלה שעובדים הכי טובים. הטכניקה מוגבלת לתופעות האפיתל של מערכת organoid. בעתיד אפשר יהיה ללמוד במחלות זיהומיות או בתיווך חיסוני באמצעות שיתוף התרבות של מחוללי מחלה או הכינון מחדש עם רכיבים שמקורם במערכת החיסון, בהתאמה. יתר על כן, רטרווירוסים יכולים לשאת רק מוסיף של גודל קטן יחסית. כתוצאה מכך, אזורי רגולציה מתרחשים באופן טבעי יש לי כדי להיות שליליים ולכן הביטוי של transgene לא יכול לחקות את זה שלגן אנדוגני. כפי שצוין לעיל, את יעילות מציאה תלויה בגן המטרה ומירנה. אם לא ניתן למצוא מירנה עם יעילות מציאה מתאימה, הוא יכול להגביל את השימוש בטכניקה לגן מטרה מסוים. באופן תיאורטי, organoids תואם את כל הטכניקות מניפולטיביות הסטנדרטיות המשמשות לשורות תאים. התמרה retroviral הייתה השיטה הראשונה שדיווחה על 4, ולאחרונה BAC -transgenesis (כרומוזום בקטריאלי המלאכותי) הפך זמין 5. עם זמן דור כולל של 2-3 שבועות, לאחר transfection של פלסמיד הנגיפי אל תוך תא קו אריזה, הוא מהיר יותר באופן משמעותי מהדור של מהונדס עכבר (TG). על ידי שמירה על ארכיטקטורת קריפטה-סיסי in vivo בעוד המכיל תאי גזע, כמו גם את כל שושלות התאים מובחנות של האפיתל במעיים, מערכת תרבות organoid מגשרת על הפער בין בעלי החיים TG ותרבית תאים ששימשו בעבר. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; הפרוטוקול המתואר כאן מספק שיטה לביצוע ניתוח פנוטיפי של האפיתל endodermal במבחנה באמצעות gain- וצוברים הפסדים של מחקרים לתפקד. זה עושה את זה אפשרי כדי לענות על שאלות רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית בביולוגיה של תא גזע בוגר, עם צורך מינימאלי של עכברי TG. לדוגמא, את הדור של עכברי נוקאאוט מותנים יכול להימנע על ידי השימוש בorganoids נגזר ממוטציות שזה עתה נולדו עם הקטלניות סביב הלידה 6. בנוסף, הטכניקה יכולה להיות מיושמת על organoids שנלקח מעכברי נוקאאוט הוקמו בעבר כדי ללמוד את התפקיד של paralogues על ידי ביצוע 7,8 מציאה נוסף. לאחר הקמת organoids המעי הדק, עיבוד של פרוטוקול התרבות המקורי אפשר culturing האפיתלים לבלב, כבד, מעי גס והקיבה 9-11. יתר על כן, organoids מעיים האנושי וorganoids גידול כבר נגזרו מביופסיות אנושיות נורמליות, עדן הראשוניסבתא וסרטן מעי גס ביופסיות 10. פרוטוקול זיהום ויראלי ניתן להרחיב בקלות לסוגים אלה של organoids ומספק דרך חסרת תקדים של ביצוע מחקרים תפקודיים ברקמות אנושיות נגזר. יחדיו, התמרה retroviral של organoids המעי הדק היא משאב יקר ערך לחקירת תחזוקת תאי גזע, בידול, והחלטת גורל תא, כמו גם יחסי גומלין איתות תא ותא תאי ד&#39;.

יש צורך בגנטיקה תפקודית תפוקה גבוהה כדי להגדיל את ההבנה הביולוגית שלנו בגוף, כדי לשפר את המדע בסיסי נוכחי ורפואה. גנטיקה עכבר כבר תקן הזהב לחקירת תפקוד גן in vivo, למרות שזה גם זמן רב ויקר. שורות תאים, להיות הבחירה הנפוצה אחרת, יש להם יכולת תפוקה גבוהה יותר בעת היותו פחות יקר. עם זאת, הם הקשו על ידי חוסר היכולת שלהם להתרבות microenvironment הנכון ובכך התגובות הפיזיולוגיות ראה in vivo. לפיכך, יש צורך חד משמעי למערכת מודל קל לידית, המאפשר עלות / תוך ניתוח תפוקה גבוהה בזמן יעיל מחקת את התגובות הפיזיולוגיות שנצפו בin vivo מהונדס ניסויי עכבר (TG). לאפיתל endodermal מערכת מודל אחד כזה הופיעה ב2009 1. בין הידע שנצבר מהגילוי של תאי גזע במעי Lgr5-חיובימידע על הנישה המתאימה לגורמים הכרחיים לתחזוקת תאי גזע נוסף הסלולר המטריצה ​​וצמיחה. ניצול מידע זה ניתן היה להקים &quot;מיני אומץ&quot; המכונה גם organoids 2. לאחרונה מינוח קונסנסוס למבחנת תרבויות ב, בי organoids מכונות &#39;enteroids&#39;, הוצע 3. כמו שורות תאים, organoids הם המתרחב וקל לטיפול עם הליגנדים ומעכבים. עם זאת, במקום להיות דו ממדים הם מבנים תלת ממדיים ארגון עצמי שישמרו ארגון קריפטה-סיסי, כמו גם תאי גזע ושושלות תאים מובחנים של המעי דק (SI). Organoids מורכב משכבה אחת של תאי האפיתל המקיפים את אזור luminal. מבני ניצנים בולטים מתאים למאורות מעיים קטנים המכילים את התא בתאי גזע. החל מקצה מבנה הניצנים ותאים להבחין כפי שהם miלגרר לכיוון בטנת אפיתל, שבו תאי סופני הבדיל מופרשים בלומן. בהשוואה לשורות תאים, מערכת זו vivo לשעבר משחזרת באופן הדוק יותר את הפיסיולוגיה הנורמלית ולכן מערכת מודל מבטיחה לאפיתל של המעי הדק. בסרטון פרוטוקול זה של התמרה retroviral, אנו מציגים שיטה המאפשרת לשעבר מחקרי תפקוד גן vivo במערכת זו תרבות רומן organoid. אנחנו מתחילים בתיאור organoid התרבות באופן צעד אחר צעד, ולהמשיך על ידי הוכחת הדור של רטרווירוסים ואחרי הליך התמרה. לבסוף, יש קטע לקבלת ייעוץ נוסף לפתרון בעיות. יתרון של שיטה זו הוא שהיא יכולה להיות בשילוב עם הדמיה חיה או הקרנת סמים ללמוד הומאוסטזיס, החלטות גורל תא ואינטראקציות תאי תאים באפיתל המעי. בשל הארכיטקטורה הפשוטה שלהם ותחלופה מהירה, organoids לייצג של מודל אידיאליystem ללימוד ביולוגיה של תא גזע בוגרים. בנוסף התמרה retroviral יכולה להיות מיושמת על organoids שנלקח מעכברים מהונדסים שנקבע מראש, כמו גם דגימות מטופל אנושיות. לא ניתן להאריך גישות לדפוק ובעקומים החוצה לבני אדם, organoids האנושי SI מהווה חלופה אטרקטיבית. לסיכום, מניפולציה גנטית דרך התמרה retroviral מאפשרת ניתוח פנוטיפי בorganoids מעיים הקטן שנלקח מעכברים או דגימות רקמה אנושיות, ובכך משלימים את הגנטיקה עכבר ושורות תאים בעת פתיחת אפיקים חדשים ללימודים ברקמות אנושיות נגזר. התמרה retroviral מאפשרת gain- והאובדן של פונקצית מחקרים שיבוצע במערכת תרבות organoid 4. זה עושה את זה משאב יקר ערך לחקירת תפקוד גן, ביולוגיה של תא גזע בוגר ומחלה בעת היותו בהתאם לשלושה Rs (הפחתה, עידון, והחלפה).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1090">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:220px;">Advanced DMEM/F12&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">12634-034</td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Glutamax 100x&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">35050-068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Hepes 1M&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Penicillin- Streptomycin 100x</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">B27 supplement 50x</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">N2 supplement 100x&#160;</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">n-Acetylcysteine 500 mM&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">mouse EGF 500 &#181;g/ml</td>
			<td>Invitrogen Biosource</td>
			<td>PMG8043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">mouse Noggin 100 &#181;g/ml&#160;&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">R-Spondin conditioned medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The conditioned media is generated&#160; from HEK293 cells, for details see Sato and Clevers 2013</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Wnt conditioned medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The conditioned media is generated&#160; from L cells, for details see Sato and Clevers 2013</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Nicotinamide 1 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Y-27632 10 &#181;M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polybrene 8 &#181;g/ml)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9268-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;">Standard BD Matrigel matrix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356231</td>
			<td style="width:595px;">Basement Matrix Extract (Cultrex PathClear BME Reduced Growth Factor Type 2, 3533-005-02 ) 
			supplied by AMSBIO can be used as an alterntive.</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:220px;">24 well plate</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>662960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">48 well plate</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>677980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">CHIR99021</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3734-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Platinum- E cells</td>
			<td>Cell biolabs</td>
			<td>RV-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Puromycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A1113802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">Blasticidin</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A1113902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">Polyethyleneimine (PEI)</td>
			<td style="width:157px;">Polysciences</td>
			<td style="width:119px;">23966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">opti-MEM</td>
			<td style="width:157px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">51985-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">TrypLE</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">Parafilm</td>
			<td style="width:157px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P7793-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">4-OHT</td>
			<td style="width:157px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H7904</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture

יכולים להיות בתוספת תאי גזע Lgr5 החיובי עם הצמיחה חיונית גורמי EGF, Noggin, וR-Spondin, אשר מאפשר לנו התרבות המתרחבת מבני אפיתל 3D ראשוניים במבחנה. שני מאפייני הארכיטקטורה ופיזיולוגי של אלה &quot;מיני אומץ&quot;, המכונה גם organoids, דומים מאוד למקביליהם בגוף חי. זה גורם להם מערכת מודל אטרקטיבית לאפיתל של המעי הדק. באמצעות התמרה retroviral, יכול כעת להתבצע גנטיקה תפקודית על ידי ביטוי יתר של גן מותנה או מציאה. וידאו זה מדגים את ההליך של תרבות organoid, הדור של רטרווירוסים, ותמרת retroviral של organoids לסייע בתהליכי ניתוח פנוטיפי של אפיתל במעי הקטן במבחנה. מערכת זו רומן מודל organotypic בשילוב עם ביטוי גנים בתיווך retroviral מספקת כלי רב ערך לניתוח מהיר של תפקוד גן במבחנה ללא הצורך של costlדור y ונדרש זמן רב לבעלי חיים מהונדסים.

Organoids מוכן להיות מפוצלים כאשר לומן המרכזי הוא חשוך בשל נוכחותם של תאים מתים (איור 2). אחרי 2-3 ימים של organoids טיפול מראש צריך לאמץ מורפולוגיה פיברוזיס עגולה (איור 3). זה מגדיל את מספר תאי גזע, שיפור סיכויי קבלת אינטגרציה יציבה. הגודל של גלולה הנגיפית עשוי להשתנות בעקבות צנטריפוגה של supernatant ויראלי, ככל הנראה בשל תרומה שונה של פסולת תא לגודל גלולה. לא נמצא קשר ברור ליעילות התמרה נצפה. במהלך הליך בחירת organoids-transduced לא ימותו, ואילו אלה שיש אינטגרציה יציבה תישאר. חלבון פלואורסצנטי מרטרווירוס MSCV-eGFP ניתן להבחין בתאים שמקורם בorganoids ששרד, שיש להם מורפולוגיה פיברוזיס, בתוך 2-3 ימים הבאים התמרה (איור 4). <img alt<html> = &quot;איור 1&quot; FO: = src תוכן רוחב &quot;6in&quot; = &quot;/ קבצים / ftp_upload / 51765 / 51765fig1highres.jpg&quot; width = &quot;600&quot; /&gt; איור 1 ציור סכמטי של הליך התמרה retroviral. לפני organoids זיהום הוא באמצעות ENRWntNic עד שהם לאמץ מבנה פיברוזיס (שלב 1) שטופל מראש. תאי הפלטינה-E משמשים כקו תא האריזה, ותרבית עד שהם מגיעים 70-80 confluency%. לאחר מכן הם transfected עם מבנה retroviral באמצעות PEI. וירוסים נקצרים 2 ימים לאחר מכן (שלב 2). Organoids הם trypsinized להשיג שברים המכילים 1-10 תאים (שלב 3), ולאחר מכן נגוע (שלב 4). בעקבות spinoculation כדי להגביר את יעילות הזיהום (שלב 5), שברי organoid הנגועים הם זורעים (שלב 6) ו2-3 ימים לאחר מכן בחירה לשיבוטים חיוביים עם שילוב יציב ניתן לבצע (שלב 7). &quot;Width =&quot; 1765fig2highres.jpg 500 &quot;/&gt; איור 2 תמונת נציג organoids אחרי 4-6 ימים של התרבות. לומן מלא בתאים מתים, מה שהופך אותו להופיע כהה. Organoids בשלב זה הוא מוכן להיות passaged. <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51765/51765fig3highres.jpg" width="500" /> איור 3 תמונת נציג organoids המעי הדק בתרבית תקשורת ENRWntNic ל3-4 ימים. Organoids לאמץ מורפולוגיה פיברוזיס. <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51765/51765fig4highres.jpg" width="500" /> איור 4 תמונת נציג organoids מעיים הקטן (א) להראות ביטוי נגיפי transgene (ב, eGFP). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> אדוהnced DMEM / F12 +++ </td></tr><tr><td colspan="2"> חנות ב 4 מעלות צלזיוס למשך 4 שבועות </td></tr><tr><td> מתקדם DMEM / F12 </td><td> 500 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> 100x Glutamax </td><td> 5 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> Hepes 1 M </td><td> 5 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> 100x אנטיביוטיקה </td><td> 5 מ&quot;ל </td></tr><tr><td colspan="2"> בינוני ENRWntNic (ל20 מ&quot;ל) </td></tr><tr><td colspan="2"> חנות ב 4 מעלות צלזיוס למשך 2 שבועות </td></tr><tr><td> מתקדם DMEM / F12 +++ </td><td> 7.2 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> תוסף B27 (50x) </td><td> 400 μl </td></tr><tr><td> תוספת N2 (100x) </td><td> 200 μl </td></tr><tr><td> N-acetylcysteine ​​(500 מ&quot;מ) </td><td> 50 μl </td></tr><tr><td> העכבר EGF (500 מיקרוגרם / מ&quot;ל) </td><td> 2 μl </td></tr><tr><td> Noggin העכבר (100 מיקרוגרם / מ&quot;ל) </td><td> 20 μl </td></tr><tr><td> קונדיט R-Spondinבינוני ioned </td><td> 2 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> מדיום מותנה Wnt3a </td><td> 10 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> Nicotinamide (M 1) </td><td> 200 μl </td></tr><tr><td colspan="2"> בינוני התמרה (ל20 מ&quot;ל) </td></tr><tr><td colspan="2"> הכן טרי </td></tr><tr><td> בינוני ENRWntNic </td><td> 20 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> Y-27632 (10 מיקרומטר) </td><td> 20 μl </td></tr><tr><td> Polybrene (8 מיקרוגרם / מ&quot;ל) </td><td> 20 μl </td></tr><tr><td colspan="2"> בינוני ENR (ל20 מ&quot;ל) </td></tr><tr><td colspan="2"> חנות ב 4 מעלות צלזיוס למשך 4 שבועות </td></tr><tr><td> מתקדם DMEM / F12 +++ </td><td> 17.4 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> תוסף B27 (50x) </td><td> 400 μl </td></tr><tr><td> תוספת N2 (100x) </td><td> 200 μl </td></tr><tr><td> N-acetylcysteine ​​(500 מ&quot;מ) </td><td> 50 μl </td&gt; </tr><tr><td> העכבר EGF (500 מיקרוגרם / מ&quot;ל) </td><td> 2 μl </td></tr><tr><td> Noggin העכבר (100 מיקרוגרם / מ&quot;ל) </td><td> 20 μl </td></tr><tr><td> מדיום מותנה R-Spondin </td><td> 2 מ&quot;ל </td></tr><tr><td colspan="2"> מדיה לתאי הפלטינה-E (ל500 מ&quot;ל) </td></tr><tr><td colspan="2"> חנות ב 4 מעלות צלזיוס למשך 12 שבועות </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 449.45 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> בסרום שור עוברי (FBS) </td><td> 50 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> Puromycin (1 מיקרוגרם / מ&quot;ל) </td><td> 50 μl </td></tr><tr><td> Blasticidin (10 מיקרוגרם / מ&quot;ל) </td><td> 500 μl </td></tr></tbody></table> שולחן הרכב .1 מדיה המתקדם DMEM / F12 +++, בינוני ENRWntNic, בינוני התמרה, בינוני ENR, ובינוני לתאי הפלטינה-E.

Watch this Scientific Journal Video about A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture at JoVE.com

A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

פרוטוקול זה מסביר תרבות העיקרית Lgr5-positve organoid והביצועים הבאים של התמרה retroviral. זה מאפשר ביטוי יתר או מציאה Cre-מושרה של transgene נמסר ומאפשר מחקרים פונקציונליים להתבצע ברומן בorganotypic המבחנה מערכת מודל.

פרוטוקול וידאו של זיהום retroviral ביסודי מעיים Organoid תרבות

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding ...

a-video-protocol-retroviral-infection-primary-intestinal-organoid

Research

JoVE Journal

Biology

29.6K Views.  University of Cambridge.  פרוטוקול זה מסביר תרבות העיקרית Lgr5-positve organoid והביצועים הבאים של התמרה retroviral. זה מאפשר ביטוי יתר או מציאה Cre-מושרה של transgene נמסר ומאפשר מחקרים פונקציונליים להתבצע ברומן בorganotypic המבחנה מערכת מודל. 

Video: A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes (A. aegypti) and Infection Phenotype Determination

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of the virus in the mosquito tissues. This protocol is routinely used for studying mosquito-virus interactions, especially for identification of novel host factors that are able to determine vector competence. The entire experiment must be conducted in a BSL2 laboratory. Similar to Plasmodium falciparum infections, proper attire including gloves and lab coat must be worn at all times. After the experiment, all the materials that came in contact with the virus need to be treated with 75% ethanol and bleached before proceeding with normal washing. All other materials need to be autoclaved before discarding them.

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes A. aegypti and Infection Phenotype Determination

Once a gene is identified as potentially refractory for the dengue virus, it must be evaluated for it's role in preventing viral infections within the mosquito. This protocol illustrates how the extent of dengue infections of mosquitoes can be assayed. The techniques for growing up the virus in culture, membrane feeding mosquitoes human blood, and assaying viral titers in the mosquito midgut are demonstrated.

פרוטוקול זיהומים דנגי ב יתושים (א aegypti) ו הפנוטיפ קביעת זיהום

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of ...

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the inner ear (fig 1). Hair cells in the developing cochlea, which are the mechanosensory cells of the auditory system, are aligned in one row of inner hair cells and three (in the base and mid-turns) to four (in the apical turn) rows of outer hair cells that span the length of the organ of Corti. Hair cells transduce sound-induced mechanical vibrations of the basilar membrane into neural impulses that the brain can interpret. Most cases of sensorineural hearing loss are caused by death or dysfunction of cochlear hair cells.
An increasingly essential tool in auditory research is the isolation and in vitro culture of the organ explant 1,2,9. Once isolated, the explants may be utilized in several ways to provide information regarding normative, anomalous, or therapeutic physiology. Gene expression, stereocilia motility, cell and molecular biology, as well as biological approaches for hair cell regeneration are examples of experimental applications of organ of Corti explants.
This protocol describes a method for the isolation and culture of the organ of Corti from neonatal mice. The accompanying video includes stepwise directions for the isolation of the temporal bone from mouse pups, and subsequent isolation of the cochlea, spiral ligament, and organ of Corti. Once isolated, the sensory epithelium can be plated and cultured in vitro in its entirety, or as a further dissected micro-isolate that lacks the spiral limbus and spiral ganglion neurons. Using this method, primary explants can be maintained for 7-10 days. As an example of the utility of this procedure, organ of Corti explants will be electroporated with an exogenous DsRed reporter gene. This method provides an improvement over other published methods because it provides reproducible, unambiguous, and stepwise directions for the isolation, microdissection, and primary culture of the organ of Corti.

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti.

This procedure describes a method for the isolation and culture of the murine organ of Corti with or without the spiral limbus and spiral ganglion neurons. We also demonstrate a method for the expression of an exogenous reporter gene in the organ of Corti explant by electroporation.

תרבות ראשיים electroporation פלסמיד של האיבר Murine של קורטי.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

בידוד תרבות ראשונית של תאים בכבד עכברוש

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Retroviral Infection of Murine Embryonic Stem Cell Derived Embryoid Body Cells for Analysis of Hematopoietic Differentiation

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for investigating the development of early hematopoietic progenitor cells (HPCs). Gene expression in ESCs can be manipulated by several techniques that allow the role for individual molecules in development to be determined. One difficulty is that expression of specific genes often has different phenotypic effects dependent on their temporal expression. This problem can be circumvented by the generation of ESCs that inducibly express a gene of interest using technology such as the doxycycline-inducible transgene system. However, generation of these inducible cell lines is costly and time consuming. Described here is a method for disaggregating ESC-derived embryoid bodies (EBs) into single cell suspensions, retrovirally infecting the cell suspensions, and then reforming the EBs by hanging drop. Downstream differentiation is then evaluated by flow cytometry. Using this protocol, it was demonstrated that exogenous expression of a microRNA gene at the beginning of ESC differentiation blocks HPC generation. However, when expressed in EB derived cells after nascent mesoderm is produced, the microRNA gene enhances hematopoietic differentiation. This method is useful for investigating the role of genes after specific germ layer tissue is derived.

Manipulating temporal gene expression in differentiating embryonic stem cells (ESCs) can be achieved using inducible gene systems. However, generation of these cell lines is costly and time consuming. This protocol achieves rapid expression of a transgene in differentiating ES-derived cells and subsequent analysis of downstream hematopoietic differentiation.

זיהום retroviral של Murine גזע עוברי תאי Embryoid גוף תא נגזר לניתוח של בידול המטופואטיות

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for ...

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and composed of mature enterocytes, goblet cells and enteroendocrine cells; and crypts, residing proximal to the submucosa and the muscularis, harboring adult stem and progenitor cells and mature Paneth cells, as well as stromal and immune cells of the crypt microenvironment. Until the last few years, in vitro studies of small intestine was limited to cell lines derived from either benign or malignant tumors, and did not represent the physiology of normal intestinal epithelia and the influence of the microenvironment in which they reside. Here, we demonstrate a method adapted from Sato et al. (2009) for culturing primary mouse intestinal crypt organoids derived from C57BL/6 mice. In addition, we present the use of crypt organoid cultures to assay the crypt metabolic profile in real time by measurement of basal oxygen consumption, glycolytic rate, ATP production and respiratory capacity. Organoids maintain properties defined by their source and retain aspects of their metabolic adaptation reflected by oxygen consumption and extracellular acidification rates. Real time metabolic studies in this crypt organoid culture system are a powerful tool to study crypt organoid energy metabolism, and how it can be modulated by nutritional and pharmacological factors.

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Small intestinal crypt organoids cultured ex vivo provide a tissue culture system that recapitulates growth of crypts dependent on stem cells and their niche. We established a method to assay the metabolic profile in real time in primary mouse crypt organoids. We found organoids maintain physiological properties defined by their source.

אמיתי ניתוח זמן של פרופיל המטבולי ב<em&gt; Ex Vivo</em&gt; תרבויות עכבר המעיים קריפטה Organoid

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and ...

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth factors. Since organoids are highly similar to the original tissue in terms of homeostatic stem cell differentiation, cell polarity and presence of all terminally differentiated cell types known to the adult intestinal epithelium, they serve as an essential resource in experimental research on the epithelium. The possibility to express transgenes or interfering RNA using lentiviral or retroviral vectors in organoids has increased opportunities for functional analysis of the intestinal epithelium and intestinal stem cells, surpassing traditional mouse transgenics in speed and cost. In the current video protocol we show how to utilize transduction of small intestinal organoids with lentiviral vectors illustrated by use of doxycylin inducible transgenes, or IPTG inducible short hairpin RNA for overexpression or gene knockdown. Furthermore, considering organoid culture yields minute cell counts that may even be reduced by experimental treatment, we explain how to process organoids for downstream analysis aimed at quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry. Techniques that enable transgene expression and gene knock down in intestinal organoids contribute to the research potential that these intestinal epithelial structures hold, establishing organoid culture as a new standard in cell culture.

In this video protocol we give a step by step explanation of lentiviral transduction in organoids of primary intestinal epithelium and of processing and downstream analysis of these cultures by quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry.

פרוטוקול לlentiviral התמרה וניתוח במורד הזרם של המעיים Organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

בידוד ותרבות של עכברים ראשיים Keratinocytes מ neonatal ומבוגרים עור עכבר

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Apoptosis Induction and Detection in a Primary Culture of Sea Cucumber Intestinal Cells

Primary cultured cells are used in a variety of scientific disciplines as exceptionally important tools for the functional evaluation of biological substances or characterization of specific biological activities. However, due to the lack of universally applicable cell culture media and protocols, well described cell culture methods for marine organisms are still limited. Meanwhile, the commonly occurring microbial contamination and polytropic properties of marine invertebrate cells further impede the establishment of an effective cell culture strategy for marine invertebrates. Here, we describe an easy-to-handle method for culturing intestinal cells from sea cucumber Apostichopus japonicus; additionally, we provide an example of in vitro apoptosis induction and detection in primary cultured intestinal cells. Moreover, this experiment provides details about the appropriate culture medium and cell collection method. The described protocol is compatible with a variety of widely available tissue samples from marine organisms including Echinodermata, Mollusca, and Crustacea, and it can provide sufficient cells for multiple in vitro experimental applications. This technique would enable researchers to efficiently manipulate primary cell cultures from marine invertebrates and to facilitate the functional evaluation of targeted biological materials on cells.

This protocol provides an easy-to-handle method to culture the intestinal cells from sea cucumber Apostichopus japonicus and is compatible with a variety of widely available tissue samples from marine organisms including Echinodermata, Mollusca, and Crustacea.

ואפופטוזיס השראה ואיתור בתרבות העיקרית של מלפפונים בתאי מעיים ים

Primary cultured cells are used in a variety of scientific disciplines as exceptionally important tools for the functional evaluation of biological ...

Organoid-Derived Epithelial Monolayer: A Clinically Relevant In Vitro Model for Intestinal Barrier Function

In the past, intestinal epithelial model systems were limited to transformed cell lines and primary tissue. These model systems have inherent limitations as the former do not faithfully represent original tissue physiology, and the availability of the latter is limited. Hence, their application hampers fundamental and drug development research. Adult stem-cell-based organoids (henceforth referred to as organoids) are miniatures of normal or diseased epithelial tissue from which they are derived. They can be established very efficiently from different gastrointestinal (GI) tract regions, have long-term expandability, and simulate tissue- and patient-specific responses to treatments in vitro. Here, the establishment of intestinal organoid-derived epithelial monolayers has been demonstrated along with methods to measure epithelial barrier integrity, permeability and transport,&#160;antimicrobial protein secretion, as well as histology. Moreover, intestinal organoid-derived monolayers can be enriched with proliferating stem and transit-amplifying cells as well as with key differentiated epithelial cells. Therefore, they represent a model system that can be tailored to study the effects of compounds on target cells and their mode of action. Although organoid cultures are technically more demanding than cell lines, once established, they can reduce failures in the later stages of drug development as they truly represent in vivo epithelium complexity and interpatient heterogeneity.

Here, we describe the preparation of human organoid-derived intestinal epithelial monolayers for studying intestinal barrier function, permeability, and transport. As organoids represent original epithelial tissue response to external stimuli, these models combine the advantages of expandability of cell lines and the relevance and complexity of primary tissue.

מונו-שכבת אפיתל שמקורה באורגנואידים: מודל במבחנה רלוונטי מבחינה קלינית לתפקוד מחסום המעי

In the past, intestinal epithelial model systems were limited to transformed cell lines and primary tissue. These model systems have inherent limitations ...

Culture Methods to Study Apical-Specific Interactions using Intestinal Organoid Models

The lining of the gut epithelium is made up of a simple layer of specialized epithelial cells that expose their apical side to the lumen and respond to external cues. Recent optimization of in vitro culture conditions allows for the re-creation of the intestinal stem cell niche and the development of advanced 3-dimensional (3D) culture systems that recapitulate the cell composition and the organization of the epithelium. Intestinal organoids embedded in an extracellular matrix (ECM) can be maintained for long-term and self-organize to generate a well-defined, polarized epithelium that encompasses an internal lumen and an external exposed basal side. This restrictive nature of the intestinal organoids presents challenges in accessing the apical surface of the epithelium in vitro and limits the investigation of biological mechanisms such as nutrient uptake and host-microbiota/host-pathogen interactions. Here, we describe two methods that facilitate access to the apical side of the organoid epithelium and support the differentiation of specific intestinal cell types. First, we show how ECM removal induces an inversion of the epithelial cell polarity and allows for the generation of apical-out 3D organoids. Second, we describe how to generate 2-dimensional (2D) monolayers from single cell suspensions derived from intestinal organoids, comprised of&#160;mature and differentiated cell types. These techniques provide novel tools to study apical-specific interactions of the epithelium with external cues in vitro and promote the use of organoids as a platform to facilitate precision medicine.

Here we present two protocols that allow the modeling of intestinal apical-specific interactions. Organoid-derived intestinal monolayers and Air-Liquid Interface (ALI) cultures facilitate the generation of well-differentiated epithelia accessible from both luminal and basolateral sides, whereas polarity-inverted intestinal organoids expose their apical side and are amenable to high throughput assays.

שיטות תרבות לחקר אינטראקציות ספציפיות לאפיקליות באמצעות מודלים אורגנויד מעיים

The lining of the gut epithelium is made up of a simple layer of specialized epithelial cells that expose their apical side to the lumen and respond to ...