Name: a video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture
Uploaded: 2014-08-11T18:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture at JoVE.com

Koo BK e Mustata RC são suportados pelo Sir Henry Dale Fellowship do Wellcome Trust e Andersson-Rolf A é apoiada pelo Conselho de Pesquisa Médica (MRC). Fink J é apoiado pelo Programa de Doutoramento-4-year Wellcome Trust.

Todos os ratos utilizados no seguinte protocolo foram mantidos em condições livres de patógenos específicos, e todos os procedimentos foram realizados de acordo com os regulamentos do Reino Unido Home Office. 1 Preparação <ol><li> Prepare a mídia de 1 hora antes do uso (ver Quadro 1 e Lista de Materiais para mais detalhes) e pré-aquecido em um banho de água C ​​37 °, pelo menos, 10 minutos antes de usar. </li></ol> 2 A cultura do Intestino Delgado (SI) Organóides NOTA: A menos que indicado de outra forma, todas as incubações são realizadas a 37 ° C, 5% de CO 2, num incubador humidificado. Equipamento e reagentes que entram em contacto com as células vivas têm de ser estéreis. Pré-aquecimento da placa de cultura de tecidos é importante, pois evita que a matriz de cave (Matrigel ou BME) gotas de se espalhar para fora quando a semeadura. Além disso, a matriz deve ser porão mantida em gelo durante todo o tempo. Armazenar a -20 ° C e descongelamentoem gelo antes do uso. <ol><li> Isolando criptas <ol><li> Para o isolamento do intestino delgado sacrificar o mouse de acordo com as normas e regulamentos nacionais, em seguida, colocar o animal em suas costas e lavar o abdômen com etanol 70%. Realize uma incisão mediana longitudinal desde a virilha até o esterno. Em primeiro lugar, cortar a pele e, em seguida, o tecido subcutâneo. Remover o intestino delgado a partir do ceco para o estômago. Isoladas a partir de criptas do duodeno, jejuno e íleo pode ser utilizado para a cultura organï¿½de. </li><li> Lave o intestino delgado isolado com pré-resfriado Phosphate-Buffered Saline sem cálcio ou magnésio (PBS0). </li><li> Corte o tecido em 3-5 cm de comprimento peças e use uma tesoura para cortá-la aberta longitudinalmente. Espalhar o tecido, utilizando fórceps. </li><li> Raspe vilosidades usando uma lamela. Cuidado, muita força fará com que o tecido de rasgar e irá reduzir o rendimento de criptas em passos seguintes. </li><li> Transferir o tecido para um tubo de 50 ml, contendo pré-arrefecida usin PBS0fórceps g. Lave os fragmentos de tecido através de agitação vigorosa e mudar o PBS0. Repita 2-3x ou até o PBS0 gira menos nublado. </li><li> Incubar o tecido em um tubo de 50 ml contendo 30 ml de PBS0 com 1 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) durante 30 min a 4 ° C em um tubo de rolo. </li><li> Agitar vigorosamente o tubo e transferir o tecido para outro tubo de 50 ml contendo 30 ml de PBS0 com 5 mM de EDTA. A solução de EDTA a 1 mM (previamente contendo o tecido) irá conter uma mistura de criptas e vilosidades. Esta fração não é adequado para a semeadura de Organóides como muitas vezes contém uma elevada percentagem de vilosidades. </li><li> Incubar o tecido ainda durante 1 hora a 4 ° C em um tubo de rolo. </li><li> Agitar vigorosamente o tubo e recolher a solução em um tubo de 50 ml limpo. Confirmar a presença de criptas e estimar o número, por exemplo, através da contagem das criptas em 50 ul por microscopia de luz. Calcula-se o volume necessário para se obter 50-100 criptas e transferi-lo para um 1,5 ml de tube. </li><li> Gire a 300 xg por 5 min. Rejeitar o sobrenadante, ressuspender o sedimento em 50 mL de matriz de porão, e sementes de uma pré-aquecido placa de 24 poços. Incubar a placa numa incubadora de cultura de tecidos de 5-15 minutos de modo que a matriz de porão polimeriza. </li><li> Sobreposição com 500 ul ENR médio (ver Tabela 1). Aproximadamente 24 horas após a semeadura das Organóides irá mostrar uma pequena forma cística redonda e após mais 2-3 dias brotamento estruturas tornam-se visíveis. Mude a mídia ENR frescas a cada 3 dias. </li><li> Passage organóide culturas a cada 7 dias. </li></ol></li><li> Passaging e Organóides Manutenção <ol><li> Manter os Organóides atualizando os meios de comunicação a cada 3 dias e passagem 1: 3 ou 1: 5 como o lúmen se enche de células mortas, aproximadamente a cada sete dias. </li><li> Quebre a matriz cúpula porão com meio com 1 ml ponta PIPETMAN e transferi-lo do poço para um tubo de 1,5 ml. </li><li> Mecanicamente dissociar os Organóides através de uma pipetapproximately 50x usando uma multa (por exemplo, 200 mL) de ponta. </li><li> Gire a 300 xg por 5 min. </li><li> Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 150-250 mL de matriz porão. Semente de uma pré-aquecido placa de 24 poços (50 ul de matriz basal / poço). Antes de semear pipeta da matriz basal para cima e para baixo uma vez, para o revestimento de parede da ponta. Pipeta-se lentamente para evitar as bolhas e as sementes no meio do poço para evitar a matriz basal se espalhe para fora. É desejável para obter uma matriz de cúpula do porão, no centro do poço. </li><li> Incubar numa incubadora de cultura de tecidos de 5-15 minutos de modo que a matriz de porão polimeriza. Overlay com 500 mL de mídia ENR por poço. </li></ol></li></ol> 3 Pré-Tratamento de infecção SI Organóides NOTA: A Figura 1 ilustra o procedimento de transdução. <ol><li> Taxas ENR para ENRWntNic (ver Tabela 1) médio e crescer os Organóides em tseu meio para um mínimo de 3 dias ou até que eles adotaram uma morfologia cística. Wnt3a aumenta o número de células estaminais e de Paneth enquanto nicotinamida (NIC) melhora a eficiência da cultura. </li></ol> 4 Vírus Produção <ol><li> É necessário 150 mm prato de células Platinum-E por infecção. Semente de aproximadamente 5 x 10 6 células, com 15-18 ml de meio (DMEM + FBS 10%), na presença de puromicina (1 jag / mL) e blasticidina (10 ug / ml). Transfecção de células após 2-3 dias, depois de terem atingido 70-80% de confluência. Mudar o meio de DMEM + 10% FBS sem ï¿½puromicina e blasticidina antes da transfecção. </li><li> Adicionar 30 mg de construção de ADN retroviral e 240 mL de polietilenimina (PEI) para separar os tubos, contendo 1 ml de Opti-MEM. Misturar e incubar à temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Reunir as duas soluções e incuba-se à temperatura ambiente durante 20-30 min. Adicione a mistura completa para o meio de células Platinum-E e agitar cuidadosamente o plate para assegurar uma distribuição equitativa dos complexos DNA-PEI. </li><li> Incubar as células E-platina com a mistura de transfecção durante a noite e refrescar o meio no dia seguinte. Manter as células em meio novo durante 2 dias. </li><li> Recolhe apenas a forma de um tubo Falcon de 50 ml, que passam através de um filtro de 0,45 um e de centrifugação a 8000 xg, a 4 ° C durante 12-16 horas. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 250 ul de meio de transdução (ver Tabela 1). </li></ol> 5. organóide Fragmento Preparação <ol><li> Para uma infecção de um poço de uma placa de 24 cavidades é necessário. Quebre a matriz cúpula porão com meio com 1 ml ponta pipeta e transferir para um tubo de 1,5 ml. </li><li> Utilizar um volume de ponta fina (por exemplo, de 200 pontas ul) para romper mecanicamente os Organóides através de pipetagem (30-50x). A solução torna-se turva e não Organóides integrais devem ser visíveis. </li><li> Centrifuga-se a temperatura ambiente, 900 x g durante 5 min<html> . </li><li> Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 500 ul de protease recombinante de grau de cultura de células (por exemplo, TrypLE). Incubar a 37 ° C durante 5 min. Após a incubação, verificar o tamanho dos fragmentos por meio de microscopia de luz organï¿½de, contando o número de células por fragmento. Fragmentos contendo 5-10 células são ideais. Se a maioria dos fragmentos de conter um maior número de células do tempo de incubação pode ser aumentado por 2 minutos de cada vez. </li><li> Terminar o processo de dissociação, adicionando 500 mL de meio de ENR. </li><li> Centrifuga-se a temperatura ambiente, 900 x g durante 5 min. Remover o sobrenadante e o sedimento de manter em gelo ou a 4 ° C. </li></ol> 6. Transdução retroviral <ol><li> Combinar fragmentos organï¿½de com 250 ul da solução retroviral (de secção 4.5) em um poço de uma placa de 48 poços. Misture delicadamente por pipetagem lento usando uma pipeta de ponta ml. </li><li> Selar a placa com Parafilm. </li></ol>e &quot;&gt; 7. Spinoculation e Galvanização <ol><li> Centrifugar a placa a 32 ° C, 600 x g, durante 1 hora. Retire cuidadosamente o Parafilm e incubar a placa em uma cultura de tecidos incubadora durante 6 horas. </li></ol> 8 Sementeira de infectados organóide Fragments <ol><li> Transferir os fragmentos organï¿½de infectadas e media a transdução do poço para um tubo de 1,5 ml, e de centrifugação a 900 xg durante 5 min. </li><li> Descartar o sobrenadante e colocar o tubo contendo o sedimento em gelo durante 5 minutos para arrefecer. Adicione 100 ml de matriz porão e colocar o agregado pipetando lentamente para cima e para baixo. </li><li> Gotas de semente de matriz &#39;porão -cell misturar&#39; 50 ul de uma nova placa de 24 poços. Incubar a placa a 37 ° C, durante 5-15 min, até que os solidifica matriz basal. </li><li> Adic transdução sem polibreno aos poços e incuba-se a placa numa incubadora de cultura de tecidos. Mudança de mídia a cada 2-3 dias. </li></ol> 9 Seleção <ol><li> Comece seLection após 2-3 dias, adicionando ï¿½puromicina (1 mg / ml) para a mídia. </li><li> Quando os fragmentos estão começando a formar Organóides substituir os meios de comunicação com os meios Transdução ENR suplementados com puromicina (1 jag / ml). </li></ol> 10 pós-infecção Tratamento de SI Organóides <ol><li> Cultura transduzidas Organóides de acordo com o &quot;Passaging e manter Organóides&quot; protocolo (seção 2.2.1). Depois de 1-2 semanas, os Organóides SI vai recuperar as suas estruturas de brotamento. </li><li> Após o aparecimento de estruturas de brotamento induzir a expressão de miARN ou ADNc por adição de 4-hidroxitamoxifeno (4-OHT) em uma concentração de trabalho de 1 uM. Note que este passo só é válida se estiver usando vetores retrovirais de Addgene (pMSCV-loxP-dsRed-loxP-EGFP-Puro-WPRE (32702), pMSCV-loxP-dsRed-loxP-3xHA-Puro-WPRE (32.703), e pMSCV -FLIP-puro-dsRed-GFP-miRNA (32704)) e Organóides expressam Cre-ERT2. </li></ol> 11. confirmação da infecção e Expressão / Supressão do gene de interesse <ol><li> Se utilizar os vectores retrovirais da Addgene (32702, 32703 e 32704) eficiência de transdução pode ser confirmado pela observação da expressão dsRed. Além disso, a expressão ou a repressão do gene de interesse pode ser confirmada através de Western Blot, utilizando o GFP ou 3xHA epitopo (para a sobre-expressão do gene) e de qPCR (para knockdown do gene), conforme exemplificado na Koo et al 4. </li></ol>

<ol>
	<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li><li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+self-organizing+mini-guts+from+a+single+intestinal+stem+cell:+mechanism+and+applications.">Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications.</a> Science. 340, 1190-1194 (2013).</li><li>Stelzner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nomenclature+for+intestinal+in+vitro+cultures.+American+journal+of+physiology.">A nomenclature for intestinal in vitro cultures. American journal of physiology.</a> Gastrointestinal and liver physiology. 302, G1359-G1363 (2012).</li><li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures.">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nature. 9, 81-83 (2012).</li><li>Schwank, G., Andersson-Rolf, A., Koo, B. K., Sasaki, N., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+BAC+Transgenic+Epithelial+Organoids.">Generation of BAC Transgenic Epithelial Organoids.</a> PloS one. 8, e76871 (2013).</li><li>Mustata, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr4+is+required+for+Paneth+cell+differentiation+and+maintenance+of+intestinal+stem+cells+ex+vivo.">Lgr4 is required for Paneth cell differentiation and maintenance of intestinal stem cells ex vivo.</a> EMBO reports. 12, 558-564 (2011).</li><li>Lau, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr5+homologues+associate+with+Wnt+receptors+and+mediate+R-spondin+signalling.">Lgr5 homologues associate with Wnt receptors and mediate R-spondin signalling.</a> Nature. 476, 293-297 (2011).</li><li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+suppressor+RNF43+is+a+stem-cell+E3+ligase+that+induces+endocytosis+of+Wnt+receptors.">Tumour suppressor RNF43 is a stem-cell E3 ligase that induces endocytosis of Wnt receptors.</a> Nature. 488, 665-669 (2012).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5/R-spondin+axis.">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> The EMBO journal. 32, 2708-2721 (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+single+Lgr5++liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration.">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494, 247-250 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose. The authors have no conflict of interest declared.

<html> Para atingir alta eficiência de transdução de certos aspectos são fundamentais. Um deles é o pré-tratamento de Organóides com a mídia ENRWntNic até que adotar uma forma cística rodada. Isto aumenta o número de células estaminais e, assim, a possibilidade de obter uma integração estável do transgene, bem como aumentar a taxa de sobrevivência dos Organóides SI durante todo o procedimento de transdução. Outro parâmetro é o tempo de incubação seguinte spinoculation. Resultados de incubação muito curto ou muito longo em baixa eficiência de transdução e baixa sobrevida dos Organóides, respectivamente. O passo spinoculation não é essencial, embora ele aumenta significativamente a percentagem de Organóides transduzidas. Finalmente, vírus de título elevado é a chave para a transdução de sucesso. Isto é dependente do tipo de linha de células de empacotamento e vírus. A combinação de uma linha celular de platina-E e vírus de células estaminais de murino (MSCV), verificou-se produzir um título suficientemente elevado para a transdução de Organóides. ve_content &quot;&gt; Abaixo são dicas para solução de problemas que podem ajudar a alcançar transdução de sucesso. Em primeiro lugar, se a transfecção da linha de células de empacotamento é pobre, certifique-se de que a confluência das células situa-se entre 70-80%, e que o tempo de incubação do agrupada mistura PEI-ADN é entre 20-30 min. A sobrevivência dos Organóides durante transdução altamente depende do tamanho do fragmento. demasiado longo tripsinização faz com que a maioria dos fragmentos de consistir em menos de 3 células e, assim, diminui a capacidade de sobrevivência organï¿½de. Outro factor é a actividade do meio condicionado de Wnt, se a actividade é muito baixa, impulsionando-o por meio da adição de CHIR99021 numa concentração de 5 fiM de trabalho pode aumentar a sobrevivência. CHIR99021 inibe a GSK3, o que resulta num aumento da sinalização de Wnt. Além disso, Y-27362, o qual impede anoikis é adicionado ao meio para melhorar a capacidade de sobrevivência de transdução organï¿½de, uma vez que são rompidas as Organóides de fragmentos (contendo 1-10 células) antes da transdução. Como60; mencionado acima, o tempo de incubação após spinoculation não deve ser superior a 6 horas. Por fim, se a transdução pobre é observado os factores acima mencionados influenciam o título viral e o limite de tamanho da inserção para o vector retroviral devem ser considerados. A eficiência do knockdown é altamente dependente da miARN. Uma vez que a eficiência varia de acordo com a combinação do gene alvo e miARN vale a pena realizar uma tela eficiência para identificar aqueles que funcionam melhor. A técnica é restrito para os fenómenos epiteliais do sistema organï¿½de. No futuro, pode ser possível estudar as doenças infecciosas ou imuno-mediada através da co-cultura de agentes patogénicos ou a reconstituição com componentes derivadas do sistema imune, respectivamente. Além disso, os retrovírus só pode efectuar inserções de um tamanho relativamente pequeno. Por conseguinte, as regiões reguladoras de ocorrência natural têm de ser excluídos e, portanto, a expressão do transgene não pode imitar o deo gene endógeno. Como mencionado acima, a eficiência de knockdown depende do gene alvo e miARN. Se não miARN com eficiência knockdown adequado pode ser encontrado, pode limitar o uso da técnica em que o gene alvo em particular. Teoricamente, Organóides são compatíveis com todas as técnicas de manipulação padronizados utilizados para linhas celulares. Transdução retroviral foi o primeiro método a ser relatado 4, e, recentemente, BAC (cromossomo artificial bacteriano) -transgenesis tornou-se disponível 5. Com um tempo de geração total de 2-3 semanas, após a transfecção do plasmídeo virai na linha celular de empacotamento, que é significativamente mais rápida do que a geração de um transgénicos (tg) do rato. Através da manutenção da arquitectura cripta-vilosidade in vivo, enquanto que contém as células estaminais, bem como todas as linhagens de células diferenciadas do epitélio intestinal, o sistema de cultura organï¿½de preenche a lacuna entre tg e cultura de células de animais utilizadas anteriormente. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; O protocolo aqui descrito fornece um método para realizar a análise fenotípica de endodermal epitélio in vitro através gain- e sem perdas de estudos da função. Isso torna possível para abordar questões fisiologicamente relevantes na biologia das células-tronco adultas, com uma necessidade mínima de tg. Por exemplo, a geração de ratinhos knockout condicionais pode ser evitado pelo uso de derivados de mutantes Organóides-nascidos com letalidade perinatal 6. Além disso, a técnica pode ser aplicada a Organóides derivadas de ratinhos knockout previamente estabelecidos para estudar o papel de paralogues efectuando 7,8 knockdown adicional. Após o estabelecimento de pequenas Organóides intestinais, adaptação do protocolo de cultura original permitiu cultura de pâncreas, fígado, cólon e estômago epitélios 9-11. Além disso, Organóides intestinal humana e Organóides tumorais foram extraídos de biópsias humanas normais, aden primáriooma e câncer colorretal biópsias 10. O protocolo de infecção viral pode ser facilmente estendido para estes tipos de Organóides e fornece uma forma sem precedentes de realização de estudos funcionais em tecidos de origem humana. Tomados em conjunto, transdução retroviral de pequenas Organóides intestinal é um recurso valioso para a investigação de manutenção de células estaminais, a diferenciação ea decisão destino celular, bem como a sinalização celular e de células célula-interações.

Genética funcional de alto rendimento é necessário para aumentar a nossa compreensão biológica do corpo, para melhorar a ciência básica atual e medicina. Mouse genética tem sido o padrão ouro para investigar a função do gene in vivo, embora seja tanto demorado e caro. As linhas celulares, sendo a outra opção comum, tem uma capacidade de produção mais elevada, enquanto ser menos dispendioso. No entanto, elas são impedidos pela sua incapacidade para reproduzir o microambiente adequado e deste modo, as respostas fisiológicas in vivo visto. Assim, existe uma necessidade para um sistema sem ambiguidade modelo fácil de manusear, que permite que o custo / eficiente em termos de tempo de análise de alto rendimento, enquanto imitando as respostas fisiológicas observadas em experimentos in vivo transgênicos (Tg) do mouse. Para o epitélio endodermal um tal sistema modelo apareceu em 2009 1. Entre os conhecimentos adquiridos a partir da descoberta de células-tronco intestinais Lgr5-positivos foiInformações sobre o nicho correspondente aos factores de crescimento e da matriz extra-celular necessárias para a manutenção de células estaminais. Utilizando esta informação, tornou-se possível estabelecer &#39;mini-intestinos&#39;, também conhecidos como Organóides 2. Recentemente, uma nomenclatura de consenso para culturas in vitro, onde Organóides são referidos como &#39;enteroids&#39;, foi sugerido 3. Como linhas celulares, os Organóides estão em constante expansão e fácil de tratar com ligantes e inibidores. No entanto, em vez de ser bidimensional são estruturas tridimensionais auto-organização que retêm a organização cripta-vilosidade, assim como as células estaminais e as linhagens de células diferenciadas do intestino delgado (SI). Organóides constituído por uma única camada de células epiteliais que circundam a área luminal. Salientes estruturas brotamento correspondem a criptas do intestino delgado, contendo compartimento de células estaminais. A partir da ponta da estrutura de brotamento células progenitoras diferenciam em que miralar para o revestimento epitelial, onde as células terminalmente diferenciadas são derramadas para o lúmen. Em comparação com as linhas celulares, este sistema ex vivo recapitula mais de perto a fisiologia normal e, portanto, é um sistema modelo interessante para o epitélio do intestino delgado. Neste protocolo vídeo de transdução retroviral, apresentamos um método que permite estudos ex vivo a função do gene, neste novo sistema de cultura organóide. Começamos descrevendo organï¿½de cultura de um modo passo-a-passo, e continuam a demonstrar a geração de retrovírus, seguido pelo procedimento de transdução. Finalmente, há uma seção para conselhos adicionais para solução de problemas. Uma vantagem desta técnica é que ele pode ser combinado com a imagem ao vivo ou rastreio de drogas, para o estudo da homeostase decisões destino celular e as interacções célula-célula no epitélio do intestino. Devido à sua arquitetura simples e taxa de rotatividade rápida, Organóides representam um modelo ideal sistema para o estudo da biologia de células-tronco de adultos. Além transdução retroviral pode ser aplicada a Organóides derivadas de ratinhos transgénicos pré-estabelecidas, assim como amostras de pacientes humanos. Com a aproximação do knock-in e knock-out não pode ser estendido para os seres humanos, os Organóides humano SI constituem uma alternativa atraente. Em resumo, a manipulação genética por meio de transdução retroviral permite a análise fenotípica em pequenas Organóides intestinais derivadas de camundongos ou amostras de tecidos humanos, complementando assim a genética do rato e linhas celulares ao abrir novos caminhos para estudos em tecidos de origem humana. Transdução retroviral permite gain- e perda de função de estudos para ser executada no sistema de cultura organï¿½de 4. Isto o torna um recurso valioso para investigar a função do gene, a biologia de células-tronco adultas e doença estando em conformidade com os três Rs (redução, refinamento e substituição).

<table><tbody><tr><td>Advanced DMEM/F12&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>12634-034</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax 100x&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>35050-068</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M</td><td>Invitrogen</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin 100x</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement 50x</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>N2 supplement 100x&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>n-Acetylcysteine 500 mM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-5G</td><td></td></tr><tr><td>Mouse EGF 500 &amp;micro;g/ml</td><td>Invitrogen Biosource</td><td>PMG8043</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Noggin 100 &amp;micro;g/ml</td><td>Peprotech</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr><td>R-Spondin conditioned medium</td><td></td><td></td><td>The conditioned media is generated from HEK293 cells, for details see Sato and Clevers 2013.</td></tr><tr><td>Wnt conditioned medium</td><td></td><td></td><td>The conditioned media is generated from L cells, for details see Sato and Clevers 2013.</td></tr><tr><td>Nicotinamide 1 M</td><td>Sigma</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 10 &amp;micro;M</td><td>Sigma</td><td>Y0503-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene (8 &amp;micro;g/ml)</td><td>Sigma</td><td>H9268-5G</td><td></td></tr><tr><td>Standard BD Matrigel matrix</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td><td>Basement Matrix Extract (Cultrex PathClear BME Reduced Growth Factor Type 2, 3533-005-02)&lt;br/&gt; supplied by AMSBIO can be used as an alterntive.</td></tr><tr><td>24-well Plate</td><td>Greiner Bio One</td><td>662960</td><td></td></tr><tr><td>48-well Plate</td><td>Greiner Bio One</td><td>677980</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Sigma</td><td>A3734-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Platinum-E cells</td><td>Cell Biolabs</td><td>RV-102</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Invitrogen</td><td>A1113802</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidin</td><td>Invitrogen</td><td>A1113902</td><td></td></tr><tr><td>Polyethyleneimine (PEI)</td><td>Polysciences</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>opti-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>51985-034</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Invitrogen</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma</td><td>P7793-1EA</td><td></td></tr><tr><td>4-OHT</td><td>Sigma</td><td>H7904</td><td></td></tr></tbody></table>

a video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture

Células-tronco Lgr5-positivo pode ser complementado com o crescimento essencial fatores EGF, Noggin, e R-espondina, o que nos permite cultura cada vez maior estruturas epiteliais 3D primários in vitro. A arquitetura e fisiológicas propriedades desses &quot;mini-coragem&quot;, também chamados de Organóides, se assemelham os seus homólogos em vivo. Isso os torna um sistema modelo atraente para o pequeno epitélio intestinal. Usando transdução retroviral, genética funcionais podem agora ser realizadas por superexpressão de genes condicional ou knockdown. Este vídeo demonstra o processo de cultura organï¿½de, a geração de retrovírus, e a transdução retroviral de Organóides para auxiliar na análise fenotípica do epitélio do intestino delgado in vitro. Este sistema modelo organotípico romance, em combinação com a expressão de genes mediada retroviral fornece uma ferramenta valiosa para a análise rápida das funções de genes in vitro, sem a necessidade de costlGeração Y e demorado para animais transgênicos.

Organóides está pronto para ser dividida quando o lúmen central é escurecido devido à presença de células mortas (Figura 2). Depois de 2-3 dias de Organóides de pré-tratamento devem adotar uma morfologia cística redonda (Figura 3). Isto aumenta o número de células estaminais, aumentando as possibilidades de obtenção de integração estável. O tamanho do pelete do vírus pode variar após a centrifugação do sobrenadante viral, mais provavelmente, devido à variação de contribuição de restos celulares com o tamanho da pelota. Não foi observada correlação clara a eficiência de transdução. Durante o processo de selecção Organóides não transduzidas vai morrer, enquanto que os que tem uma integração estável permanecerá. A proteína fluorescente de retrovírus MSCV-eGFP pode ser observada em células originárias de Organóides sobreviventes, que têm uma morfologia cística, dentro de 2-3 dias após a transdução (Figura 4). <img alt<html> = &quot;Figura 1&quot; fo: Content-width = src &quot;6in&quot; = &quot;/ files / ftp_upload / 51765 / 51765fig1highres.jpg&quot; width = &quot;600&quot; /&gt; Figura 1 Uma representação esquemática do procedimento de transdução retroviral. Antes Organóides infecção são pré-tratados com ENRWntNic até adoptarem uma estrutura cística (passo 1). As células E-platina são utilizadas como a linha celular de empacotamento, e são cultivadas até atingirem uma confluência de 70-80%. Posteriormente são transfectadas com a construção retroviral usando PEI. Os vírus são recolhidos 2 dias mais tarde (passo 2). Organóides são tripsinizadas para obter fragmentos que contenham 1-10 células (passo 3), e, em seguida, são infectadas (passo 4). Seguindo spinoculation para aumentar a eficiência de infecção (passo 5), os fragmentos organï¿½de infectadas foram semeadas (passo 6) e 2-3 dias mais tarde para a selecção de clones positivos com a integração estável pode ser realizada (passo 7). &quot;Width =&quot; 1765fig2highres.jpg 500 &quot;/&gt; Figura 2 Imagem representativa de Organóides após 4-6 dias de cultura. O lúmen é preenchido com células mortas, fazendo parecer escuro. Organóides nesta fase estão prontas para serem passadas. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51765/51765fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3 Imagem representativa de pequenos Organóides intestinais cultivadas em meio ENRWntNic por 3-4 dias. Os Organóides adotar uma morfologia cística. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51765/51765fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4 Imagem representativa de pequenos Organóides intestinais (a) que mostram a expressão do transgene viral (b, eGFP). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td colspan="2"> AdvaNCED DMEM / F12 +++ </td></tr><tr><td colspan="2"> Armazenar a 4 ° C durante 4 semanas </td></tr><tr><td> Avançada DMEM / F12 </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td> Glutamax 100x </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Hepes 1 M </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Antibióticos 100x </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> ENRWntNic meio (por 20 ml) </td></tr><tr><td colspan="2"> Armazenar a 4 ° C durante 2 semanas </td></tr><tr><td> Avançada DMEM / F12 +++ </td><td> 7,2 ml </td></tr><tr><td> Suplemento de B27 (50x) </td><td> 400 ul </td></tr><tr><td> Suplemento N2 (100x) </td><td> 200 ul </td></tr><tr><td> N-acetilcisteína (500 mm) </td><td> 50 ul </td></tr><tr><td> rato de EGF (500 ng / ml) </td><td> 2 ul </td></tr><tr><td> Noggin rato (100 ug / ml) </td><td> 20 ul </td></tr><tr><td> R-espondina Conditmeio ioned </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td> Wnt3a meio condicionado </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> A nicotinamida (1 M) </td><td> 200 ul </td></tr><tr><td colspan="2"> Transdução de forma (por 20 mL) </td></tr><tr><td colspan="2"> Prepare fresco </td></tr><tr><td> Meio ENRWntNic </td><td> 20 ml </td></tr><tr><td> Y-27632 (10 uM) </td><td> 20 ul </td></tr><tr><td> Polibreno (8 ug / ml) </td><td> 20 ul </td></tr><tr><td colspan="2"> ENR meio (por 20 ml) </td></tr><tr><td colspan="2"> Armazenar a 4 ° C durante 4 semanas </td></tr><tr><td> Avançada DMEM / F12 +++ </td><td> 17,4 ml </td></tr><tr><td> Suplemento de B27 (50x) </td><td> 400 ul </td></tr><tr><td> Suplemento N2 (100x) </td><td> 200 ul </td></tr><tr><td> N-acetilcisteína (500 mm) </td><td> 50 ul </td&gt; </tr><tr><td> rato de EGF (500 ng / ml) </td><td> 2 ul </td></tr><tr><td> Noggin rato (100 ug / ml) </td><td> 20 ul </td></tr><tr><td> R-espondina meio condicionado </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Mídia para células Platinum-E (para 500 ml) </td></tr><tr><td colspan="2"> Armazenar a 4 ° C durante 12 semanas </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 449,45 ml </td></tr><tr><td> Soro Fetal de Bovino (FBS) </td><td> 50 ml </td></tr><tr><td> Puromicina (1 ug / ml) </td><td> 50 ul </td></tr><tr><td> Blasticidina (10 ug / ml) </td><td> 500 ul </td></tr></tbody></table> Tabela 1 Mídia composição for Advanced DMEM / F12 +++, médio ENRWntNic, médio Transdução, médio ENR e meio para as células Platinum-E.

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A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

Este protocolo explica cultura organóide Lgr5-positve primário eo desempenho subseqüente de transdução retroviral. Isto permite que a sobre-expressão de Cre-indutível ou knockdown do transgene entregue e permite estudos funcionais a serem realizadas no novo em organotípica vitro sistema modelo.

Um Protocolo de vídeo de infecção retroviral na Primária Intestinal organóide Cultura

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

29.7K visualizações.  University of Cambridge.  Este protocolo explica cultura organóide Lgr5-positve primário eo desempenho subseqüente de transdução retroviral. Isto permite que a sobre-expressão de Cre-indutível ou knockdown do transgene entregue e permite estudos funcionais a serem realizadas no novo em organotípica vitro sistema modelo. 

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In vitro Organoid Culture of Primary Mouse Colon Tumors

Several human and murine colon cancer cell lines have been established, physiologic integrity of colon tumors such as multiple cell layers, basal-apical polarity, ability to differentiate, and anoikis are not maintained in colon cancer derived cell lines. The present study demonstrates a method for culturing primary mouse colon tumor organoids adapted from Sato T et al. 1, which retains important physiologic features of colon tumors. This method consists of mouse colon tumor tissue collection, adjacent normal colon epithelium dissociation, colon tumor cells digestion into single cells, embedding colon tumor cells into matrigel, and selective culture based on the principle that tumor cells maintain growth on limiting nutrient conditions compared to normal epithelial cells.
The primary tumor organoids if isolated from genetically modified mice provide a very useful system to assess tumor autonomous function of specific genes. Moreover, the tumor organoids are amenable to genetic manipulation by virus meditated gene delivery; therefore signaling pathways involved in the colon tumorigenesis could also be extensively investigated by overexpression or knockdown. Primary tumor organoids culture provides a physiologic relevant and feasible means to study the mechanisms and therapeutic modalities for colon tumorigenesis.

In vitro Organoid Culture of Primary Mouse Colon Tumors

A simple method to establish primary murine colon tumor organoid is described. This method utilizes the feature that colon tumor cells survive and grow into organoids in media containing limited growth factors, whereas normal colon epithelial do not.

Em organoide Cultura in vitro de primário do mouse tumores do cólon

Several  human and murine colon cancer cell lines have been established, physiologic  integrity of colon tumors such as multiple cell layers, basal-apical ...

Medicina

Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to manipulate gene expression in organoids have made limited progress in this arena. While CRISPR/Cas9 technology allows for precise genome editing of cells for organoid generation, this strategy requires extensive selection and screening by sequence analysis, which is both time-consuming and costly. Here, we provide a detailed protocol for efficient viral transduction of intestinal organoids. This approach is rapid and highly efficient, thus decreasing the time and expense inherent in CRISPR/Cas9 technology. We also present a protocol to generate frozen sections from intact organoid cultures for further analysis with immunohistochemical or immunofluorescent staining, which can be used to confirm gene expression or silencing. After successful transduction of viral vectors for gene expression or silencing is achieved, intestinal stem cell and crypt function can be rapidly assessed. Although most organoid studies employ in vitro assays, organoids can also be delivered to mice for in vivo functional analyses. Moreover, our approaches are advantageous for predicting therapeutic responses to drugs because currently available therapies generally function by modulating gene expression or protein function rather than altering the genome.

We describe step-by-step instructions to: 1) efficiently engineer intestinal organoids using magnetic nanoparticles for lenti- or retroviral transduction, and, 2) generate frozen sections from engineered organoids. This approach provides a powerful tool to efficiently alter gene expression in organoids for investigation of downstream effects.

Engenharia genética de organóides intestinais do camundongo primário usando vetores virais de transdução de nanopartículas magnéticas para seccionamento congelado

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to ...

Biologia do Desenvolvimento

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the complexities of the organoid growth characteristics carry significant caveats for the investigator. Specifically, the growth patterns of each individual organoid are highly variable and create a heterogeneous population of epithelial cells in culture. With such caveats, common tissue culture practices cannot be simply applied to the organoid system due to the complexity of the cellular structure. Counting and plating based solely on cell number, which is common for individually separated cells, such as cell lines, is not a reliable method for organoids unless some normalization technique is applied. Normalizing to total protein content is made complex due to the resident protein matrix. These characteristics in terms of cell number, shape and cell type should be taken into consideration when evaluating secreted contents from the organoid mass. This protocol has been generated to outline a simple procedure to culture and treat small intestinal organoids with microbial pathogens and pathogen associated molecular patterns (PAMPs). It also emphasizes the normalization techniques that should be applied when protein analysis are conducted after such a challenge.

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Here, a protocol to harvest, maintain, and treat mouse small intestinal organoids with pathogen associated molecular patterns (PAMPs) and Listeria monocytogenes is described, as well as emphasis on gene expression and proper normalization techniques for protein.

o<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura e Reconhecimento de Padrões Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organóides

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the ...

Imunologia e Infecção

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or postmitotic neurons. Later, some progenitors switch to a gliogenic fate, adding to the astrocyte and oligodendrocyte populations. Using time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cell cultures, it is possible to study the cellular and molecular mechanisms controlling the mode of cell division and cell cycle parameters of progenitor cells. Similarly, the fate of postmitotic cells can be examined using cell-specific fluorescent reporter proteins or post-imaging immunocytochemistry. More importantly, all these features can be analyzed at the single-cell level, allowing the identification of progenitors committed to the generation of specific cell types. Manipulation of gene expression can also be performed using viral-mediated transfection, allowing the study of cell-autonomous and non-cell-autonomous phenomena. Finally, the use of fusion fluorescent proteins allows the study of symmetric and asymmetric distribution of selected proteins during division and the correlation with daughter cells fate. Here, we describe the time-lapse video-microscopy method to image primary cerebral cortex murine cells for up to several days and analyze the mode of cell division, cell cycle length and fate of newly generated cells. We also describe a simple method to transfect progenitor cells, which can be applied to manipulate genes of interest or simply label cells with reporter proteins.

Live imaging is a powerful tool to study cellular behaviors in real time. Here, we describe a protocol for time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cells that allows a detailed examination of the phases enacted during the lineage progression from primary neural stem cells to differentiated neurons and glia.

Viver a imagem das células do córtex Cerebral primário usando um sistema de cultura 2D

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Neurociência

Studying Cryptosporidium Infection in 3D Tissue-derived Human Organoid Culture Systems by Microinjection

Cryptosporidium parvum is one of the major causes of human diarrheal disease. To understand the pathology of the parasite and develop efficient drugs, an in vitro culture system that recapitulates the conditions in the host is needed. Organoids, which closely resemble the tissues of their origin, are ideal for studying host-parasite interactions. Organoids are three-dimensional (3D) tissue-derived structures which are derived from adult stem cells and grow in culture for extended periods of time without undergoing any genetic aberration or transformation. They have well defined polarity with both apical and basolateral surfaces. Organoids have various applications in drug testing, bio banking, and disease modeling and host-microbe interaction studies. Here we present a step-by-step protocol of how to prepare the oocysts and sporozoites of Cryptosporidium for infecting human intestinal and airway organoids. We then demonstrate how microinjection can be used to inject the microbes into the organoid lumen. There are three major methods by which organoids can be used for host-microbe interaction studies&#8212;microinjection, mechanical shearing and plating, and by making monolayers. Microinjection enables maintenance of the 3D structure and allows for precise control of parasite volumes and direct apical side contact for the microbes. We provide details for optimal growth of organoids for either imaging or oocyst production. Finally, we also demonstrate how the newly generated oocysts can be isolated from the organoid for further downstream processing and analysis.

Studying Cryptosporidium Infection in 3D Tissue-derived Human Organoid Culture Systems by Microinjection

We describe protocols to prepare oocysts and purify sporozoites for studying infection of human intestinal and airway organoids by Cryptosporidium parvum. We demonstrate the procedures for microinjection of parasites into the intestinal organoid lumen and immunostaining of organoids. Finally, we describe the isolation of generated oocysts from the organoids.

Estudando infecção por Cryptosporidium em sistemas de cultura Organóide humano derivado do tecido 3D por microinjeção

Cryptosporidium parvum is one of the major causes of human diarrheal disease. To understand the pathology of the parasite and develop efficient drugs, an ...

Adapting Gastrointestinal Organoids for Pathogen Infection and Single Cell Sequencing under Biosafety Level 3 (BSL-3) Conditions

Human intestinal organoids constitute the best cellular model to study pathogen infections of the gastrointestinal tract. These organoids can be derived from all sections of the GI tract (gastric, jejunum, duodenum, ileum, colon, rectum) and, upon differentiation, contain most of the cell types that are naturally found in each individual section. For example, intestinal organoids contain nutrient-absorbing enterocytes, secretory cells (Goblet, Paneth, and enteroendocrine), stem cells, as well as all lineage-specific differentiation intermediates (e.g.,&#160;early or immature cell types). The greatest advantage in using gastrointestinal tract-derived organoids to study infectious diseases is the possibility of precisely identifying which cell type is targeted by the enteric pathogen and to address whether the different sections of the gastrointestinal tract and their specific cell types similarly respond to pathogen challenges. Over the past years, gastrointestinal models, as well as organoids from other tissues, have been employed to study viral tropism and the mechanisms of pathogenesis. However, utilizing all the advantages of using organoids when employing highly pathogenic viruses represents a technical challenge and requires strict biosafety considerations. Additionally, as organoids are often grown in three dimensions, the basolateral side of the cells is facing the outside of the organoid while their apical side is facing the inside (lumen) of the organoids. This organization poses a challenge for enteric pathogens as many enteric infections initiate from the apical/luminal side of the cells following ingestion. The following manuscript will provide a comprehensive protocol to prepare human intestinal organoids for infection with enteric pathogens by considering the infection side (apical vs. basolateral) to perform single-cell RNA sequencing to characterize cell-type-specific host/pathogen interactions. This method details the preparation of the organoids as well as the considerations needed to perform this work under biosafety level 3 (BSL-3) containment conditions.

Adapting Gastrointestinal Organoids for Pathogen Infection and Single Cell Sequencing under Biosafety Level 3 BSL-3 Conditions

This protocol describes how to infect human intestinal organoids from either their apical or basolateral side to characterize host/pathogen interactions at the single-cell level using single-cell RNA sequencing (scRNAseq) technology.

Adaptação de organoides gastrointestinais para infecção por patógenos e sequenciamento de células únicas sob condições de nível de biossegurança 3 (BSL-3)

Human intestinal organoids constitute the best cellular model to study pathogen infections of the gastrointestinal tract. These organoids can be derived ...

Co-Culture of Murine Small Intestine Epithelial Organoids with Innate Lymphoid Cells

Complex co-cultures of organoids with immune cells provide a versatile tool for interrogating the bi-directional interactions that underpin the delicate balance of mucosal homeostasis. These 3D, multi-cellular systems offer a reductionist model for addressing multi-factorial diseases and resolving technical difficulties that arise when studying rare cell types such as tissue-resident innate lymphoid cells (ILCs). This article describes a murine system that combines small intestine organoids and small intestine lamina propria derived helper-like type-1 ILCs (ILC1s), which can be readily extended to other ILC or immune populations. ILCs are a tissue-resident population that is particularly enriched in the mucosa, where they promote homeostasis and rapidly respond to damage or infection. Organoid co-cultures with ILCs have already begun shedding light on new epithelial-immune signaling modules in the gut, revealing how different ILC subsets impact intestinal epithelial barrier integrity and regeneration. This protocol will enable further investigations into reciprocal interactions between epithelial and immune cells, which hold the potential to provide new insights into the mechanisms of mucosal homeostasis and inflammation.

This protocol offers detailed instructions for establishing murine small intestine organoids, isolating type-1 innate lymphoid cells from the murine small intestine lamina propria, and establishing 3-dimensional (3D) co-cultures between both cell types to study bi-directional interactions between intestinal epithelial cells and type-1 innate lymphoid cells.

Co-Cultura de Organoides Epiteliais do Intestino Delgado Murine com Células Linfoides Inatas

Complex co-cultures of organoids with immune cells provide a versatile tool for interrogating the bi-directional interactions that underpin the delicate ...

Imagem de cálcio de monocamadas organoides intestinais humanas infectadas por vírus

Live Calcium Imaging of Virus-Infected Human Intestinal Organoid Monolayers Using Genetically Encoded Calcium Indicators

Calcium signaling is an integral regulator of nearly every tissue. Within the intestinal epithelium, calcium is involved in the regulation of secretory activity, actin dynamics, inflammatory responses, stem cell proliferation, and many other uncharacterized cellular functions. As such, mapping calcium signaling dynamics within the intestinal epithelium can provide insight into homeostatic cellular processes and unveil unique responses to various stimuli. Human intestinal organoids (HIOs) are a high-throughput, human-derived model to study the intestinal epithelium and thus represent a useful system to investigate calcium dynamics. This paper describes a protocol to stably transduce HIOs with genetically encoded calcium indicators (GECIs), perform live fluorescence microscopy, and analyze imaging data to meaningfully characterize calcium signals. As a representative example, 3-dimensional HIOs were transduced with lentivirus to stably express GCaMP6s, a green fluorescent protein-based cytosolic GECI. The engineered HIOs were then dispersed into a single-cell suspension and seeded as monolayers. After differentiation, the HIO monolayers were infected with rotavirus and/or treated with drugs known to stimulate a calcium response. An epifluorescence microscope fitted with a temperature-controlled, humidified live-imaging chamber allowed for long-term imaging of infected or drug-treated monolayers. Following imaging, acquired images were analyzed using the freely available analysis software, ImageJ. Overall, this work establishes an adaptable pipeline for characterizing cellular signaling in HIOs.

Autor em destaque: Investigando a interrupção viral da sinalização epitelial intestinal - insights de pesquisa e direções futuras 

This protocol describes an approach for performing calcium imaging in virus-infected human intestinal organoids and offers an approach to analysis.

Imagem de cálcio vivo de monocamadas organoides intestinais humanas infectadas por vírus usando indicadores de cálcio codificados geneticamente

Calcium signaling is an integral regulator of nearly every tissue. Within the intestinal epithelium, calcium is involved in the regulation of secretory ...

Um Protocolo de vídeo de infecção retroviral na Primária Intestinal organóide Cultura

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Imagem de cálcio vivo de monocamadas organoides intestinais humanas infectadas por vírus usando indicadores de cálcio codificados geneticamente

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