、F30 DC011673（GFH：NINDS、NIH）およびUTの南西のスタートアップ資金（JPM）：本研究は、R00 DC011780（NINDS、NIH JPM）によってサポートされていました。

全ての実験は、UTの南西施設内動物管理使用委員会によって承認されたプロトコールに従って実施し、実験動物が経験するストレス、不快感や痛みを最小にするように選択した。 1。解剖会議所カスタム解剖室と小さな、薄いプラスチック板は、最良の結果（ 図1）のために必要とされる。このプロトコルを試みる前に、チャンバを構築するか、入手する。 2。解剖ソリューション<ol><li>ステップ3.22から5.4で使用するための標準的な人工脳脊髄液（ACSF）を1リットル調製。 NaClを125 mMの塩化カリウム2.5 mMの塩化カルシウム2 mMのMgCl 2を 1 mMの、 炭酸水素ナトリウム25 mMののNaH 2 PO 4 1.25ミリモル、ミオイノシトール3 mMのピルビン酸ナトリウム2mMの、アスコルビン酸ナトリウム0.4ミリメートル追加し、25グルコースmMの発熱物質を含まない水1Lに。 </li><li>初期解剖のaCSF（200ミリリットル）を準備ステップ3.3から3.22で使用しています。標準のACSF 200ミリリットルを取り、 塩化マグネシウム水和物0.366グラムを追加することにより、9㎜のMgCl 2濃度を高めています。 </li><li> NaClを115 mMの塩化カリウム5mmでのCaCl 2、2 mMのMgCl 2を 、2 mMの、 炭酸水素ナトリウム25 mMのHEPES 10 mMのを含むステップ4.11から5.4で使用するためのカニューレを通じてVNOへの刺激を運ぶために、標準のリンゲル液を準備し、 10 mMのグルコース。 </li><li>気泡使用するまで15分間で最低37℃の水浴中で95％O 2、5％CO 2ガスで標準のaCSFおよびリンガー0.5 L 0.8 L。 </li><li>バブル95％O 2との初期切開のaCSF 200mlを、それを4℃で15〜20分間、氷上で5％のCO 2ガスに達するまで</li></ol> 3。プライマリ解剖<ol><li>解剖エリアを準備します。 3 35ミリメートルペトリ皿、酸素化aCSFを、断頭はさみ、ストレートはさみを解剖、解剖ハサミを湾曲、アドソン鉗子、＃11頭皮を配置エルブレードとハンドルと氷上でかみそりの刃。 </li><li>酸素化aCSFは4℃に冷却した後、深くIsothesia 2〜5ミリリットル（99.9％イソフルラン）を用いて乾燥チャンバー内に動物を麻酔する。動物が深く麻酔であることを保証するために、尾、足のピンチテストを実行します。 </li><li>深麻酔が確認されると、動物を斬首し、すぐにチルド解剖のaCSFで満たされたペトリ皿に頭を置く。注：使用しないときは、作業中はクールに保つために冷蔵解剖のaCSFで組織を浸します。 </li><li>湾曲したハサミで下側面（腹咽頭、下顎、舌）を取り外します。 </li><li>アドソン鉗子deglove（皮）表面的な皮膚や頭蓋骨から筋肉の添付ファイルを使用して。ピールは、添付ファイルの唯一のサイトまで、尾側から吻側への頭皮は前歯を超えている。湾曲したハサミを使用して接続ポイントで組織を切断する。ピンセットでそれをつかんで目を削除し、準備から引き離す。 N耳degloving手順の最後には、上顎骨のない筋肉の添付ファイルにアドソン鉗子を使用して、繊細な鼻軟骨に無理な力を避ける。注：ストレートはさみで頭蓋骨の尾側面から頭皮を外します。 </li><li>シザーヒントは前頭骨（直前嗅脳洞へ）に数mmになるまでまっすぐハサミで、吻側に尾側から頭蓋骨の正中線を削減。 </li><li>アドソン鉗子を使用して頭蓋骨の頭頂と前頭骨を取り除きます。注：前頭骨の破片は、多くの場合、鼻腔洞への尾鼻の骨に付着したままになります。嗅球に連絡しないように注意し、慎重にこれらの作品を削除します。 </li><li>副鼻腔に前頭葉2ミリメートルの尾によって冠状カットを行ってからカットして、脳の尾を削除するために、メスを使用しています。完全に事後組織を切断するために、メス接点腹頭蓋骨の骨の輪郭の先端を確認してください。注：これは有効に横嗅覚路や嗅球の機械的ストレスをかけることなく、脳の大半を除去する。 </li><li>ストレートはさみで腹頭蓋骨の露出尾側面を外します。副鼻腔、残りの神経組織を残す。 </li><li>まっすぐはさみを使って頭蓋骨の解剖学的右側頬骨弓や顔の筋肉を取り除く</li><li>口の屋根を公開する（腹側を上にして）鼻を裏返します。 </li><li>切歯のすぐ尾味覚をカットし、削除します。口の屋根に口蓋と平行の下でメスの刃の先端を挿入することで、これを行うと、その後切歯に向けてブレードを移動します。 </li><li>アドソン鉗子と口蓋の解放（吻側）の端を持ち、尾側に引いて外します。 </li><li>頭蓋骨の解剖学的左側に、臼歯の近くの小さな孔から開始し、尾側口蓋孔を拡張するために手術用メスの刃を使用しています。メスのblaの先端を挿入することによってこれを達成する臼歯の近くに無効に解除し、手首を回転させる。注：ブレードの先端のみを使用し、細心の注意を払ってください - 深いカットが中隔組織を損傷する可能性が。 </li><li>メスの刃の先端を使用して、解剖学的左鋤鼻器官に吻側を開始、切歯を通じて口蓋孔からカット。複数のスコアリングカットを使用してください。深すぎるのブレードを挿入することにより、中隔組織と鋤鼻神経を損傷しないようにしてください。 </li><li>背側頭蓋骨が上を向いているので、組織をオンにしてから、準備の尾エッジに垂直にまっすぐかみそりの刃（正中線に平行）に向けます。 </li><li>組織の腹側縁で、すぐに正中線の左にカミソリの刃の刃先をタッチします。そっと刃を揺すると、左口蓋孔（ステップ3.14で導入された領域をカット）に沿って移動する。 </li><li>組織の背側縁部に、正中線のすぐ左（1mm未満）をかみそりの刃先を配置する。 </li><li>保管ブレードは、組織の前方に向けて圧力を徐々にカミソリの刃を揺らし、正中線に平行である。篩板の抵抗に注目してください。この抵抗を突破した直後に停止します。注：この時点では、右半球は左半球から緩める。唯一残っている接続は、篩板の背側鼻前部に沿って半球の間にある。 </li><li>手袋をした指で尾側に近く、それらをつかみ、ゆっくりと横方向に前方にそれらを回転させて半球を分離する。注：この手順は、特にずれたか脆いsnouts（ 例えば 、高齢のマウス）を用いたマウスでは、実験的な変動性の源である。強い抵抗に遭遇した場合にも、互いに離れる半球を回転しようとしたときに、結合組織を弱める背側鼻（篩板の前方に）スコア。そうする間に、中隔TIが損傷することができ、深くメスを挿入しない細心の注意を取るssueと鋤鼻神経。 </li><li>板に組織接着剤を少量（50〜100μl）をつけて軽くアドソン鉗子を使用して、接着剤の上に右半球の側縁に配置します。板に時期尚早グルー重合、緩い付着を防止するために、ペーパータオルを使用して準備の側面から余分な水分を取り除きます。 NOTE：組織が接着剤の上に配置された後に接着剤の重合を促進するために試料に冷却した切開のaCSF数滴を適用する。これは、組織が板にしっかりと保持保たれます。 </li><li>二解剖室の中央に真空グリースを少量（3〜5ミリメ​​ートル、直径、深さ2mm）を置き、しっかりとグリースに対して組織反対板の側面に配置します。すぐに細かい解剖領域に転送し、酸素化標準のaCSFで灌流を開始、チルド解剖のaCSFと解剖室を埋める。オリエント板嗅球が直接になるように新鮮に酸素化され、標準のACSFストリーム。 </li></ol> 4。二解剖<ol><li>細かい鉗子を使用して製剤から目に見える反対側（左）嗅球または皮質組織を除去する。 （半鈍点を形成する）細かい鉗子を一緒につまんで、その後、正中線に近い背側組織の尾の部分に配置します。そっと前方運動でゆっくりと右半球から組織を剥離し、正中線に沿って挟ま鉗子を実行します。対側嗅球組織を含む反対組織のすべてを削除します。 AOBまたは鋤鼻神経に損傷を引き起こす可能性が組織を通して刺ししないよう十分注意してください。 </li><li>嗅球の背側/内側表面に沿って白い硬膜を観察します。細かい鉗子の2ペアが硬膜の白い部分に把握することで、嗅球の背側/尾側縁に沿って、この硬膜を引き裂き、そのポイントからそれらを離れて引っ張る。硬膜はしっかりある嗅球に巻きつけ、それが削除されている間に簡単に、それ自体の組織をスライスすることができます。嗅球とAOB自体の内側面への損傷を避ける。注：硬膜がこの時点で簡単に引き裂く抵抗する場合は、分離を容易にするために、春の先端解剖ハサミで小さなカットをご紹介します。 </li><li>じっくりと根本的嗅球にダメージを与えることなく、細かい鉗子で前頭皮質を剥離し。 AOBのすぐ尾側半透過ネットとして現れる血管のコレクションを遵守してください。電気生理学的実験で電極への浸透を促進するために、細かい鉗子でこのネットを削除します。それは、前頭皮質の後退中のAOBから離れるようにピンセットでネットをつかみ、AOBに触れないように注意しながら、尾側および内側引いてそれを削除します。前頭皮質は、嗅球から分離された後、AOBに腹と後ピンセットで切断して取り外します。注：元を取るそれはあまりにも大まかに行われた場合、ネットを除去しながら注意してエクストリームのための糸球体層が損傷を受けることがあります。 </li><li>公開される対側鼻腔では、細かい鉗子を使用して、残りの反対側の中隔組織（血管を含んだ薄っぺらな黄色がかったシート）を削除します。 （中隔の骨の近く）尾/背部で組織を把持した後、前方側へ組織を持ち上げ/引き出します。 NOTE：対側性中隔組織が誤って片側切断工程（ステップ3.20）の間に除去することができる。このような場合には、白、無血管中隔の軟骨とやや透明、血管化中隔の骨を観察します。この場合は、ステップ4.4を省略することができる。 </li><li>慎重に中隔の軟骨とVNO「翼」（両方VNOsの背側縁に沿って走る骨組織の薄片の間の微妙な鉗子の一点を実行することで、対側VNOを削除します。 <ol><li>軟骨から翼離脱に続いて、腹側に鉗子の先端を移動させる正中線に近い反対VNOへ。鉗子でつかんで離し持ち上げることにより、それを削除することを可能にする、それを緩め、反対VNOの頭側/尾側軸に沿っていくつかの場所で、この手順を繰り返します。 </li></ol></li><li>細かい鉗子で（それは中隔の骨の腹側縁部に沿って実行されている白の無血管帯に狭くなっている）尾/腹側縁部でカットすることにより、中隔の軟骨を除去するための準備をします。 </li><li>半鈍ポイントを作るために一緒に細かい鉗子をつまんで中隔の軟骨を除去します。ステップ4.6で行われたカットを識別し、そのカットする（横）の背後に挟ま鉗子を挿入し、ゆっくりと中隔組織から吻側進ん軟骨を持ち上げます。注：基礎となる中隔組織を混乱しないでください。軟骨を持ち上げたように、軟骨の緩い癒着に起因する中隔組織伸張の基盤となるシートを観察します。緩いAの、このサイトに沿って挟ま細かい鉗子の、定期的な穏やかな、安定した動きdhesionが大きく二つの構造の正常な分離を容易にすることができる。 </li><li>中隔骨を除去するために曲がった先端で第3位ピンセットを使用してください。中隔の骨の面に対してほぼ平行な角度で中隔骨にアプローチ。中隔組織と骨との間の中隔湾曲したコーディネートを挿入します。鉗子で骨をつかみ、ゆっくりと篩板の近くにひびまで前後に骨を移動します。注：場合によっては、中隔の骨は篩板の近くに崩壊に抵抗する。この場合は、静かにちょうどステップ4.8を繰り返した後、篩板の前方背側/腹軸に沿って中隔の骨を獲得するために細かい鉗子を使用しています。 </li><li>入口で細かい鉗子の1対つまんと細かい鉗子の別のペアで吻側引いて、VNOのすぐ吻側白い軟骨を除去します。 </li><li>速い灌流装置へポリイミドカニューレを取り付け、ポリイミドカニューレを通してリンゲル液（0.1〜0.3ミリリットル/分）の流れを開始する。NOTE：イン·ライン、小体積流量計で測定流量。コンピュータ制御の空気圧刺激スイッチング素子の使用は、刺激中の流量の変化を減少させる。応答が刺激固有であることを確認するために（リンゲル液をコントロールする）モック刺激に対する応答と刺激をテストするための神経応答を比較。 </li><li> VNOの入り口にカニューレ平行に向けます。カニューレは良好VNOの入口に平行であるときに出口圧力がVNOをさせるように、血管の排気を導く「膨張」腕時計。すぐにそれはVNO開口部と平行に維持されるように、カニューレを一定の角度を保ち、VNOにカニューレを挿入します。注：プラスチック製の板に対する細かい鉗子の1対のカニューレを保持し、やや上向きに角度をカニューレの端を細い鉗子の別のペアを使用するために役立ちます。 1が誤ってVNOの後ろにカニューレを配置した場合、流出もVNO血管を引き起こす可能性があります避難する、適切なカニュレーションが行われた印象につながる。適切な場所は、リンゲル液中の染料を組み込むことによって確認することができる。カニューレが適切に配置されると、色素だけべきVNOの入口を介して出口。また、1は、カニューレがVNOの半透明の内側面を通して簡単に表示されていることを保証することにより、適切な配置を確認することができます。 </li><li> AOBはVNOからカニューレを落とさないように注意して、標準のACSF直接流れになるまで、ゆっくりとプラスチック板を移動します。解剖が完了し、生理的機能の評価がすぐに開始することができる。ステップ5簡単な評価を行うための1つのアプローチについて説明します。 </li></ol> 5。評価<ol><li>外アンプとオシロスコープに接続され、2〜4MΩのホウケイ酸ガラス微小電極をAOBの表面に浸透。 </li><li>ゆっくりと100〜200ミクロンの深さまで微小電極を進める50ミクロン/分の速度で表面。注：この組織深さで、1は、微小電極電圧の急激な、簡単な（〜1〜2ミリ秒）のたわみにより例示される時々の自発的な活動電位波形を発生します。 </li><li>活動電位波形に遭遇すると、微小電極を進めて停止します。 </li><li>観察、および/ ​​またはVSN活動の既知の活性化（ 例えば 、50のKClを含むリンゲル液）に制御リンゲルから刺激配信ソリューションを変えながら活動電位率を記録。切開が成功した場合は、活動電位速度または局所電場電位の刺激依存性変化を観察することができる。注：すべてのAOBニューロンは（50 mMのKClを含むリンゲル液を含む）発火率の増加に伴ってすべての刺激に応答します。発火率の刺激依存性の減少はまた、機能の接続性と成功解剖を示している。二つ以上のニューロンが発生した場合には、そのVNOの刺激に応答しない場合、または活動電位が複数の電極の貫通後に観察されていない場合、これは失敗した解剖を示唆している。この場合、新たな切開は、ステップ3で開始することができる。 </li></ol>

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著者らは、開示することに関心の有意な競合がありません。

このプロトコルで説明VNO-AOB ex vivoでの準備は、in vivo 5-7急性ライブスライスAOB機能の17の実験で麻酔をするのに便利な代替手段です。また、電気生理学的および光学的記録のために回路素子を公開急性AOBスライス実験とは異なり、この準備は、すべての感覚求心性神経内およびAOBの接続を保持します。これはまた、in vivoでのアプローチで 、麻...

哺乳動物の脳における感覚処理は、典型的には、感覚入力から特定の特徴を抽出する各々は、複数の相互に接続された神経回路にまたがる。感覚経路では、初期の情報処理は、通常の認知と行動のために不可欠である。付属品嗅覚系（AOS）は、副嗅球（AOB）はホルモンバランス1,2、攻撃3、および覚醒4を指示下流構造に感覚周辺を結ぶ主要な神経回路である。このように、この回路内の情報処理が強く、動物の行動の変化にリンクされている。 副嗅球が密集下に主嗅球（MOB）の背側/尾側/後面に、マウスとラットに位置しており、嗅脳洞の血管化。 AOBは、鋤鼻器（VNO）に存在する末梢鋤鼻感覚ニューロン（のVSN）の軸索から求心性神経支配を受け、Smalのただ、軟口蓋上​​前歯鼻がLブラインドエンドチューブ。これらの軸索は、鼻腔の内側境界で中隔組織の繊細なシートを横断する。いくつかの研究は、麻酔したマウス5-7または自由に探索した動物8を用いてインビボで （マウスの尿など）のAOS悪臭の源へのAOBの神経応答をプロービングしています。英雄は、（a）は、気管切開の不揮発性悪臭を導入する深麻酔を確保し、液体の刺激5-7の吸引を防ぐため、交感神経頸神経節6や鋤鼻器5,7の直接カニュレーションの（b）の刺激に関与in vivo試験で麻酔しそして（c）前頭葉切除の有無にかかわらず開頭術は、AOB 6に電極進出を可能にする。アウェイク/研究のマイクロドライブの8月10日 、関係外科的移植を振る舞う。要するに、これらの実験パラダイムは強力ですが、非常に困難で、多くの場合、全身麻酔を必要とする。 11月15日に、本 ​​体（ex vivoで ）外で生きている感覚な構造と下流の神経回路を維持しようとしました。 VNOとAOBとの間の接続は、同側のままであり、正中中隔組織は、単一の半 ​​球に酸素化superfusateに露出することができるので、我々は、それらの機能的接続性を維持しながら、これらの構造を単離するためにこのような単一の半 ​​球ex vivoでのアプローチを開発しようとしたためである。我々は最近、この目標16を達成することに成功しました。 （正中ソフト中隔組織に沿って）軸索とAOBの両方が酸素化された人工脳脊髄液を（灌流にアクセス可能な、比較的浅い&lt;600μmの特徴であるため、6時間 - この準備には、少なくとも4生きていると、機能的に接続され、VNOとAOBの両方を保持しますaCSFは）。このVNO-AOB ex vivoで準備が薄いカニューレを介して、VNOに制御刺激の導入を可能にし、目標と電極配置および/またはライブ蛍光顕微鏡用の小さなAOBへの直接視覚的にアクセス。一つは麻酔薬の非存在下でこれらの回路を研究することを望む場合、この方法は有利である。このアプローチは、遠心の接続を切断するので、ウェルAOB機能の変調に遠心問い合わせには適していない。 VNO-AOB ex vivoで準備が学ぶことは困難ですが、一度達成し、この強力な感覚回路の回路構成、情報処理、および神経可塑性を調査する際に信頼性の高いプラットフォームを生成します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Straight Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14002-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors-Straight</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors-Curved</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14061-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11006-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#3 Scalpel Handle</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#11 Scalpel Blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>3120030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Carbon Steel Razor Blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Petri Dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Chamber</td>
			<td>Custom&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>See Fig. 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delrin plastic plank 0.6 cm x 1.5 cm x 0.1 cm</td>
			<td>Custom&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning Silicon Vacuum grease</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>146355D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#5 Forceps, Student</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#5 Forceps, Biologie Tip</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#5 Forceps, Student</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.0045&#34; Polyimide Tubing</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>823400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/16&#34; Male Luer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-45505-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/16&#34; Tubing</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-171-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two ton epoxy</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>5E157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ValveBank Pressurized Perfusion Kit</td>
			<td>AutoMate Scientific</td>
			<td>09-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ValveLink digital/manual controller</td>
			<td>AutoMate Scientific</td>
			<td>01-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>myo-inositol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-ascorbate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo preparations of the intact vomeronasal organ and accessory olfactory bulb

マウス付属嗅覚システム（AOS）は、不揮発性、社会的な臭い、フェロモン、およびカイロモンを検出するための専門的な感覚経路である。 AOS経路の最初の神経回路は、副嗅球（AOB）と呼ばれる、そのような領土侵略や交配などの性の典型的な行動を確立する上で重要な役割を果たしている。この小さな（&lt;1ミリメートル3）回路は、同種の分泌物や排泄物中の化学感覚手がかりから性別、歪み、ストレスなどのユニークな行動の状態を区別するための能力を持っています。このシステムのコンパクトな組織は同時に、回路の大部分から記録するためのユニークな機会を提供しながら、AOBにおける感覚処理の調査は主に脳内でその実験的に不利な場所に、依然として厳しい。ここでは、接続したまま、前のマウスの頭蓋骨の単一半球の内側にそのままAOBを削除多段解剖を実証そのまま周辺鋤鼻感覚ニューロン（のVSN）、および局所神経回路の両方にイオン。手順は、麻酔薬の非存在下でのAOB回路素子からの電気生理学的および光学的記録を容易に目視検査を指示するAOBの表面を露光する。のVSNを収容する鋤鼻器（VNO）の中に細いカニューレを挿入すると、1は直接AOB下流の活動を記録しながら、社会的な臭いやフェロモンに周囲を公開することができます。この手順では、行動の変化へのフェロモンの暴露をリンクメカニズムに光を当てることができ、AOS情報処理に制御問い合わせを可能にします。

この準備と成功を達成することは、大規模な練習が必要ですし、それが失敗する可能ないくつかのステップがあります。一つは、成功を達成する前に、多くの試みを必要とするように期待してください。カスタム解剖室は、このプロトコルが正常に完了するために必要であり、事前の解剖の後の段階を開始する取得する必要があります。 図1に示すチャンバ設計は、この目的のた...

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Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

マウス副嗅球（AOB）は、感覚コーディングのコンテキストで勉強することは困難であった。ここでは、AOBニューロンは、マウスのフェロモンとカイロモンの情報処理の研究を容易にする、その周辺の入力に機能的に接続されたままでいるエクスビボ製剤を生成する解剖を示す。

無傷の鋤鼻器官と副嗅球のex vivoでの準備

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

ex-vivo-preparations-intact-vomeronasal-organ-accessory-olfactory

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

10.7K ビュー.  UT Southwestern Medical Center. マウス副嗅球（AOB）は、感覚コーディングのコンテキストで勉強することは困難であった。ここでは、AOBニューロンは、マウスのフェロモンとカイロモンの情報処理の研究を容易にする、その周辺の入力に機能的に接続されたままでいるエクスビボ製剤を生成する解剖を示す。 

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Multielectrode Array Recordings of the Vomeronasal Epithelium

Understanding neural circuits requires methods to record from many neurons simultaneously. For in vitro studies, one currently available technology is planar multielectrode array (MEA) recording. Here we document the use of MEAs to study the mouse vomeronasal organ (VNO), which plays an essential role in the detection of pheromones and social cues via a diverse population of sensory neurons expressing hundreds of types of receptors. Combining MEA recording with a robotic liquid handler to deliver chemical stimuli, the sensory responses of a large and diverse population of neurons can be recorded. The preparation allows us to remove the intact neuroepithelium of the VNO from the mouse and stimulate with a battery of chemicals or potential ligands while monitoring the electrical activity of the neurons for several hours. Therefore, this technique serves as a useful method for assessing ligand activity as well as exploring the properties of receptor neurons. We present the techniques needed to prepare the vomeronasal epithelium, MEA recording, and chemical stimulation.

Multielectrode array (MEA) recordings provide a method for studying the electrical activity of large populations of neurons. Here, we present the details of a MEA preparation to record from the mouse vomeronasal epithelium while simultaneously stimulating the tissue.

鋤鼻上皮の多電極アレイ録音

Understanding neural circuits requires methods to record from many neurons simultaneously. For in vitro studies, one currently available technology is ...

神経科学

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

無傷の感覚器官の前駆細胞の生細胞イメージングショウジョウバエ蛹

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the olfactory bulb (OB). The molecular mechanisms of OSN axon growth and targeting are not well understood. Manipulating gene expression and subsequent 
visualizing of single OSN axons and their terminal arbor morphology have thus far been challenging. To study gene function at the single cell level within a specified 
time frame, we developed a lentiviral based technique to manipulate gene expression in OSNs in vivo. Lentiviral particles are delivered to OSNs by microinjection 
into the olfactory epithelium (OE). Expression cassettes are then permanently integrated into the genome of transduced OSNs. Green fluorescent protein expression 
identifies infected OSNs and outlines their entire morphology, including the axon terminal arbor. Due to the short turnaround time between microinjection and 
reporter detection, gene function studies can be focused within a very narrow period of development. With this method, we have detected GFP expression within as 
few as three days and as long as three months following injection. We have achieved both over-expression and shRNA mediated knock-down by lentiviral microinjection. 
This method provides detailed morphologies of OSN cell bodies and axons at the single cell level in vivo, and thus allows characterization of candidate gene function 
during olfactory development.

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

We present a lentiviral technique for genetic manipulation and visualization of single olfactory sensory neuron axon and its terminal arborization in vivo.

嗅神経細胞のレンチウイルスを介した遺伝子操作と可視化 in vivoで</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific regions of developing embryos, including those of C. elegans, chick, Xenopus, zebrafish, and mouse 1. In zebrafish, in vivo electroporation has been shown to have excellent spatial and temporal resolution for the delivery of these reagents 2-7. The temporal resolution of this method is important because it allows for incorporation of these reagents at specific stages in development. Furthermore, because expression from electroporated vectors occurs within 6 hours 7, this method is more timely than transgenic approaches. While the spatial resolution can be extremely precise when targeting a single cell 2, 6, it is often preferable to incorporate reagents into a specific cell population within a tissue or structure. When targeting multiple cells, in vivo electroporation is efficient for delivery to a specific region of the embryo; however, particularly within the developing nervous system, it is difficult to target specific cell types solely through spatially discrete electroporation. Alternatively, enhancer trap transgenic lines offer excellent cell type-specific expression of transgenes 8. Here we describe an approach that combines transgenic Gal4-based enhancer trap lines 8 with spatially discrete in vivo electroporation 7, 9 to specifically target developing neurons of the zebrafish olfactory bulb. The Et(zic4:Gal4TA4,UAS:mCherry)hzm5 (formerly GA80_9) enhancer trap line previously described 8, displays targeted transgenic expression of mCherry mediated by a zebrafish optimized Gal4 (KalTA4) transcriptional activator in multiple regions of the developing brain including hindbrain, cerebellum, forebrain, and the olfactory bulb. To target GFP expression specifically to the olfactory bulb, a plasmid with the coding sequence of GFP under control of multiple Gal4 binding sites (UAS) was electroporated into the anterior end of the forebrain at 24-28 hours post-fertilization (hpf). Although this method incorporates plasmid DNA into multiple regions of the forebrain, GFP expression is only induced in cells transgenically expressing the KalTA4 transcription factor. Thus, by using the GA080_9 transgenic line, this approach led to GFP expression exclusively in the developing olfactory bulb. GFP expressing cells targeted through this approach showed typical axonal projections, as previously described for mitral cells of the olfactory bulb 10. This method could also be used for targeted delivery of other reagents including short-hairpin RNA interference expression plasmids, which would provide a method for spatially and temporally discrete loss-of-function analysis.

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

The temporal and spatial resolution of genetic manipulations determines the spectrum of biological phenomena that they can perturb. Here we use temporally and spatially discrete in vivo electroporation, combined with transgenic lines of zebrafish, to induce expression of a GFP transgene specifically in neurons of the developing olfactory bulb.

組み合わせることを使用してターゲットと嗅球の神経細胞インビボでのエレクトロポレーションとGAL4ベースエンハンサートラップゼブラフィッシュの行

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific ...

Imaging Odor-Evoked Activities in the Mouse Olfactory Bulb using Optical Reflectance and Autofluorescence Signals

In the brain, sensory stimulation activates distributed populations of neurons among functional modules which participate to the coding of the stimulus. Functional optical imaging techniques are advantageous to visualize the activation of these modules in sensory cortices with high spatial resolution. In this context, endogenous optical signals that arise from molecular mechanisms linked to neuroenergetics are valuable sources of contrast to record spatial maps of sensory stimuli over wide fields in the rodent brain.
Here, we present two techniques based on changes of endogenous optical properties of the brain tissue during activation. First the intrinsic optical signals (IOS) are produced by a local alteration in red light reflectance due to: (i) absorption by changes in blood oxygenation level and blood volume (ii) photon scattering. The use of in vivo IOS to record spatial maps started in the mid 1980's with the observation of optical maps of whisker barrels in the rat and the orientation columns in the cat visual cortex1. IOS imaging of the surface of the rodent main olfactory bulb (OB) in response to odorants was later demonstrated by Larry Katz's group2. The second approach relies on flavoprotein autofluorescence signals (FAS) due to changes in the redox state of these mitochondrial metabolic intermediates. More precisely, the technique is based on the green fluorescence due to oxidized state of flavoproteins when the tissue is excited with blue light. Although such signals were probably among the first fluorescent molecules recorded for the study of brain activity by the pioneer studies of Britton Chances and colleagues3, it was not until recently that they have been used for mapping of brain activation in vivo. FAS imaging was first applied to the somatosensory cortex in rodents in response to hindpaw stimulation by Katsuei Shibuki's group4.
The olfactory system is of central importance for the survival of the vast majority of living species because it allows efficient detection and identification of chemical substances in the environment (food, predators). The OB is the first relay of olfactory information processing in the brain. It receives afferent projections from the olfactory primary sensory neurons that detect volatile odorant molecules. Each sensory neuron expresses only one type of odorant receptor and neurons carrying the same type of receptor send their nerve processes to the same well-defined microregions of &tilde;100&mu;m3 constituted of discrete neuropil, the olfactory glomerulus (Fig. 1). In the last decade, IOS imaging has fostered the functional exploration of the OB5, 6, 7 which has become one of the most studied sensory structures. The mapping of OB activity with FAS imaging has not been performed yet.
Here, we show the successive steps of an efficient protocol for IOS and FAS imaging to map odor-evoked activities in the mouse OB.

This article presents the protocols of intrinsic optical signals and flavoproteins autofluorescence signals imaging to map odor-evoked activities at the surface of the olfactory bulb in mice.

光反射率と自家蛍光信号を用いたマウス嗅球におけるイメージングの臭い誘発活動

In the brain, sensory stimulation activates distributed populations of neurons among functional modules which participate to the coding of the stimulus. ...

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within the same species 1,2. These intraspecies signals, the pheromones, as well as signals from some predators 3, activate the vomeronasal sensory neurons (VSNs) with high levels of specificity and sensitivity 4. At least three distinct families of G-protein coupled receptors, V1R, V2R and FPR 5-14, are expressed in VNO neurons to mediate the detection of the chemosensory cues. To understand how pheromone information is encoded by the VNO, it is critical to analyze the response profiles of individual VSNs to various stimuli and identify the specific receptors that mediate these responses.
The neuroepithelia of VNO are enclosed in a pair of vomer bones. The semi-blind tubular structure of VNO has one open end (the vomeronasal duct) connecting to the nasal cavity. VSNs extend their dendrites to the lumen part of the VNO, where the pheromone cues are in contact with the receptors expressed at the dendritic knobs. The cell bodies of the VSNs form pseudo-stratified layers with V1R and V2R expressed in the apical and basal layers respectively 6-8. Several techniques have been utilized to monitor responses of VSNs to sensory stimuli 4,12,15-19. Among these techniques, acute slice preparation offers several advantages. First, compared to dissociated VSNs 3,17, slice preparations maintain the neurons in their native morphology and the dendrites of the cells stay relatively intact. Second, the cell bodies of the VSNs are easily accessible in coronal slice of the VNO to allow electrophysiology studies and imaging experiments as compared to whole epithelium and whole-mount preparations 12,20. Third, this method can be combined with molecular cloning techniques to allow receptor identification.
Sensory stimulation elicits strong Ca2+ influx in VSNs that is indicative of receptor activation 4,21. We thus develop transgenic mice that express G-CaMP2 in the olfactory sensory neurons, including the VSNs 15,22. The sensitivity and the genetic nature of the probe greatly facilitate Ca2+ imaging experiments. This method has eliminated the dye loading process used in previous studies 4,21. We also employ a ligand delivery system that enables application of various stimuli to the VNO slices. The combination of the two techniques allows us to monitor multiple neurons simultaneously in response to large numbers of stimuli. Finally, we have established a semi-automated analysis pipeline to assist image processing.

The vomeronasal organ (VNO) detects intraspecies chemical signals that convey social and reproductive information. We have performed Ca2+ imaging experiments using transgenic mice expressing G-CaMP2 in VNO tissue. This approach allows us to analyze the complicated response patterns of the vomeronasal neurons to large numbers of pheromone stimuli.

遺伝的にコードされたカルシウムセンサーを発現する鋤鼻器のスライス標本のイメージング神経細胞応答

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for investigating the cell biology and development of central brain structures by allowing acute pharmacological interventions and live imaging of cellular processes. As an example of the technique, prior work from our lab1 has shown that a previously unrecognized subcellular compartment lies between the axonal and somatodendritic compartments of axons of the Drosophila central brain. The development of this compartment, referred to as the axon initial segment (AIS)2, was shown genetically to depend on the neuron-specific cyclin-dependent kinase, Cdk5. We show here that ex vivo treatment of wild-type Drosophila larval brains with the Cdk5-specific pharmacological inhibitors roscovitine and olomoucine3 causes acute changes in actin organization, and in localization of the cell-surface protein Fasciclin 2, that mimic the changes seen in mutants that lack Cdk5 activity genetically.
A second example of the ex vivo culture technique is provided for remodeling of the connections of embryonic mushroom body (MB) gamma neurons during metamorphosis from larva to adult. The mushroom body is the center of olfactory learning and memory in the fly4, and these gamma neurons prune their axonal and dendritic branches during pupal development and then re-extend branches at a later timepoint to establish the adult innervation pattern5. Pruning of these neurons of the MB has been shown to occur via local degeneration of neurite branches6, by a mechanism that is triggered by ecdysone, a steroid hormone, acting at the ecdysone receptor B17, and that is dependent on the activity of the ubiquitin-proteasome system6. Our method of ex vivo culturing can be used to interrogate further the mechanism of developmental remodeling. We found that in the ex vivo culture setting, gamma neurons of the MB recapitulated the process of developmental pruning with a time course similar to that in vivo. It was essential, however, to wait until 1.5 hours after puparium formation before explanting the tissue in order for the cells to commit irreversibly to metamorphosis; dissection of animals at the onset of pupariation led to little or no metamorphosis in culture. Thus, with appropriate modification, the ex vivo culture approach can be applied to study dynamic as well as steady state aspects of central brain biology.

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

This article describes a method by which one can mimic in vivo development of the Drosophila mushroom body in an ex vivo culture system.

全体の開発、 ショウジョウバエの脳のex vivoで培養

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

モデルとしての嗅覚系は、軸索の成長パターンと形態を研究する<em&gt;インビボ</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Observation of the Ciliary Movement of Choroid Plexus Epithelial Cells Ex Vivo

The choroid plexus is located in the ventricular wall of the brain, the main function of which is believed to be production of cerebrospinal fluid. Choroid plexus epithelial cells (CPECs) covering the surface of choroid plexus tissue harbor multiple unique cilia, but most of the functions of these cilia remain to be investigated. To uncover the function of CPEC cilia with particular reference to their motility, an ex vivo observation system was developed to monitor ciliary motility during embryonic, perinatal and postnatal periods. The choroid plexus was dissected out of the brain ventricle and observed under a video-enhanced contrast microscope equipped with differential interference contrast optics. Under this condition, a simple and quantitative method was developed to analyze the motile profiles of CPEC cilia for several hours ex vivo. Next, the morphological changes of cilia during development were observed by scanning electron microscopy to elucidate the relationship between the morphological maturity of cilia and motility. Interestingly, this method could delineate changes in the number and length of cilia, which peaked at postnatal day (P) 2, while the beating frequency reached a maximum at P10, followed by abrupt cessation at P14. These techniques will enable elucidation of the functions of cilia in various tissues. While related techniques have been published in a previous report1, the current study focuses on detailed techniques to observe the motility and morphology of CPEC cilia ex vivo.

Observation of the Ciliary Movement of Choroid Plexus Epithelial Cells Ex Vivo

In this study, a detailed light microscopic technique was optimized for real-time observation and analysis of the motion of CPEC cilia ex vivo together with an electron microscopic method for ultrastructural analysis.

脈絡叢上皮細胞の繊毛運動の観測<em&gt;エクスビボ</em

The choroid plexus is located in the ventricular wall of the brain, the main function of which is believed to be production of cerebrospinal fluid. ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. However, there is piling evidence that olfaction is not solely limited to chemical sensitivity, but also includes temperature sensitivity. Premetamorphic Xenopus laevis are translucent animals, with protruding nasal cavities deprived of the cribriform plate separating the nose and the olfactory bulb. These characteristics make them well suited for studying olfaction, and particularly thermosensitivity. The present article describes the complete procedure for measuring temperature responses in the olfactory bulb of X. laevis larvae. Firstly, the electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) is performed with spectrally distinct dyes loaded into the nasal cavities in order to stain their axon terminals in the bulbar neuropil. The differential staining between left and right receptor neurons serves to identify the &#947;-glomerulus as the only structure innervated by contralateral presynaptic afferents. Secondly, the electroporation is combined with focal bolus loading in the olfactory bulb in order to stain mitral cells and their dendrites. The 3D brain volume is then scanned under line-illumination microscopy for the acquisition of fast calcium imaging data while small temperature drops are induced at the olfactory epithelium. Lastly, the post-acquisition analysis allows the morphological reconstruction of the thermosensitive network comprising the &#947;-glomerulus and its innervating mitral cells, based on specific temperature-induced Ca2+ traces. Using chemical odorants as stimuli in addition to temperature jumps enables the comparison between thermosensitive and chemosensitive networks in the olfactory bulb.

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Here we describe a protocol for measuring and analyzing temperature responses in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Olfactory receptor neurons and mitral cells are differentially stained, after which calcium changes are recorded, reflecting a sensitivity of some neural networks in the bulb to temperature drops induced at the nose.

の嗅球にカルシウム変化をモニタリングを通じて温度によって誘発される神経活動を記録<em&gt;アフリカツメガエル</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...