, F30 DC011673 (GFH: NINDS, NIH) und der UT Southwestern Startfonds (JPM): Diese Forschung wurde von R00 DC011780 (NINDS, NIH JPM) unterstützt.

Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Protokollen von der UT Southwestern Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss genehmigt wurde, und wurden so gewählt, dass Stress, Beschwerden und Schmerzen, die durch den Versuchstieren erlebt zu minimieren. 1. Dissection Kammer Eine benutzerdefinierte Dissektion Kammer und kleinen, dünnen Plastikplanke für die besten Ergebnisse (Abbildung 1) erforderlich. Bauen oder zu erhalten, wie eine Kammer im Vorfeld versucht, dieses Protokoll. 2. Dissection Lösungen <ol><li> Herstellung von 1 l Standard künstlichen Cerebrospinalflüssigkeit (aCSF) zur Verwendung in Stufen von 3,22 bis 5,4. Hinzufügen NaCl 125 mM, KCl 2,5 mM, CaCl 2 2 mM, 1 mM MgCl 2, 25 mM NaHCO 3, NaH 2 PO 4 1,25 mM, myo-Inosit 3 mM, 2 mM Natriumpyruvat, Natriumascorbat, 0,4 mM und Glucose 25 mM bis 1 l pyrogenfreiem Wasser. </li><li> Bereiten Sie die Anfangs Dissektion aCSF (200 ml) fürverwenden in Schritten von 3,3 bis 3,22. Nehmen Sie 200 ml Standard-aCSF und erhöhen die MgCl 2-Konzentration von 9 mM durch Zugabe von 0,366 g MgCl2-Hexahydrat. </li><li> Vorbereitung Standardringerlösung um Stimuli an das VNO durch die Kanüle zur Verwendung in Schritten von 4,11 bis 5,4, enthaltend NaCl 115 mM, KCl 5 mM, CaCl 2, 2 mM MgCl 2, 2 mM, 25 mM NaHCO 3, 10 mM HEPES tragen, Glucose 10 mM. </li><li> Blasen die 0,8 l Standard aCSF und 0,5 L Ringer mit 95% O 2, 5% CO 2-Gas in einem 37 ° C Wasserbad für mindestens 15 min bis zum Gebrauch. </li><li> Blase die 200 ml anfänglichen Präparation aCSF mit 95% O 2, 5% CO 2-Gas auf Eis für 15-20 Minuten, bis es 4 ° C erreicht </li></ol> 3. Primäre Dissection <ol><li> Bereiten Sie die Dissektion Bereich. Platzieren Sie drei 35 mm Petrischalen, sauerstoff aCSF, Enthauptung Schere gebogen Dissektionsscheren, gerade Dissektionsscheren, Adson Pinzette, ein # 11 Kopfhautel Klinge und Griff und eine Rasierklinge auf Eis. </li><li> Nach oxygenierten aCSF wurde auf 4 ° C abgekühlt, tief anästhesiert das Tier in einer Trocknungskammer unter Verwendung von 2-5 ml Isothesia (99,9% Isofluran). Führen Schwanz und Fuß Prise Tests, um sicherzustellen, das Tier tief anästhesiert. </li><li> Sobald tiefe Narkose bestätigt wird, das Tier zu enthaupten und sofort legen den Kopf in einer Petrischale mit Kalt Dissektion aCSF gefüllt. HINWEIS: Tauchen Sie die Gewebe in gekühlten Dissektion aCSF es kühl zu halten während des gesamten Verfahrens, wenn nicht in Gebrauch. </li><li> Entfernen Sie die untere Seiten (ventralen Rachen, Unterkiefer und Zunge) mit einer gebogenen Schere. </li><li> Mit Pinzette Adson deglove (Schale) die oberflächliche Haut-und Muskelansätze aus dem Schädel. Schälen Sie die Kopfhaut vor kaudal bis rostral die einzige Website der Befestigung ist über die vorderen Zähne. Schneiden Sie das Gewebe an der Befestigungspunkt mit einer gebogenen Schere. Die Augen entfernen, indem Sie sie mit einer Pinzette und ziehen Sie sie aus der Vorbereitung. NOhr das Ende der degloving Verfahren vermeiden übermäßige Kraft auf den empfindlichen Nasenknorpel mit den Adson Pinzette kostenlos Muskelansätze aus den oberen Kieferknochen. HINWEIS: Nehmen Sie die Kopfhaut vor der Schwanz Aspekt der Schädel mit geraden Schere. </li><li> Mit den geraden Schere, schneiden Sie die Mittellinie des Schädels von kaudal bis rostral die Scherenspitzen sind ein paar mm in die Stirnbein (kurz vor der rhinal Sinus). </li><li> Entfernen Sie den Scheitel-und Stirn Knochen des Schädels mit Adson Pinzette. HINWEIS: Stücke des Stirnbeins oft bleiben an der nasalen Knochen kaudal der rhinal Sinus angebracht. Entfernen Sie diese Stücke mit Sorgfalt, nicht die Riechkolben zu kontaktieren. </li><li> Verwenden Sie das Skalpell, um einen koronalen Schnitt durch den Frontallappen 2 mm kaudal der Nasennebenhöhlen machen und entfernen Sie dann das Gehirn kaudal der Schnitt. Sicherstellen, dass die Spitze des Skalpells Kontakte die knöcherne Kontur des ventralen Schädel, um die hinteren Gewebe vollständig zu durchtrennen. HINWEIS: Dies ermöglichtEntfernung der Mehrheit des Gehirns, ohne die mechanische Belastung auf den seitlichen Flächen oder olfaktorischen Bulbus olfactorius. </li><li> Entfernen Sie die freiliegenden Schwanz Aspekte des ventralen Schädel mit geraden Schere. Lassen Sie die Nasennebenhöhlen und übrigen Nervengewebe. </li><li> Entfernen Sie den Jochbogen-und Gesichtsmuskulatur auf dem anatomischen rechten Seite des Schädels mit geraden Schere </li><li> Drehen Sie die Schnauze über (Bauchseite nach oben), um das Dach des Mundes aus. </li><li> Cut und entfernen Sie den Gaumen unmittelbar kaudal der Schneidezähne. Tun Sie dies, indem Sie die Spitze des Skalpellklinge unter dem Gaumen parallel zum Dach der Mund und bewegen Sie die Klinge in Richtung der Schneidezähne dann. </li><li> Fassen Sie die befreit (rostral) Rand der Gaumen mit Adson Pinzette und kaudal durch Ziehen entfernen. </li><li> Auf der anatomischen linken Seite des Schädels, verwenden Sie das Skalpell, um die Gaumen Foramen kaudal sich ausgehend von den kleinen Foramen in der Nähe der Backenzähne. Sie erreichen dies, indem Sie die Spitze des Skalpells blade in die Leere in der Nähe der Backenzähne und Drehen des Handgelenks. HINWEIS: Seien Sie besonders vorsichtig, nur die Spitze der Klinge - ein tiefer Schnitt kann das Septum-Gewebe schädigen. </li><li> Mit der Spitze des Skalpellklinge, von den Pfalz Foramen durch die Schneidezähne geschnitten, beginnend rostral des anatomisch links Vomeronasalorgans. Verwenden Sie mehrere Scoring-Schnitte. Sie das Septum-Gewebe und Nerven vomeronasal nicht beschädigen, indem Sie die Klinge zu tief. </li><li> Schalten Sie das Gewebe, so dass die Rücken Schädel nach oben orientieren und dann das Rasiermesser Klinge vertikal (parallel zur Mittellinie) am kaudalen Rand der Zubereitung. </li><li> Am ventralen Rand des Gewebes, berühren die Schneidkante der Rasierklinge sich unmittelbar links von der Mittellinie. Schütteln Sie die Klinge und bewegen sich entlang der linken Gaumen Foramen (Schnittbereich in Schritt 3.14 eingeführt). </li><li> Am dorsalen Rand des Gewebes, legen die Schneidkante des Rasierers unmittelbar links von der Mittellinie (weniger als 1 mm). </li><li> Keepingdie Klinge parallel zur Mittellinie, rocken die Rasierklinge langsam mit Druck in Richtung der vorderen des Gewebes. Beachten Widerstand an der Lamina cribrosa. Stoppen Sie sofort nach durch diesen Widerstand zu brechen. HINWEIS: An dieser Stelle wird die rechte Hemisphäre von der linken Hemisphäre gelöst. Die einzige verbleibende Verbindung zwischen den Halbkugeln entlang der dorsalen Schnauze anterior der Siebplatte. </li><li> Trennen Sie die Hemisphären durch Greifen sie in der Nähe der Schwanz Seiten mit behandschuhten Fingern und sanft seitlich und vorne Drehen auf. HINWEIS: Dieser Schritt ist eine Quelle der experimentellen Variabilität, vor allem in Mäusen mit abweichenden oder spröde Schnauzen (zB ältere Mäuse). Auch beim Versuch, die Halbkugeln voneinander weg zu drehen, wenn starke Widerstand stößt punkten die dorsale Schnauze (anterior der Lamina cribrosa), um das Bindegewebe schwächen. Während Dabei nehmen extreme Vorsicht nicht das Skalpell tief einfügen, die die Septum-ti schädigen könnenUSGABE vomeronasal und Nerven. </li><li> Eine kleine Menge (50-100 ul) Gewebekleber auf dem Brett zu platzieren und vorsichtig den seitlichen Rand der rechten Hemisphäre auf den Leim mit den Adson Pinzette. Überschüssige Feuchtigkeit von der lateralen Seite des Präparats mit einem Papiertuch, um eine vorzeitige Polymerisation Klebstoff und lose Haftung auf dem Brett zu verhindern. HINWEIS: Geben Sie einige Tropfen des Kühl Dissektion aCSF auf die Probe, um den Kleber Polymerisation zu beschleunigen, nachdem Gewebe wird auf den Leim gelegt. Dies stellt sicher, dass das Gewebe bleibt fest mit dem Brett statt. </li><li> Setzen Sie einen kleinen Betrag (3-5 mm Durchmesser, 2 mm tief) von Vakuumfett in der Mitte der Sekundär Dissektion Kammer und legen Sie die Seite der Planke gegenüber dem Gewebe fest gegen das Fett. Die Dissektion Kammer sofort füllen mit gekühltem Dissektion aCSF, Transfer zum feinen Sezierung Bereich und beginnen Perfusion mit sauerstoff Standard aCSF. Richten Sie das Brett, so dass der Riechkolben ist direkt in dieStrom von frisch mit Sauerstoff angereicherte Standard aCSF. </li></ol> 4. Sekundär Dissection <ol><li> Entfernen Sie alle sichtbaren kontralateralen (links) Riechkolben oder Rindengewebe von der Vorbereitung mit feinen Pinzette. Pinch zusammen die feinen Pinzette (Bildung einer halb stumpfen Punkt), und dann legen Sie sie an der Rücken-und Schwanzteil der Gewebe in der Nähe der Mittellinie. Sanft laufen die Zange eingeklemmt entlang der Mittellinie, Peeling das Gewebe von der rechten Hemisphäre langsam in anterioren Bewegung. Entfernen Sie alle kontralateralen Gewebe, einschließlich der kontralateralen Riechkolben Gewebe. Seien Sie äußerst vorsichtig, um nicht durch das Gewebe, die Schäden an der AOB oder vomeronasal Nerven verursachen können stechen. </li><li> Beachten Sie die weißen Dura Mater entlang der dorsalen / medialen Fläche des Bulbus olfactorius. Reißen Sie diese Dura mater entlang der dorsalen / kaudalen Rand des Riechkolbens durch Greifen an der weißesten Teil der Dura mit zwei Paaren von feinen Pinzette und ziehen sie weg von diesem Punkt. Die Dura dichteingewickelt um den Riechkolben, und kann leicht selbst durch das Gewebe schneiden, während es entfernt wird. Schäden an der medialen Fläche des Bulbus olfactorius und den AOB selbst zu vermeiden. HINWEIS: Wenn die Dura wider reißen leicht an dieser Stelle vorstellen einen kleinen Schnitt mit feinen Federspitze Dissektion Schere, um die Trennung zu erleichtern. </li><li> Langsam und vorsichtig abziehen der frontalen Kortex mit einer feinen Pinzette, ohne die zugrunde liegende Riechkolben. Beobachten Sie eine Sammlung von Blutgefäßen als semi-transparent netto sofort kaudal der AOB erscheinen. Entfernen Sie dieses Netz mit einer feinen Pinzette, um die Elektrode Eindringen in elektrophysiologischen Experimenten erleichtern. Fassen Sie das Netz mit Zange, wie es von der AOB trennt während frontalen Kortex Rückzug und entfernen Sie sie von kaudal und medial ziehen, wobei darauf geachtet das AOB nicht zu berühren. Sobald der frontale Kortex hat sich von den Riechkolben getrennt worden ist, entfernen Sie es durch Schneiden mit einer Pinzette ventralen und hinter der AOB. HINWEIS: Nehmen Sie abtreme Pflege mit Nettoabbau, denn wenn es zu grob ist getan die glomeruläre Schicht beschädigt werden kann. </li><li> In der exponierten kontralateralen Nasenhöhle, entfernen Sie alle verbleibenden kontralateralen Septum-Gewebe (fadenscheinigen gelblich Blatt mit Blutgefäßen) mit den feinen Pinzette. Fassen Sie das Gewebe an der Schwanz / Rückenbereich (in der Nähe des Septum-Knochen) und ziehen / heben das Gewebe auf der vorderen Seite dann. HINWEIS: Die kontralateralen Septum-Gewebe kann während der Hemisektion (Schritt 3.20) versehentlich entfernt werden. In einem solchen Fall beobachten, eine weiße, avaskuläre Septumknorpels und leicht transparent, gefäß Septum-Knochen. Wenn dies der Fall ist, kann der Schritt 4.4 übersprungen werden. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die kontralateralen VNO, indem Sie einen einzigen Punkt der feinen Pinzette zwischen der Scheidewandknorpel und der VNO &quot;Flügel&quot; (ein dünnes Stück Knochengewebe, die entlang der dorsalen Rand der beiden VNOs läuft. <ol><li> Nach der Loslösung von der Flügelknorpel, bewegen Sie die Spitze der Zange ventralin das kontralaterale VNO in der Nähe der Mittellinie. Wiederholen diesen Schritt an mehreren Stellen entlang des rostralen / kaudale Achse des kontralateralen VNO um sie zu lösen, so dass es durch Ergreifen mit einer Zange und Abheben entfernt werden. </li></ol></li><li> Bereiten Sie die Septumknorpels durch einen Schnitt in der Bauch / kaudalen Rand (wo es verengt sich zu einem weißen avaskulären Bandlauf entlang der ventralen Rand des Septum-Knochen) mit einer feinen Pinzette entfernen. </li><li> Entfernen Sie die Septumknorpels durch Kneifen zusammen die feinen Pinzette, um eine halb stumpfen Punkt zu machen. Identifizieren Sie den Schnitt im Schritt 4.6 aus, legen Sie die Zange eingeklemmt hinter (seitlich) zu diesem Schnitt, und dann langsam heben Sie die Knorpel aus dem Septum-Gewebe und rostral fortfahren. HINWEIS: die zugrunde liegende Scheidewandgewebe stören Sie nicht. Da der Knorpel angehoben wird, beobachten die zugrunde liegende Blatt Septum-Gewebe Stretch durch lose Verwachsungen an den Knorpel. Eine periodische, sanft und stabilen Bewegung der feinen Pinzette eingeklemmt auf dieser Website von losen eindhesion stark erleichtern erfolgreiche Trennung der beiden Strukturen. </li><li> Verwenden Sie ein Paar Nr. 3 Pinzette mit gebogener Spitze, um das Septum-Knochen zu entfernen. Ansatz der septalen Knochen in einem Winkel nahezu parallel zu der Ebene des septalen Knochen. Legen Sie die gebogenen Zinken zwischen dem Septum-Gewebe-und Knochen Septum. Fassen Sie die Knochen mit der Zange und sanft bewegen die Knochen hin und her, bis es Risse in der Nähe der Lamina cribrosa. HINWEIS: In einigen Fällen wird das Septum-Knochen in der Nähe der wider Siebbeinplatte brechen. In diesem Fall verwenden Sie feinen Pinzette vorsichtig erzielt das Septum Knochen entlang der dorsalen / ventralen Achse nur anterior der Lamina cribrosa, dann wiederholen Sie Schritt 4.8. </li><li> Entfernen Sie die weiße Knorpel nur rostral des VNO durch Kneifen mit einer feinen Pinzette am Eingang und rostral ziehen mit einem anderen feinen Pinzette. </li><li> Befestigen Sie die Polyimid-Kanüle zu einer schnellen Perfusionsvorrichtung und starten Sie den Fluss der Ringer-Lösung (0,1 bis 0,3 ml / min) durch die Polyimid-Kanüle.HINWEIS: Messen Sie mit einer Durchflussrate in-line, kleines Volumen-Durchflussmesser. Einsatz von Computer-gesteuerten pneumatischen Schaltgerät Stimulus reduziert Strömungsgeschwindigkeit ändert während der Stimulation. Vergleichen neuronale Reaktionen auf Reize mit Reaktionen auf eine Schein Reiz (Ringer-Lösung zu kontrollieren) testen, um sicherzustellen Antworten sind spezifische Reiz. </li><li> Richten Sie die Kanüle parallel zur VNO Eingang. Wenn die Kanüle zufriedenstellend parallel zur VNO Eingang, zusehen, wie der Ausgangsdruck bewirkt, dass das VNO auf &quot;aufblasen&quot;, was zu einer Evakuierung des Blutgefäßes. Die Kanüle sofort in die VNO einzufügen, halten die Winkel der Kanüle konstant, so daß sie parallel zu der VNO Öffnung verbleibt. HINWEIS: Es kann hilfreich sein, um die Kanüle mit einer feinen Pinzette gegen den Kunststoff Planke halten und ein anderes Paar feine Pinzette Winkel das Ende der Kanüle leicht nach oben. Wenn man versehentlich legt die Kanüle hinter dem VNO, kann der Abfluss auch die VNO Blutgefäßes führenzu evakuieren, um den Eindruck einer ordnungsgemäßen Kanülierung wurde durchgeführt, führt. Richtigen Stelle kann durch Einbau eines Farbstoffes in der Ringerlösung bestätigt werden. Wenn die Kanüle richtig platziert ist, sollte der Farbstoff nur über den Ausgang VNO Eingang. Zusätzlich kann eine geeignete Anordnung sichergestellt wird, dass die Kanüle durch die halbtransparente medialen VNO leicht sichtbar zu bestätigen. </li><li> Bewegen Sie den Kunststoff-Brett langsam, bis der AOB ist in der direkten Fluss von der Standard-aCSF, man aufpassen, nicht die Kanüle aus dem VNO entfernen. Die Präparation ist abgeschlossen und Beurteilung der physiologischen Funktion kann sofort begonnen werden. Schritt 5 wird kurz beschrieben, ein Konzept für eine solche Bewertung. </li></ol> 5. Auswertung <ol><li> Dringen die Oberfläche des AOB mit 2-4 M &amp;OHgr; Borsilikatglas-Mikroelektrode an eine extrazelluläre Verstärker und Oszilloskop angeschlossen. </li><li> Langsam voran die Mikroelektrode in eine Tiefe von 100-200 um aus derOberfläche mit einer Geschwindigkeit von 50 um / min. HINWEIS: Bei dieser Gewebetiefe, wird man gelegentlich spontane Aktionspotential Wellenformen durch scharfe, kurze (~ 2.1 ms) Ausschläge in der Mikroelektrodenspannung beispielhaft zu begegnen. </li><li> Bei der Begegnung ein Aktionspotential Wellenform, Stopp Förderung der Mikroelektrode. </li><li> Beobachten und / oder aufzeichnen das Aktionspotential Rate, während die Konjunktur Delivery-Lösung von Steuer Ringer-zu einem bekannten Aktivator der VSN-Aktivität (zB Ringer-Lösung, die 50 mM KCl). Wenn die Zerlegung erfolgreich war, kann ein Stimulus-abhängige Veränderung in Aktion Potenzialrate oder lokale Feldpotential beobachtet werden. HINWEIS: Nicht alle Neuronen AOB wird jedem Reiz mit einer Erhöhung der Brenngeschwindigkeit (einschließlich Ringer-Lösung, enthaltend 50 mM KCl) reagieren. Ein Reiz abhängige Abnahme der Feuerrate zeigt auch funktionelle Konnektivität und eine erfolgreiche Dissektion. In dem Fall, dass zwei oder mehr Neuronen auf, daßreagieren nicht auf VNO Stimulation, oder wenn keine Aktionspotenziale nach mehreren Elektrodenbrüche beobachtet werden, deutet dies auf einen erfolglosen Dissektion. Wenn dies der Fall ist, kann eine neue Sektion in Schritt 3 eingeleitet werden. </li></ol>

<ol>
	<li>Bruce, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+exteroceptive+block+to+pregnancy+in+the+mouse.">An exteroceptive block to pregnancy in the mouse.</a> Nature. 184, 105 (1959).</li><li>Bellringer, J. F., Pratt, H. P., Keverne, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+vomeronasal+organ+and+prolactin+in+pheromonal+induction+of+delayed+implantation+in+mice.">Involvement of the vomeronasal organ and prolactin in pheromonal induction of delayed implantation in mice.</a> J Reprod Fertil. 59, 223-228 (1980).</li><li>Bean, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+agonistic+behavior+by+the+dual+olfactory+system+in+male+mice.">Modulation of agonistic behavior by the dual olfactory system in male mice.</a> Physiol Behav. 29, 433-437 (1982).</li><li>Meredith, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vomeronasal+organ+removal+before+sexual+experience+impairs+male+hamster+mating+behavior.">Vomeronasal organ removal before sexual experience impairs male hamster mating behavior.</a> Physiol Behav. 36, 737-743 (1986).</li><li>Hendrickson, R. C., Krauthamer, S., Essenberg, J. M., Holy, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+shapes+sex+selectivity+in+the+mouse+accessory+olfactory+bulb.">Inhibition shapes sex selectivity in the mouse accessory olfactory bulb.</a> J Neurosci. 28, 12523-12534 (2008).</li><li>Ben-Shaul, Y., Katz, L. C., Mooney, R., Dulac, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+vomeronasal+stimulation+reveals+sensory+encoding+of+conspecific+and+allospecific+cues+by+the+mouse+accessory+olfactory+bulb.">In vivo vomeronasal stimulation reveals sensory encoding of conspecific and allospecific cues by the mouse accessory olfactory bulb.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, (2010).</li><li>Tolokh, I. I., Fu, X., Holy, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliable+sex+and+strain+discrimination+in+the+mouse+vomeronasal+organ+and+accessory+olfactory+bulb.">Reliable sex and strain discrimination in the mouse vomeronasal organ and accessory olfactory bulb.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 13903-13913 (2013).</li><li>Luo, M., Fee, M. S., Katz, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encoding+pheromonal+signals+in+the+accessory+olfactory+bulb+of+behaving+mice.">Encoding pheromonal signals in the accessory olfactory bulb of behaving mice.</a> Science. 299, 1196-1201 (2003).</li><li>Binns, K. E., Brennan, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+electrophysiological+activity+in+the+accessory+olfactory+bulb+and+medial+amygdala+associated+with+mate+recognition+in+mice.">Changes in electrophysiological activity in the accessory olfactory bulb and medial amygdala associated with mate recognition in mice.</a> Eur J Neurosci. 21, 2529-2537 (2005).</li><li>Leszkowicz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noradrenaline-induced+enhancement+of+oscillatory+local+field+potentials+in+the+mouse+accessory+olfactory+bulb+does+not+depend+on+disinhibition+of+mitral+cells.">Noradrenaline-induced enhancement of oscillatory local field potentials in the mouse accessory olfactory bulb does not depend on disinhibition of mitral cells.</a> Eur J Neurosci. 35, 1433-1445 (2012).</li><li>Ames, A., Gurian, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+Recordings+from+Isolated+Mammalian+Retina+Mounted+as+a+Membrane.">Electrical Recordings from Isolated Mammalian Retina Mounted as a Membrane.</a> Arch Ophthalmol. 70, 837-841 (1963).</li><li>Flock, A. F., Strelioff, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+hair+cells+in+isolated+coils+from+the+guinea+pig+cochlea.">Studies on hair cells in isolated coils from the guinea pig cochlea.</a> Hear Res. 15, 11-18 (1984).</li><li>Woodbury, C. J., Ritter, A. M., Koerber, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+anatomy+of+individual+rapidly+adapting+low-threshold+mechanoreceptors+innervating+the+'hairy'+skin+of+newborn+mice:+early+maturation+of+hair+follicle+afferents.">Central anatomy of individual rapidly adapting low-threshold mechanoreceptors innervating the 'hairy' skin of newborn mice: early maturation of hair follicle afferents.</a> J Comp Neurol. 436, 304-323 (2001).</li><li>Llinas, R., Muhlethaler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+electrophysiological+study+of+the+in+vitro,+perfused+brain+stem-cerebellum+of+adult+guinea-pig.">An electrophysiological study of the in vitro, perfused brain stem-cerebellum of adult guinea-pig.</a> The Journal of physiology. 404, 215-240 (1988).</li><li>Riviere, S., Challet, L., Fluegge, D., Spehr, M., Rodriguez, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formyl+peptide+receptor-like+proteins+are+a+novel+family+of+vomeronasal+chemosensors.">Formyl peptide receptor-like proteins are a novel family of vomeronasal chemosensors.</a> Nature. 459, 574-577 (2009).</li><li>Meeks, J. P., Holy, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ex+vivo+preparation+of+the+intact+mouse+vomeronasal+organ+and+accessory+olfactory+bulb.">An ex vivo preparation of the intact mouse vomeronasal organ and accessory olfactory bulb.</a> J Neurosci Methods. 177, 440-447 (2009).</li><li>Leinders-Zufall, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+pheromone+detection+by+mammalian+vomeronasal+neurons.">Ultrasensitive pheromone detection by mammalian vomeronasal neurons.</a> Nature. 405, 792-796 (2000).</li><li>Kato, H. K., Chu, M. W., Isaacson, J. S., Komiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+sensory+representations+in+the+olfactory+bulb:+modulation+by+wakefulness+and+experience.">Dynamic sensory representations in the olfactory bulb: modulation by wakefulness and experience.</a> 76, 962-975 (2012).</li><li>Meeks, J. P., Arnson, H. A., Holy, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Representation+and+transformation+of+sensory+information+in+the+mouse+accessory+olfactory+system.">Representation and transformation of sensory information in the mouse accessory olfactory system.</a> Nature. 13, 723-730 (2010).</li></ol>

Die Autoren haben keine wesentlichen Interessenkonflikte offen zu legen.

Die in diesem Protokoll beschrieben VNO-AOB ex vivo-Herstellung ist eine nützliche Alternative zu den in vivo 5-7 und akute Live Scheibe 17 Experimente AOB Funktion anästhesiert. Im Gegensatz zu akuten AOB Scheibe Experimente, die auch Schaltungselemente für elektrophysiologische und optische Aufnahmen belichten, behält diese Vorbereitung alle sensorischen Afferenzen und intra-AOB-Verbindungen. Sie können aber auch von betäubten gesagt werden, in-vivo-Ansätzen, die Anwesenheit von Anästhetika notwendigerweise verändert neuronalen Funktion, nämlich exzitatorischen / inhibitorische Gleichgewicht, die von entscheidender Bedeutung für die Informationsverarbeitung in dieser und anderen Geruchsschaltungen 18 ist. Da die Herstellung vermeidet die Verwendung von Anästhetika, und weil die AOB Oberfläche vollständig zu dem Superfusat ausgesetzt sind, ist es offen für pharmakologische Untersuchungen in lokalen neuronalen Verarbeitung. Es gibt natürlich einige Einschränkungen dieser Zubereitung. Es gibt evidence allmähliche Degeneration der tiefsten AOB Schichten, nämlich die tiefen Abschnitte der inneren Zellschicht, die viele inhibitorische Körnerzellen 16 untergebracht ist. Zusätzlich sind Kreiseleingänge während der Präparation durchtrennt, durch aktive Teilnahme an AOB Funktion eliminieren. Kanülierung des VNO umgeht die normale Aktion des vomeronasal Pumpe und spült den im VNO Lumen vorliegenden endogenen Flüssigkeiten. Kritische Schritte für den Erfolg mit dieser Methode sind die zarten Hemisektion (Schritt 3.20) und VNO Kanülierung (Schritt 4.11). Man kann erwarten, umfangreiche Praxis benötigen, um funktionell verbundenen Ex-vivo-Präparate zuverlässig produzieren. Die hier eingesetzte Sekundär Dissektion Kammer kann verwendet werden, um funktionelle Konnektivität bewerten mit Single-Elektroden-Aufnahmen während der Stimulation des VNO mit Quellen Maus Pheromone (wie verdünnter Urin) werden. 13,15 Änderungen der Sekundärkammer Dissektion kann bE hergestellt, dass die Zubereitung auf Winkel für andere Zwecke, wie beispielsweise Multiphotonen-Imaging geeignet gedreht zu ermöglichen. Die vielen technischen Hürden, die das Studium der lebenden AOB seit langem stellte eine Barriere für unser Verständnis von sozialer Geruch und Pheromon sensorischen Verarbeitung. Durch sezieren entfernt die frühesten neuronalen Komponenten dieses sensorische Bahn in diesem Dissektion Protokoll ist in der Lage, ein experimenteller Zugang zu diesen schwer zu Studienkreise zu gewinnen. Wir haben diese Vorbereitung für detaillierte Untersuchungen zu vomeronasal sensorischen Verarbeitung 19 und sensorische Mapping (Hammen et al., Unveröffentlicht) eingesetzt. Diese Technik wird für zukünftige Studien in sensorischen Verarbeitung in der AOB, insbesondere die optischen Zugang zum Gewebe (z. B. Multiphotonen-Imaging und Optogenetik) erfordern, nützlich sein. Die Vorteile dieses Ansatzes ergänzen die in-vivo-Ansätze und Verbesserung unserer Toolkit für die Untersuchung der neuronalen Mechanismen der vomeronasal-vermittelte soSozial-und Paarungsverhalten.

Sinnesverarbeitung im Gehirn von Säugetieren umfasst in der Regel mehrere wechselseitig verbundenen neuronalen Schaltkreisen, die jeweils bestimmte Merkmale extrahiert aus sensorischen Input. In sensorischen Bahnen, ist eine frühzeitige Informationsverarbeitung entscheidend für normale Wahrnehmung und Verhalten. In der akzessorischen olfaktorischen System (AOS) ist der akzessorischen olfaktorischen Bulbus (AOB) die Haupt neuronalen Schaltkreis die Verknüpfung der sensorischen Peripherie zum nachgeschalteten Strukturen, die Hormonhaushalt 1,2, Aggression 3, 4 und Erregung zu diktieren. Als solches wird die Informationsverarbeitung innerhalb dieser Schaltung stark auf Veränderungen in Tierverhalten verbunden. Das Zubehör Riechkolben ist bei Mäusen und Ratten an der dorsalen / Schwanz / hinteren Teil des Hauptriechkolben (MOB), die unter dem dichten befindet, vaskularisiert rhinal Höhle. Die AOB erhält afferente Innervation von Axone der peripheren sensorischen Neuronen vomeronasal (VSN), die in der Vomeronasalorgan (VNO) wohnen, eine kl blind endenden Schlauch im vorderen Schnauze knapp über den weichen Gaumen. Diese Axone durchqueren die empfindlichen Bogen von septalen Gewebe am medialen Rand der Nasenwege. Mehrere Studien haben AOB neuronalen Antworten auf Quellen von AOS Gerüche (wie Maus Urin) in vivo untersucht mit narkotisierten Mäusen 5-7 oder frei-Erkundung 8 Tiere. In-vivo-Studien beteiligt sind (a) Luftröhrenschnitt zu tiefe Narkose zu gewährleisten und zu verhindern das Ansaugen von Flüssigkeit Reize 5-7, (b) Stimulation des sympathischen Halsganglion 6 oder direkte Kanülierung der Vomeronasalorgans 5,7 in den nichtflüchtigen Gerüche einführen Die heroische betäubt und (c) Kraniotomien mit oder ohne Stirnlappen Ablationen zur Elektrode Aufstieg in die AOB 6 ermöglichen. Awake / verhalten Studien 8-10 beteiligten chirurgischen Implantation eines Microdrive. In der Summe sind diese experimentellen Paradigmen mächtig, aber extrem schwierig und erfordern oft Anästhesie. (ex vivo) mit einigem Erfolg 11-15 erhalten. Da die Verbindungen zwischen dem VNO und AOB bleiben ipsilateral und weil die Mittellinie Septum-Gewebe um oxidierte Superfusat in einem einzigen Halbkugel ausgesetzt werden, haben wir versucht, so ein Single-Hemisphäre ex vivo Ansatz zu entwickeln, um diese Strukturen zu isolieren und gleichzeitig ihre funktionelle Konnektivität. Wir haben vor kurzem bei der Erreichung dieses Ziels 16 gelungen. Dies hält sowohl die Herstellung VNO und AOB lebendig und funktionell für mindestens 4 verbunden - 6 Stunden, da sowohl die Axone (entlang der Mittellinie weiche Gewebe Septum) und AOB sind relativ flach &lt;600 um Funktionen, die zugänglich oxygenierten künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (strömt sind aCSF). Das VNO-AOB ex vivo Vorbereitung ermöglicht Einführung der kontrollierten Reize in der VNO über eine dünne Kanüle, unddirekten visuellen Zugang zum kleinen AOB für gezielte Platzierung der Elektroden und / oder Live-Fluoreszenzmikroskopie. Dieses Verfahren ist vorteilhaft, wenn man wünscht, diese Schaltungen in Abwesenheit von Anästhetika zu studieren. Da dieser Ansatz trennt Kreisel Verbindungen, ist es nicht gut, Ermittlungen zu Schleuder Modulation der AOB-Funktion geeignet. Das VNO-AOB ex vivo Vorbereitung ist schwer zu lernen, aber einmal erreicht, erzeugt eine zuverlässige Plattform zur Schaltung Organisation, Informationsverarbeitung und neuronaler Plastizität in dieser leistungsfähigen Sinnes Schaltung zu untersuchen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Straight Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14002-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors-Straight</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors-Curved</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14061-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11006-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#3 Scalpel Handle</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#11 Scalpel Blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>3120030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Carbon Steel Razor Blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Petri Dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Chamber</td>
			<td>Custom&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>See Fig. 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delrin plastic plank 0.6 cm x 1.5 cm x 0.1 cm</td>
			<td>Custom&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning Silicon Vacuum grease</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>146355D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#5 Forceps, Student</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#5 Forceps, Biologie Tip</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#5 Forceps, Student</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.0045&#34; Polyimide Tubing</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>823400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/16&#34; Male Luer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-45505-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/16&#34; Tubing</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-171-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two ton epoxy</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>5E157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ValveBank Pressurized Perfusion Kit</td>
			<td>AutoMate Scientific</td>
			<td>09-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ValveLink digital/manual controller</td>
			<td>AutoMate Scientific</td>
			<td>01-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>myo-inositol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-ascorbate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo preparations of the intact vomeronasal organ and accessory olfactory bulb

Die Maus akzessorischen olfaktorischen System (AOS) ist eine spezialisierte Sinnespfad zur Erfassung nichtflüchtigen sozialen Gerüche, Pheromone und Kairomonen. Die erste neuronalen Schaltkreis in der AOS-Weg, die so genannte akzessorischen olfaktorischen Bulbus (AOB), spielt eine wichtige Rolle bei der Gründung Sex-typische Verhaltensweisen wie Aggression und territorialen Paarung. Diese kleine (&lt;1 mm 3)-Schaltung besitzt die Fähigkeit, einzigartige Verhaltenszustände, wie z. B. Geschlecht, Belastung, Stress und von chemosensorischen Signale in den Sekreten und Ausscheidungen von Artgenossen zu unterscheiden. Während die kompakte Organisation dieses Systems präsentiert einzigartige Möglichkeiten für die Aufnahme von großen Teilen der Schaltung gleichzeitig bleibt Untersuchung der sensorischen Verarbeitung in der AOB eine Herausforderung, vor allem wegen seiner nachteiligen Lage experimentell im Gehirn. Hier zeigen wir einen mehrstufigen Präparation, die die intakte AOB in einem einzigen Halbkugel der vorderen Schädel Maus entfernt, so dass eine VerbindungIonen sowohl der peripheren sensorischen Neuronen vomeronasal (VSN) und der lokalen neuronalen intakt. Das Verfahren macht die AOB Oberfläche einer Sichtprüfung zu leiten, erleichtert elektrophysiologischen und optischen Aufnahmen von AOB Schaltungselemente in Abwesenheit von Anästhetika. Nach dem Einlegen einer dünnen Kanüle in das Vomeronasalorgan (VNO), die die VSNs beherbergt, kann man direkt aussetzen, die den Umfang der sozialen Gerüchen und Pheromonen bei der Aufnahme Downstream-Aktivität in der AOB. Dieses Verfahren ermöglicht kontrollierte Untersuchungen über AOS Informationsverarbeitung, die Licht auf die Mechanismen Verknüpfung Pheromon Exposition zu Veränderungen im Verhalten zu vergießen kann.

Der Weg zum Erfolg mit diesem Präparat nimmt umfangreiche Praxis, und hat mehrere Schritte bei der es nicht kann. Man sollte erwarten, dass viele Versuche, vor den Erfolg benötigen. Der Brauch Dissektion Kammer ist für den erfolgreichen Abschluss dieses Protokolls erforderlich und sollte vor Beginn der späteren Stadien der Präparation erhalten werden. Die Kammerkonstruktion in Fig. 1 dargestellt ist, für diesen Zweck ausreichend, und kann relativ kostengünstig Kunststoff mit minimaler Bearbeitungs Anforderungen gestellt werden. Wenn man die Fähigkeit, eine solche Kammer zu produzieren fehlt, können lokale oder Online-Bearbeitungsunternehmen konsultiert werden und kann die Kammer für eine Gebühr zu konstruieren. Eine große Quelle der Variabilität über Vorbereitungen ist die Dichte und Brüchigkeit der Knochen von Schädel und Schnauze der Versuchstiere. Während der hemisection Schritte (Schritte von 3,14 bis 3,20), ist das Ziel, beide vomeronasal Organe zusammen mit der ipsilateralen Septum-Gewebe zu isolieren undipsilateral akzessorischen olfaktorischen Bulbus. Es ist jedoch nicht ungewöhnlich, dass die Scheidewandgewebe zu bleiben, um der kontralateralen Hemisphäre befestigt ist, insbesondere in der Nähe Befestigungspunkte an der dorsalen Knochen der Schnauze. Fig. 2 zeigt ein Beispiel für eine wirksame und unwirksame Halbquerschnitt. Andere häufige Dissektion Fehler entstehen während der Fein Dissektion, bei der die Axone der Nerven vomeronasalen in der Septum-Gewebe in der Nähe der Vomeronasalorgan (3A und 3B) oder in der Nähe der AOB (3C und 3D) beschädigt werden. Diese und ähnliche Veranstaltungen werden in unvollständige Konnektivität zwischen VSN und der AOB zur Folge, wodurch die Vorbereitungen unbrauchbar. Das letzte Hindernis für den Erfolg der Vorbereitung ist der VNO Kanülierung Schritt (Schritt 4.11). Die richtige Platzierung der Kanüle wird in VNO Druckbeaufschlagung der VNO Lumen führen, was sofortige Ausweisung von<html> Restblut aus der vomeronasal Pumpe. Die Kanüle sollte deutlich sichtbar unter der relativ transparent vomeronasal Epithel und das Aussehen der Kanüle ist entlang seiner Länge innerhalb des VNO einheitlich sein. Nach erfolgreichem Abschluss des Verfahrens kann eine funktionelle Konnektivität zu überprüfen mit Hilfe eines physiologischen Test wie Einheit elektrophysiologischen Ableitungen der neuronalen Aktivität in Reaktion auf VNO Stimulation mit einer bekannten Quelle von VSN Geruchsstoffe (Abbildung 4). <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/51813/51813fig1highres.jpg" /> Abbildung 1. A) Technische Zeichnungen der benutzerdefinierten Dissektion Kammer in Schritten von 3,22 bis 5,4 eingesetzt. HINWEIS: Kleine Löcher gebohrt werden, um Lösung und Vergasung und Auslässe wie gewünscht B) Beispiel Fotografie Dissektion Kammer in diesem Protokoll aufzunehmen..<html> m/files/ftp_upload/51813/51813fig1highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/51813/51813fig2highres.jpg" /> Abbildung 2. A, B) Repräsentative Bilder von erfolgreichen (A) und erfolglose (B) Zubereitungen nach der Hemisektion Stufe (Schritt 3.20). Die VNO, Septum-Gewebe und Riechkolben (OBs) müssen alle von der ipsilateralen Hemisphäre (in diesem Fall das Recht (unten) Halbkugel gehalten werden. Wenn Nasenmuscheln auf der ipsilateralen Hemisphäre sichtbar sind, hat sich die Dissektion fehlgeschlagen. Striche sind 1 mm auseinander. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51813/51813fig2highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> d/51813/51813fig3highres.jpg &quot;width =&quot; 600 &quot;/&gt; 3. A, B) Repräsentative Bilder der intakten und geschädigten Gewebe zwischen dem Septum VNO und AOB. In B, machten die Präparierzange unbeabsichtigten Kontakt mit dem Gewebe, Beschädigung der VN Axon Wege. C, D) Intakte und beschädigte AOB. In D, Entfernung der Dura rund um die ipsilateralen OB führte Trennen der Nerven vomeronasal in der Nähe der AOB, was zu einer sichtbaren Blob von Gewebe in der Nähe der medialen AOB. Maßstabsbalken sind 1 mm lang. <img alt="Fig. 4" src="/files/ftp_upload/51813/51813fig4highres.jpg" /> Abbildung 4. A) Beispiel Raster Grundstück von Aktionspotentialen von einem AOB Neuron (extrazellulären Einheit Aufnahme) in eine erfolgreiche Vorbereitung aufgezeichnet. Spuren in schwarz zeigen keine Veränderung in Feuerrate, wenn die Steuer Ringer-Lösung wurde der VNO für 5 sec (b grau geliefertox). Spuren in rot zeigen die Reaktion der gleichen Neuron zu VNO Stimulation mit weiblichen BALB / c Maus Urin verdünnt 100-fach in Ringer-Kochsalzlösung. B) Peri-Stimulus-Zeit-Histogramm der gleichen Reaktionen in A. Fehlerbalken zeigen die Standardfehler des Mittelwerts.

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb at JoVE.com

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Die Maus akzessorischen olfaktorischen Bulbus (AOB) ist schwierig gewesen, im Rahmen der sensorischen Kodierung zu studieren. Hier zeigen wir eine Dissektion, die eine Ex-vivo-Vorbereitung, in der AOB Neuronen funktionell bleiben, um ihre angeschlossenen Peripherieeingänge, die Erleichterung der Forschung in der Informationsverarbeitung von Maus Pheromone und Kairomonen produziert.

Ex vivo Zubereitungen der Intact Vomeronasalorgan und akzessorischen olfaktorischen Bulbus

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

ex-vivo-preparations-intact-vomeronasal-organ-accessory-olfactory

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

10.7K Aufrufe.  UT Southwestern Medical Center.  Die Maus akzessorischen olfaktorischen Bulbus (AOB) ist schwierig gewesen, im Rahmen der sensorischen Kodierung zu studieren. Hier zeigen wir eine Dissektion, die eine Ex-vivo-Vorbereitung, in der AOB Neuronen funktionell bleiben, um ihre angeschlossenen Peripherieeingänge, die Erleichterung der Forschung in der Informationsverarbeitung von Maus Pheromone und Kairomonen produziert. 

Serie: Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Multielectrode Array Recordings of the Vomeronasal Epithelium

Understanding neural circuits requires methods to record from many neurons simultaneously. For in vitro studies, one currently available technology is planar multielectrode array (MEA) recording. Here we document the use of MEAs to study the mouse vomeronasal organ (VNO), which plays an essential role in the detection of pheromones and social cues via a diverse population of sensory neurons expressing hundreds of types of receptors. Combining MEA recording with a robotic liquid handler to deliver chemical stimuli, the sensory responses of a large and diverse population of neurons can be recorded. The preparation allows us to remove the intact neuroepithelium of the VNO from the mouse and stimulate with a battery of chemicals or potential ligands while monitoring the electrical activity of the neurons for several hours. Therefore, this technique serves as a useful method for assessing ligand activity as well as exploring the properties of receptor neurons. We present the techniques needed to prepare the vomeronasal epithelium, MEA recording, and chemical stimulation.

Multielectrode array (MEA) recordings provide a method for studying the electrical activity of large populations of neurons. Here, we present the details of a MEA preparation to record from the mouse vomeronasal epithelium while simultaneously stimulating the tissue.

Multielektroden Array Recordings der Vomeronasal Epithel

Understanding neural circuits requires methods to record from many neurons simultaneously. For in vitro studies, one currently available technology is ...

Forschung

Neurowissenschaften

Imaging Odor-Evoked Activities in the Mouse Olfactory Bulb using Optical Reflectance and Autofluorescence Signals

In the brain, sensory stimulation activates distributed populations of neurons among functional modules which participate to the coding of the stimulus. Functional optical imaging techniques are advantageous to visualize the activation of these modules in sensory cortices with high spatial resolution. In this context, endogenous optical signals that arise from molecular mechanisms linked to neuroenergetics are valuable sources of contrast to record spatial maps of sensory stimuli over wide fields in the rodent brain.
Here, we present two techniques based on changes of endogenous optical properties of the brain tissue during activation. First the intrinsic optical signals (IOS) are produced by a local alteration in red light reflectance due to: (i) absorption by changes in blood oxygenation level and blood volume (ii) photon scattering. The use of in vivo IOS to record spatial maps started in the mid 1980's with the observation of optical maps of whisker barrels in the rat and the orientation columns in the cat visual cortex1. IOS imaging of the surface of the rodent main olfactory bulb (OB) in response to odorants was later demonstrated by Larry Katz's group2. The second approach relies on flavoprotein autofluorescence signals (FAS) due to changes in the redox state of these mitochondrial metabolic intermediates. More precisely, the technique is based on the green fluorescence due to oxidized state of flavoproteins when the tissue is excited with blue light. Although such signals were probably among the first fluorescent molecules recorded for the study of brain activity by the pioneer studies of Britton Chances and colleagues3, it was not until recently that they have been used for mapping of brain activation in vivo. FAS imaging was first applied to the somatosensory cortex in rodents in response to hindpaw stimulation by Katsuei Shibuki's group4.
The olfactory system is of central importance for the survival of the vast majority of living species because it allows efficient detection and identification of chemical substances in the environment (food, predators). The OB is the first relay of olfactory information processing in the brain. It receives afferent projections from the olfactory primary sensory neurons that detect volatile odorant molecules. Each sensory neuron expresses only one type of odorant receptor and neurons carrying the same type of receptor send their nerve processes to the same well-defined microregions of &tilde;100&mu;m3 constituted of discrete neuropil, the olfactory glomerulus (Fig. 1). In the last decade, IOS imaging has fostered the functional exploration of the OB5, 6, 7 which has become one of the most studied sensory structures. The mapping of OB activity with FAS imaging has not been performed yet.
Here, we show the successive steps of an efficient protocol for IOS and FAS imaging to map odor-evoked activities in the mouse OB.

This article presents the protocols of intrinsic optical signals and flavoproteins autofluorescence signals imaging to map odor-evoked activities at the surface of the olfactory bulb in mice.

Imaging Gerüche hervorgerufene Aktivitäten in der Maus Riechhirn mit Optical Reflexions-und Autofluoreszenzsignale

In the brain, sensory stimulation activates distributed populations of neurons among functional modules which participate to the coding of the stimulus. ...

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within the same species 1,2. These intraspecies signals, the pheromones, as well as signals from some predators 3, activate the vomeronasal sensory neurons (VSNs) with high levels of specificity and sensitivity 4. At least three distinct families of G-protein coupled receptors, V1R, V2R and FPR 5-14, are expressed in VNO neurons to mediate the detection of the chemosensory cues. To understand how pheromone information is encoded by the VNO, it is critical to analyze the response profiles of individual VSNs to various stimuli and identify the specific receptors that mediate these responses.
The neuroepithelia of VNO are enclosed in a pair of vomer bones. The semi-blind tubular structure of VNO has one open end (the vomeronasal duct) connecting to the nasal cavity. VSNs extend their dendrites to the lumen part of the VNO, where the pheromone cues are in contact with the receptors expressed at the dendritic knobs. The cell bodies of the VSNs form pseudo-stratified layers with V1R and V2R expressed in the apical and basal layers respectively 6-8. Several techniques have been utilized to monitor responses of VSNs to sensory stimuli 4,12,15-19. Among these techniques, acute slice preparation offers several advantages. First, compared to dissociated VSNs 3,17, slice preparations maintain the neurons in their native morphology and the dendrites of the cells stay relatively intact. Second, the cell bodies of the VSNs are easily accessible in coronal slice of the VNO to allow electrophysiology studies and imaging experiments as compared to whole epithelium and whole-mount preparations 12,20. Third, this method can be combined with molecular cloning techniques to allow receptor identification.
Sensory stimulation elicits strong Ca2+ influx in VSNs that is indicative of receptor activation 4,21. We thus develop transgenic mice that express G-CaMP2 in the olfactory sensory neurons, including the VSNs 15,22. The sensitivity and the genetic nature of the probe greatly facilitate Ca2+ imaging experiments. This method has eliminated the dye loading process used in previous studies 4,21. We also employ a ligand delivery system that enables application of various stimuli to the VNO slices. The combination of the two techniques allows us to monitor multiple neurons simultaneously in response to large numbers of stimuli. Finally, we have established a semi-automated analysis pipeline to assist image processing.

The vomeronasal organ (VNO) detects intraspecies chemical signals that convey social and reproductive information. We have performed Ca2+ imaging experiments using transgenic mice expressing G-CaMP2 in VNO tissue. This approach allows us to analyze the complicated response patterns of the vomeronasal neurons to large numbers of pheromone stimuli.

Imaging neuronalen Antworten in Scheiben Zubereitungen von Vomeronasalorgan Ausdruck eines genetisch kodierte Kalzium-Sensor

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for investigating the cell biology and development of central brain structures by allowing acute pharmacological interventions and live imaging of cellular processes. As an example of the technique, prior work from our lab1 has shown that a previously unrecognized subcellular compartment lies between the axonal and somatodendritic compartments of axons of the Drosophila central brain. The development of this compartment, referred to as the axon initial segment (AIS)2, was shown genetically to depend on the neuron-specific cyclin-dependent kinase, Cdk5. We show here that ex vivo treatment of wild-type Drosophila larval brains with the Cdk5-specific pharmacological inhibitors roscovitine and olomoucine3 causes acute changes in actin organization, and in localization of the cell-surface protein Fasciclin 2, that mimic the changes seen in mutants that lack Cdk5 activity genetically.
A second example of the ex vivo culture technique is provided for remodeling of the connections of embryonic mushroom body (MB) gamma neurons during metamorphosis from larva to adult. The mushroom body is the center of olfactory learning and memory in the fly4, and these gamma neurons prune their axonal and dendritic branches during pupal development and then re-extend branches at a later timepoint to establish the adult innervation pattern5. Pruning of these neurons of the MB has been shown to occur via local degeneration of neurite branches6, by a mechanism that is triggered by ecdysone, a steroid hormone, acting at the ecdysone receptor B17, and that is dependent on the activity of the ubiquitin-proteasome system6. Our method of ex vivo culturing can be used to interrogate further the mechanism of developmental remodeling. We found that in the ex vivo culture setting, gamma neurons of the MB recapitulated the process of developmental pruning with a time course similar to that in vivo. It was essential, however, to wait until 1.5 hours after puparium formation before explanting the tissue in order for the cells to commit irreversibly to metamorphosis; dissection of animals at the onset of pupariation led to little or no metamorphosis in culture. Thus, with appropriate modification, the ex vivo culture approach can be applied to study dynamic as well as steady state aspects of central brain biology.

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

This article describes a method by which one can mimic in vivo development of the Drosophila mushroom body in an ex vivo culture system.

Ex vivo Kultivierung von Whole, Entwickeln von Drosophila Brains

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

Das olfaktorische System als Modell zur Axonal Wachstumsmuster und Morphologie Studieren<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Observation of the Ciliary Movement of Choroid Plexus Epithelial Cells Ex Vivo

The choroid plexus is located in the ventricular wall of the brain, the main function of which is believed to be production of cerebrospinal fluid. Choroid plexus epithelial cells (CPECs) covering the surface of choroid plexus tissue harbor multiple unique cilia, but most of the functions of these cilia remain to be investigated. To uncover the function of CPEC cilia with particular reference to their motility, an ex vivo observation system was developed to monitor ciliary motility during embryonic, perinatal and postnatal periods. The choroid plexus was dissected out of the brain ventricle and observed under a video-enhanced contrast microscope equipped with differential interference contrast optics. Under this condition, a simple and quantitative method was developed to analyze the motile profiles of CPEC cilia for several hours ex vivo. Next, the morphological changes of cilia during development were observed by scanning electron microscopy to elucidate the relationship between the morphological maturity of cilia and motility. Interestingly, this method could delineate changes in the number and length of cilia, which peaked at postnatal day (P) 2, while the beating frequency reached a maximum at P10, followed by abrupt cessation at P14. These techniques will enable elucidation of the functions of cilia in various tissues. While related techniques have been published in a previous report1, the current study focuses on detailed techniques to observe the motility and morphology of CPEC cilia ex vivo.

Observation of the Ciliary Movement of Choroid Plexus Epithelial Cells Ex Vivo

In this study, a detailed light microscopic technique was optimized for real-time observation and analysis of the motion of CPEC cilia ex vivo together with an electron microscopic method for ultrastructural analysis.

Beobachtung der Flimmerbewegung von Plexus Epithelzellen<em&gt; Ex Vivo</em

The choroid plexus is located in the ventricular wall of the brain, the main function of which is believed to be production of cerebrospinal fluid. ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. However, there is piling evidence that olfaction is not solely limited to chemical sensitivity, but also includes temperature sensitivity. Premetamorphic Xenopus laevis are translucent animals, with protruding nasal cavities deprived of the cribriform plate separating the nose and the olfactory bulb. These characteristics make them well suited for studying olfaction, and particularly thermosensitivity. The present article describes the complete procedure for measuring temperature responses in the olfactory bulb of X. laevis larvae. Firstly, the electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) is performed with spectrally distinct dyes loaded into the nasal cavities in order to stain their axon terminals in the bulbar neuropil. The differential staining between left and right receptor neurons serves to identify the &#947;-glomerulus as the only structure innervated by contralateral presynaptic afferents. Secondly, the electroporation is combined with focal bolus loading in the olfactory bulb in order to stain mitral cells and their dendrites. The 3D brain volume is then scanned under line-illumination microscopy for the acquisition of fast calcium imaging data while small temperature drops are induced at the olfactory epithelium. Lastly, the post-acquisition analysis allows the morphological reconstruction of the thermosensitive network comprising the &#947;-glomerulus and its innervating mitral cells, based on specific temperature-induced Ca2+ traces. Using chemical odorants as stimuli in addition to temperature jumps enables the comparison between thermosensitive and chemosensitive networks in the olfactory bulb.

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Here we describe a protocol for measuring and analyzing temperature responses in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Olfactory receptor neurons and mitral cells are differentially stained, after which calcium changes are recorded, reflecting a sensitivity of some neural networks in the bulb to temperature drops induced at the nose.

Aufzeichnung von Temperatur-induzierte neuronale Aktivität durch Calcium Überwachen von Änderungen in der Riechkolben von<em&gt; Xenopus laevis</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory neurons (VSNs) express a specific type of G protein-coupled receptor (GPCR) from at least three different chemoreceptor gene families allowing sensitive and specific detection of chemosensory cues. These families comprise the V1r and V2r gene families as well as the formyl peptide receptor (FPR)-related sequence (Fpr-rs) family of putative chemoreceptor genes. In order to understand the physiology of vomeronasal receptor-ligand interactions and downstream signaling, it is essential to identify the biophysical properties inherent to each specific class of VSNs.
The physiological approach described here allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons using a transgenic mouse line (Fpr-rs3-i-Venus). The use of this protocol, however, is not restricted to this specific line and thus can easily be extended to other genetically modified lines or wild type animals.

Here, we describe a physiological approach that allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons in acute coronal tissue slices of the mouse vomeronasal organ using whole-cell patch-clamp recordings.

In eingehenden Physiologische Analyse definierter Zellpopulationen bei der akuten Gewebeschnitten der Maus Vomeronasalorgans

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

Quadruple Immunostaining of the Olfactory Bulb for Visualization of Olfactory Sensory Axon Molecular Identity Codes

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory Sensory Neuron (OSN) is a bipolar cell with a single dendrite and a single unbranched axon. An OSN expresses only one Olfactory Receptor (OR) gene, OSNs expressing a given type of OR converge their axons to a few sets of invariant glomeruli in the Olfactory Bulb (OB). A remarkable feature of OSN projection is that the expressed ORs play instructive roles in axonal projection. ORs regulate the expression of multiple axon-sorting molecules and generate the combinatorial molecular code of axon-sorting molecules at the OSN axon termini. Thus, to understand the molecular mechanisms of OR-specific axon guidance mechanisms, it is vital to characterize their expression profiles at the OSN axon termini within the same glomerulus. The aim of this article was to introduce methods for collecting as many glomeruli as possible on a single OB section and for performing immunostaining using multiple antibodies. This would allow the comparison and analysis of the expression patterns of axon-sorting molecules without staining variation between OB sections.

Olfactory sensory neurons express a wide variety of axon-sorting molecules to establish proper neural circuitry. This protocol describes an immunohistochemical staining method to visualize combinatorial expressions of axon-sorting molecules at the axon termini of olfactory sensory neurons.

Quadruple Immunfärbung der olfaktorischen Glühbirne zur Visualisierung von olfaktorischen sensorischen Axon Molecular Identity Codes

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory ...

In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and magnetic resonance imaging (MRI) have enabled in vivo quantification of CSF flow but they are limited by reduced imaging volumes and low spatial resolution, respectively. Recent work has found that CSF enters the brain parenchyma through a network of perivascular spaces surrounding the pial and penetrating arteries of the rodent cortex. This perivascular entry of CSF is a primary driver of the glymphatic system, a pathway implicated in the clearance of toxic metabolic solutes (e.g., amyloid-&#946;). Here, we illustrate a new macroscopic imaging technique that allows real-time, mesoscopic imaging of fluorescent CSF tracers through the intact skull of live mice. This minimally-invasive method facilitates a multitude of experimental designs and enables single or repeated testing of CSF dynamics. Macroscopes have high spatial and temporal resolution and their large gantry and working distance allow for imaging while performing tasks on behavioral devices. This imaging approach has been validated using two-photon imaging and fluorescence measurements obtained from this technique strongly correlate with ex vivo fluorescence and quantification of radio-labeled tracers. In this protocol, we describe how transcranial macroscopic imaging can be used to evaluate glymphatic transport in live mice, offering an accessible alternative to more costly imaging modalities.

Transcranial optical imaging allows wide-field imaging of cerebrospinal fluid transport in the cortex of live mice through an intact skull.

In Vivo Imaging von Cerebrospinalfluid Transport durch den intakten Mausschädel mittels Fluoreszenz-Makroskopie

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and ...