, F30 DC011673 (GFH: NINDS, NIH) ve UT Güneybatı başlangıç ​​fonları (JPM): Bu araştırma R00 DC011780 (NINDS, NIH JPM) tarafından desteklenmiştir.

Bütün deneyler, UT Güneybatı Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmış protokollere uygun olarak gerçekleştirildi ve deney hayvanları yaşadığı stresi, rahatsızlık ve ağrı en aza indirmek üzere seçilmiştir. 1.. Diseksiyon Odası Özel bir diseksiyon odası ve küçük, ince plastik tahta iyi sonuçlar (Şekil 1) için gereklidir. Bu protokolü teşebbüs önceden bu bir bölme ya da inşa elde edilir. 2.. Diseksiyon Çözümleri <ol><li> 3,22-5,4 adımda kullanılmak için standart yapay beyin omurilik sıvısı (CSF) 1 L hazırlayın. NaCl 125 mM, KCl 2.5 mM, CaCl2 2 mM, MgCl2 1 mM, NaHCO 3 25 mM, NaH 2 PO 4 1.25 mM, miyo-inositol 3 mM, 2 mM sodyum piruvat, 0.4 mM sodyum askorbat ekleyin ve 25, glikoz mM pirojensiz su 1 L. </li><li> Için ilk diseksiyon aCSF (200 mi) Hazırlamaadımlarla 3,3-3,22 kullanabilirsiniz. Standart aCSF 200 ml alın ve MgCl2 heksahidrat 0.366 gr eklenerek 9 mM MgCI2 konsantrasyonu yükseltmek. </li><li> NaCl 115 mM, KCl 5 mM, CaCl2, 2 mM, MgCl2, 2 mM, NaHCO 3 25 mM, 10 mM HEPES ihtiva eden adım 4,11-5,4 kullanılmak için kanül yoluyla VNO uyarı yapmak için standart Ringer çözeltisi hazırlayın, 10 mM glukoz. </li><li> Balon, kullanıma kadar 15 dakika içinde en az 37 ° C su banyosu içinde% 95 O2,% 5 CO2 gazı ile standart aCSF ve Ringer 0.5 L 0.8 L. </li><li> Kabarcık% 95 O 2 ile ilk diseksiyon aCSF 200 ml, bu 4 ° C&#39;de 15-20 dakika süreyle buz üzerinde% 5 CO 2 gazı ulaşana kadar </li></ol> 3.. Birincil Diseksiyon <ol><li> Diseksiyon alanı hazırlayın. Üç adet 35 mm Petri kapları, koyun oksijenli aCSF, düz makas, Adson forseps, bir 11. derisi diseksiyon diseksiyon makas kavisli decapitation makas,el bıçak ve kolu ve buz üzerinde bir jilet. </li><li> Oksijenli aCSF 4 ° C&#39;ye soğuduktan sonra, derin 2-5 ml Isothesia (% 99.9 izofloran) kullanılarak bir kurutma odasında hayvan anestetize. Hayvan derinden anestezi sağlamak için kuyruk ve ayak tutam testleri gerçekleştirin. </li><li> Derin anestezi onaylandıktan sonra, hayvan başını kesmek ve hemen soğutulmuş diseksiyon aCSF ile dolu bir Petri tabağına yerleştirin baş. NOT: Kullanılmadığı zaman prosedür boyunca serin tutmak için soğuk diseksiyon aCSF içinde doku daldırın. </li><li> Bir kavisli makas ile alt yönü (ventral yutak, alt çene ve dil) sökün. </li><li> Adson forseps deglove (soyma) yüzeysel cilt ve kafatası kas ekleri kullanma. Peel rostral kaudal için gelen kafa derisi ekin sadece sitenin kadar ön dişlerin bitti. Bir kavisli makas kullanılarak bağlanma noktasındaki doku kesilir. Forseps ile tutarak gözleri çıkarın ve hazırlık onu uzağa çekin. Nkulak degloving prosedürün sonunda, üst çene kemikleri serbest kas ekleri Adson forseps kullanarak hassas burun kıkırdak üzerine aşırı kuvvet kaçının. NOT: düz makas ile kafatası kaudal kafa derisi ayırın. </li><li> Makas uçları (hemen önce burun sinüs) frontal kemik içine bir kaç mm kadar düz makas ile, rostral kaudal için gelen kafatasının orta hatta aşağı kesti. </li><li> Adson forseps kullanarak kafatasının parietal ve frontal kemiklerin çıkarın. NOT: frontal kemik parçaları sıklıkla burun sinüs kuyruk burun kemiklerinin bağlı kalacaktır. Koku ampuller temas etmemesine özen, bu parçaları çıkarın. </li><li> Sinüsler frontal lob 2 mm kuyruğu ile koronal kesim yapmak ve daha sonra kesim için beyin caudal kaldırmak için neşter kullanın. Tamamen arka doku koparmaya neşter kişiler ventral kafatası kemik kontur ucu sağlamak. NOT: Bu sağlaryanal koku yollarına veya koku ampuller üzerinde mekanik stres koymadan beynin çoğunluğunun çıkarılması. </li><li> Düz makas ile ventral kafatası maruz kaudal yönlerini çıkarın. Sinüsler ve kalan sinir dokusunu bırakın. </li><li> Düz makas kullanarak kafatasının anatomik sağ tarafında elmacık kemer ve yüz kasları kaldır </li><li> Ağız çatı açığa (ventral yüzü yukarı) dudağını ters çevirin. </li><li> Kesme ve azı dişleri damak hemen kaudal kaldırın. Ağız çatı damak paralel altında neşter bıçak ucu takarak bunu yapın ve sonra ön dişler doğru bıçak taşımak. </li><li> Adson forseps ile damak serbest (rostral) kenarından kavrayın ve kaudal çekerek çıkartın. </li><li> Kafatasının anatomik sol tarafta, azı dişleri yakın küçük foramenden başlayarak, caudally palatin foramen uzatmak için neşter bıçağı kullanın. Neşter bla ucu takarak bunu başarmakazı dişleri yakın boşluğa de ve bileği dönen. NOT: bıçağın ucu kullanın sadece aşırı dikkatli olun - derin bir kesik septal doku zarar verebilir. </li><li> Anatomik sol vomeronasal organ rostral başlayarak, kesici dişlerin üzerinden palatin foramen kesilen neşter bıçak ucu, kullanma. Birden puanlama kesim kullanın. Çok derin bıçak sokarak septal doku ve vomeronasal sinirlere zarar vermeyin. </li><li> Böylece dorsal kafatası yukarı bakacak doku açın ve daha sonra hazırlık kaudal kenarında dikey düz jilet (orta hatta paralel) yönlendirin. </li><li> Doku ventral kenarında, hemen orta hat solundaki tıraş bıçağının kesici kenarı dokunun. Yavaşça bıçak kaya ve sol palatin foramen (Adım 3.14 tanıtıldı bölgeyi kesilmiş) birlikte hareket. </li><li> Doku dorsal kenarında, hemen orta hat solundaki (1 mm den daha az) için tıraş makinesinin kesme kenarı yerleştirin. </li><li> Korumabıçak dokusunun öne doğru bir baskı ile yavaşça jilet kaya, orta hatta paraleldir. Kribriform plaka direnç edin. Bu direnci kırarak hemen sonra durdurun. NOT: Bu noktada, sağ hemisfer sol yarımkürede ayrılabilmektedir. Geriye kalan tek bağlantısı kribriform plakasına dorsal anterior burun boyunca hemisfer arasında olduğunu. </li><li> Eldivenli parmakları ile kuyruk tarafı yakınında onları tutup hafifçe yanal ve öne çevirerek yarıküreyi ayırın. Not: Bu adım özellikle sapmış ya da kırılgan snouts (örneğin, büyük fareler) ile farelerde deneysel değişkenliği kaynağıdır. Ayrıca, güçlü direnç bağ dokuları zayıflatmak için dorsal burun (cribriform plaka anterior) puan karşılaştı ise, birbirinden uzak yarımküresini döndürmek için çalışırken. Bunu yaparken, septal ti zarar verebilir ki, derin neşter eklemek için değil aşırı dikkat çekmekssue ve vomeronasal sinirler. </li><li> Tahta doku yapıştırıcı küçük bir miktar (50-100 ul) uygulayın ve nazikçe Adson forseps kullanarak tutkal üzerine sağ yarımkürenin yan kenarını yerleştirin. Tahta zamanından önce tutkal polimerizasyonu ve gevşek yapışmasını önlemek için bir kağıt havlu kullanarak hazırlık yan tarafındaki aşırı nem çıkarın. Not: doku yapıştırıcısı üzerine yerleştirilir sonra tutkal Polimerleşme işlemini hızlandırmak için, numune üzerinde soğutulmuş diseksiyon aCSF birkaç damla uygulayın. Bu, doku tahta sıkıca tutulan kalmasını sağlar. </li><li> İkincil diseksiyon bölmenin ortasında vakum yağ, az miktarda (3-5 mm çapında, derinlik 2 mm) koyun ve sıkıca yağ karşı doku ters tahta tarafına yerleştirin. Hemen ince diseksiyon alanına transfer ve oksijenli standart aCSF ile perfüzyon başlar, soğuk diseksiyon aCSF ile diseksiyon odasını doldurmak. Koku ampul doğrudan böylece tahta Orienttaze oksijenli standart aCSF akışı. </li></ol> 4. İkincil Diseksiyon <ol><li> Ince forseps kullanarak hazırlanmasından görünür bir taraftaki (sol) koku ampul veya kortikal doku çıkarın. (A yarı kör nokta oluşturan) ince forseps birlikte Kıstırma ve daha sonra orta hatta yakın dorsal ve doku kuyruk kısmına yerleştirin. Nazikçe öne hareketi yavaş yavaş sağ yarımkürede doku soyulması, orta hat boyunca sıkışmak forseps çalıştırın. Kontralateral koku soğanı dokusu da dahil olmak üzere, karşı doku tüm çıkarın. AOB veya vomeronasal sinirine zarar verebilir doku aracılığıyla bıçaklamak için değil aşırı özen gösterin. </li><li> Koku ampul / dorsal medial yüzeyi boyunca beyaz dura mater gözlemleyin. Ince forseps iki çift ile duranın bembeyaz kısmında tutarak koku ampul / dorsal kaudal kenarında bu dura mater gözyaşı ve uzak bu noktadan onları çekin. Dura sıkı birkoku ampuller sarılı ve kaldırılması edilirken kolayca kendisi dokusu ile dilim olabilir. Koku ampul ve AOB kendisinin orta yüzeyine zarar kaçının. NOT: dura bu noktada kolayca yırtarak direnirse, ayrılmasını kolaylaştırmak için ince yay ucu diseksiyon makas ile küçük bir kesim tanıtmak. </li><li> Yavaş ve dikkatli bir şekilde yatan koku ampuller zarar vermeden ince forseps ile frontal korteks soymak. AOB hemen kaudal bir yarı-saydam net olarak görülen kan damarlarının bir koleksiyon gözlemlemek. Elektrofizyolojik deneylerde elektrot penetrasyonunu kolaylaştırmak için ince forseps ile bu net çıkarın. Frontal korteks geri çekilmesi sırasında AOB ayıran olarak forseps ile net kavrayın ve AAM dokunmamaya dikkat ederek, kaudal ve medial çekerek çıkarın. Frontal korteks, koku soğanı ayrılmış sonra, AOB için ventral ve posterior forseps ile keserek çıkarın. NOT: ex alınçok kabaca yapılır ise net kaldırılması ile dikkat treme için glomerüler katman hasar olabilir. </li><li> Maruz karşı burun boşluğunda, ince forseps kullanarak kalan taraf septal doku (kan damarlarını içeren çürük sarımsı tabaka) çıkarın. (Septal kemiği yakınında) kaudal / dorsal bölgedeki dokuyu tutun ve sonra ön tarafına doğru dokusu asansör / çekin. NOT: taraftaki septal doku yanlışlıkla hemiseksiyona adım (Adım 3.20) sırasında kaldırılabilir. Böyle bir durumda, beyaz bir avasküler septal kıkırdak ve hafif şeffaf, vaskülarize septal kemik görüyoruz. Bu durumda, Adım 4.4 atlanabilir. </li><li> Dikkatle septal kıkırdak ve VNO &quot;kanat&quot; (her ikisi de VNOs dorsal kenarı boyunca uzanan kemik dokusunun ince bir parça arasındaki ince forseps tek bir noktadan çalıştırarak kontralateral VNO çıkarın. <ol><li> Kıkırdak kanat dekolmanı ardından, ventral olarak forseps ucu taşımakorta hatta yakın kontralateral VNO içine. Forseps ile açgözlü ve uzak kaldırarak kaldırılacak etkinleştirme, gevşetmek için kontralateral VNO rostral / kaudal ekseni boyunca çeşitli yerlerde bu adımı tekrarlayın. </li></ol></li><li> Ince forseps ile kuyruk / ventral kenarında bir kesim (bu septal kemiğin ventral kenarında beyaz bir avasküler şerit çalışan daraltır nerede) yaparak septal kıkırdak çıkarmak için hazırlayın. </li><li> Yarı kör noktaya yapmak için bir araya ince forseps sıkarak septal kıkırdak çıkarın. Adım 4.6 yapılan kesim belirlemek, bu kesim için (lateral) arkasında sıkışmak forseps yerleştirin ve sonra yavaş yavaş septal doku ve rostrally devam kıkırdak kaldırın. NOT: altta yatan septal doku bozabilir etmeyin. Kıkırdak kaldırdı olarak, nedeniyle kıkırdak gevşek yapışıklıklar septal doku streç yatan sayfasını gözlemlemek. Gevşek a bu sitede boyunca sıkışmak ince forseps bir, periyodik nazik ve kararlı hareketdhesion büyük ölçüde iki yapıların başarılı ayrılmasını kolaylaştırır. </li><li> Septal kemiği kaldırmak için bir bükülmüş ucu ile 3. forseps bir çift kullanın. Bir açıyla septal kemik Yaklaşım yaklaşık septal kemik düzlemine paraleldir. Septal doku ve septal kemik arasındaki kavisli tine yerleştirin. Forseps ile kemik kavrayın ve yavaşça cribriform plaka yakınında çatlaklar kadar geri ve ileri kemik taşıyın. NOT: Bazı durumlarda, septal kemik cribriform plaka yakın kırılma direnecektir. Bu durumda, hafifçe sadece Adım 4.8 tekrarlayın sonra, kribriform plaka anterior dorsal / ventral eksen boyunca septal kemik puan ince forseps kullanabilir. </li><li> Girişinde ince forseps bir çift kısma ve ince forseps başka bir çift ile rostrally çekerek sadece VNO rostral beyaz kıkırdak çıkarın. </li><li> Hızlı bir perfüzyon cihazına polimid kanül takın ve poliimid kanülden Ringer çözeltisi (0.1-0.3 ml / dak) ve akış başlar.NOT: Bir sıralı, küçük hacimli akış ölçer ile ölçün akış hızı. Bilgisayar kontrollü pnömatik uyarıcı anahtarlama cihazının kullanımı uyarılması sırasında akış hızı değişiklikleri azaltır. Yanıtları uyaran özel sağlamak için sahte bir uyarıcı (Ringer çözeltisini kontrol) yanıtları ile uyaranlara test sinir yanıtları karşılaştırın. </li><li> VNO girişinde kanül paralel yönlendirin. Kanül tatmin edici VNO girişine paralel olduğunda çıkış basıncı VNO neden olarak, kan damarının tahliye lider &quot;şişirmek,&quot; izlemek. Hemen bu VNO açıklığına paralel kalır, böylece kanül sabit açısını tutarak, VNO içine kanül yerleştirin. NOT: Bu plastik tahta karşı ince forseps bir çift kanül tutun ve hafifçe yukarı açıya kanül ucu ince forseps başka bir çifti kullanmak yararlı olabilir. Biri yanlışlıkla VNO arkasında kanül yerleştirir eğer, çıkış da VNO kan damarı neden olabilirtahliye, uygun bir kanülasyon yapıldı izlenime yol açar. Uygun yer Ringer çözeltisi içinde bir boya dahil edilmesi ile kontrol edilebilir. Kanül düzgün yerleştirilmiş olduğunda, boya sadece gerektiği VNO girişinde yoluyla çıkış. Ayrıca, bir kanül VNO yarı saydam medial üzerinden kolayca görülebilir sağlayarak uygun yerleştirme onaylamak olabilir. </li><li> AOB VNO gelen kanül çıkarmak için dikkatli olmak, standart aCSF doğrudan akış gelene kadar yavaş yavaş plastik tahta taşıyın. Diseksiyon tamamlandı ve fizyolojik fonksiyonunun değerlendirilmesi hemen başlaması olabilir. Adım 5 kısa bir süre böyle bir değerlendirme yapmak için bir yaklaşımı tarif eder. </li></ol> 5.. Değerlendirme <ol><li> Hücre dışı bir amplifikatör ve osiloskop bağlanmış bir 2-4 MQ borosilikat cam mikro elektrot ile AOB yüzeyini nüfuz. </li><li> Yavaşça 100-200 um&#39;lik bir derinliğe kadar mikroelektrot ilerlemek50 mm / dk &#39;lık bir hızda bir yüzey. NOT: Bu doku derinlikte, bir mikroelektrot gerilim keskin, kısa (~ 1-2 msn) deplasmanlar ile örneklenen arada spontan aksiyon potansiyeli dalga formlarını karşılaşacak. </li><li> Aksiyon potansiyeli dalga biçimi karşılaşmak üzerine, mikroelektrot ilerleyen durdurun. </li><li> Dikkat ve / veya VSN aktivitesi bilinen bir aktivatörü (örneğin, 50 mM KCI ihtiva eden Ringer çözeltisi) için kontrol Ringer arasındaki teşvik teslim solüsyonu değiştirirken aksiyon potansiyeli oranı kaydedin. Diseksiyon başarılı olursa, aksiyon potansiyeli oranı veya yerel alan potansiyel bir uyarıcı bağımlı değişimi görülebilir. Not: Tüm AOB nöronlar (50 mM KCI ihtiva eden Ringer çözeltisi de dahil olmak üzere) ateşleme hızındaki bir artış ile, her uyarana yanıt verir. Ateşleme hızında bir uyarıcı bağımlı azalma da fonksiyonel bağlantı ve başarılı bir diseksiyon gösterir. İki ya da daha fazla nöron karşılaşılan durumunda buVNO stimülasyon yanıt vermeyen, ya da herhangi bir aksiyon potansiyelleri çoklu elektrot sızmalar sonra gözlenir, bu başarısız bir diseksiyon göstermektedir. Bu durumda, yeni bir diseksiyon Kademe 3 de başlatılabilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Bruce, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+exteroceptive+block+to+pregnancy+in+the+mouse.">An exteroceptive block to pregnancy in the mouse.</a> Nature. 184, 105 (1959).</li><li>Bellringer, J. F., Pratt, H. P., Keverne, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+vomeronasal+organ+and+prolactin+in+pheromonal+induction+of+delayed+implantation+in+mice.">Involvement of the vomeronasal organ and prolactin in pheromonal induction of delayed implantation in mice.</a> J Reprod Fertil. 59, 223-228 (1980).</li><li>Bean, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+agonistic+behavior+by+the+dual+olfactory+system+in+male+mice.">Modulation of agonistic behavior by the dual olfactory system in male mice.</a> Physiol Behav. 29, 433-437 (1982).</li><li>Meredith, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vomeronasal+organ+removal+before+sexual+experience+impairs+male+hamster+mating+behavior.">Vomeronasal organ removal before sexual experience impairs male hamster mating behavior.</a> Physiol Behav. 36, 737-743 (1986).</li><li>Hendrickson, R. C., Krauthamer, S., Essenberg, J. M., Holy, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+shapes+sex+selectivity+in+the+mouse+accessory+olfactory+bulb.">Inhibition shapes sex selectivity in the mouse accessory olfactory bulb.</a> J Neurosci. 28, 12523-12534 (2008).</li><li>Ben-Shaul, Y., Katz, L. C., Mooney, R., Dulac, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+vomeronasal+stimulation+reveals+sensory+encoding+of+conspecific+and+allospecific+cues+by+the+mouse+accessory+olfactory+bulb.">In vivo vomeronasal stimulation reveals sensory encoding of conspecific and allospecific cues by the mouse accessory olfactory bulb.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, (2010).</li><li>Tolokh, I. I., Fu, X., Holy, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliable+sex+and+strain+discrimination+in+the+mouse+vomeronasal+organ+and+accessory+olfactory+bulb.">Reliable sex and strain discrimination in the mouse vomeronasal organ and accessory olfactory bulb.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 13903-13913 (2013).</li><li>Luo, M., Fee, M. S., Katz, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encoding+pheromonal+signals+in+the+accessory+olfactory+bulb+of+behaving+mice.">Encoding pheromonal signals in the accessory olfactory bulb of behaving mice.</a> Science. 299, 1196-1201 (2003).</li><li>Binns, K. E., Brennan, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+electrophysiological+activity+in+the+accessory+olfactory+bulb+and+medial+amygdala+associated+with+mate+recognition+in+mice.">Changes in electrophysiological activity in the accessory olfactory bulb and medial amygdala associated with mate recognition in mice.</a> Eur J Neurosci. 21, 2529-2537 (2005).</li><li>Leszkowicz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noradrenaline-induced+enhancement+of+oscillatory+local+field+potentials+in+the+mouse+accessory+olfactory+bulb+does+not+depend+on+disinhibition+of+mitral+cells.">Noradrenaline-induced enhancement of oscillatory local field potentials in the mouse accessory olfactory bulb does not depend on disinhibition of mitral cells.</a> Eur J Neurosci. 35, 1433-1445 (2012).</li><li>Ames, A., Gurian, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+Recordings+from+Isolated+Mammalian+Retina+Mounted+as+a+Membrane.">Electrical Recordings from Isolated Mammalian Retina Mounted as a Membrane.</a> Arch Ophthalmol. 70, 837-841 (1963).</li><li>Flock, A. F., Strelioff, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+hair+cells+in+isolated+coils+from+the+guinea+pig+cochlea.">Studies on hair cells in isolated coils from the guinea pig cochlea.</a> Hear Res. 15, 11-18 (1984).</li><li>Woodbury, C. J., Ritter, A. M., Koerber, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+anatomy+of+individual+rapidly+adapting+low-threshold+mechanoreceptors+innervating+the+'hairy'+skin+of+newborn+mice:+early+maturation+of+hair+follicle+afferents.">Central anatomy of individual rapidly adapting low-threshold mechanoreceptors innervating the 'hairy' skin of newborn mice: early maturation of hair follicle afferents.</a> J Comp Neurol. 436, 304-323 (2001).</li><li>Llinas, R., Muhlethaler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+electrophysiological+study+of+the+in+vitro,+perfused+brain+stem-cerebellum+of+adult+guinea-pig.">An electrophysiological study of the in vitro, perfused brain stem-cerebellum of adult guinea-pig.</a> The Journal of physiology. 404, 215-240 (1988).</li><li>Riviere, S., Challet, L., Fluegge, D., Spehr, M., Rodriguez, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formyl+peptide+receptor-like+proteins+are+a+novel+family+of+vomeronasal+chemosensors.">Formyl peptide receptor-like proteins are a novel family of vomeronasal chemosensors.</a> Nature. 459, 574-577 (2009).</li><li>Meeks, J. P., Holy, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ex+vivo+preparation+of+the+intact+mouse+vomeronasal+organ+and+accessory+olfactory+bulb.">An ex vivo preparation of the intact mouse vomeronasal organ and accessory olfactory bulb.</a> J Neurosci Methods. 177, 440-447 (2009).</li><li>Leinders-Zufall, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+pheromone+detection+by+mammalian+vomeronasal+neurons.">Ultrasensitive pheromone detection by mammalian vomeronasal neurons.</a> Nature. 405, 792-796 (2000).</li><li>Kato, H. K., Chu, M. W., Isaacson, J. S., Komiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+sensory+representations+in+the+olfactory+bulb:+modulation+by+wakefulness+and+experience.">Dynamic sensory representations in the olfactory bulb: modulation by wakefulness and experience.</a> 76, 962-975 (2012).</li><li>Meeks, J. P., Arnson, H. A., Holy, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Representation+and+transformation+of+sensory+information+in+the+mouse+accessory+olfactory+system.">Representation and transformation of sensory information in the mouse accessory olfactory system.</a> Nature. 13, 723-730 (2010).</li></ol>

Yazarlar ifşa ilgilendiren önemli çatışmalar var.

Bu protokol açıklanan VNO-AOB ex vivo hazırlık vivo 5-7 ve akut canlı dilim AOB fonksiyonu 17 deneyleri anestezi için kullanışlı bir alternatif. Ayrıca elektrofizyolojik ve optik kayıtlar için devre elemanlarını maruz akut AOB dilim deneylerde, aksine, bu hazırlık tüm duyu ileticileri ve intra-AOB bağlantıları korur. Bu da vivo yaklaşımlar anestezi söylenebilir rağmen, anestezik varlığı mutlaka bu ve diğer koku devrelerde 18...

Memeli beyninde, duyusal, duyusal işlem tipik olarak girişten belirli özelliklerini belirler, her biri, çok sayıda karşılıklı olarak bağlantılı nöronal devrelerin kapsamaktadır. Duyusal yollar, erken bilgi işleme, normal algı ve davranış için hayati önem taşımaktadır. Aksesuar koku alma sisteminin (AOS) olarak, aksesuar koku ampul (AOB) hormonal dengeyi 1,2, saldırganlık 3 ve uyarılma 4 dikte aşağı yapıların duyusal çevreye bağlayan temel nöral devresidir. Bu nedenle, bu devre içinde bilgi işlem güçlü bir hayvan davranış değişiklikleri ile bağlantılıdır. Aksesuar koku alma ampul yoğun altındaki ana koku ampul (MOB) dorsal / kuyruk / posterior yönü de fareler ve sıçanlarda bulunan, burun sinüs vaskülarize. AOB vomeronasal organ (VNO) ikamet periferik vomeronasal duyusal nöronların (VSNs) aksonları afferent innervasyon alır, bir küçükSadece yumuşak damak yukarıdaki ön burun l kör uçlu tüp. Bu aksonlar nazal pasajların medial sınırında septal doku hassas levha dolaşırlar. Çeşitli çalışmalar anestezi fareler 5-7 veya özgürce keşfetmek hayvanları 8 kullanarak in vivo (örneğin fare idrar gibi) AOS kokuların kaynaklarına AOB sinir tepkiler problanmıştır var. Kahramanca (a) tracheotomies uçucu olmayan kokuları tanıtmak için derin anestezi sağlamak ve sıvı uyaranlara 5-7 aspirasyon önlemek, servikal sempatik ganglion 6 veya vomeronasal organın 5,7 doğrudan kanülasyonu (b) stimülasyon için ilgili in vivo çalışmalar anestezi ve (c) frontal lob ablasyon olan veya olmayan cerrahinin AOB 6 içine elektrot ilerleme sağlamak için. Uyanık / Çalışmalar Microdrive 8-10 dahil cerrahi implantasyon davranıyor. Özetle, bu deneysel paradigmalar güçlü, ama son derece zordur ve genellikle anestezi gerektirir. 11-15 ile vücudun (ex vivo) dışında canlı duyusal yapıları ve alt sinir devreleri korumak için çalıştı. VNO ve AOB arasındaki bağlantıları ipsilateral kalır ve ortadaki septal doku tek bir yarımkürede oksijenli superfusate maruz olabilir, çünkü biz onların fonksiyonel bağlantı korurken bu yapıların izole etmek için böyle bir tek hemisfer ex vivo yaklaşım geliştirmeye çalıştı çünkü. Biz son zamanlarda bu hedefe 16 almayı başardı. (Orta hat yumuşak septal doku birlikte) akson ve AOB hem oksijenli yapay beyin omurilik sıvısı (superfused erişilebilir 600 mikron özellikleri &lt;nispeten sığ olduğu için 6 saat - Bu hazırlık VNO ve AOB canlı ve fonksiyonel en az 4 için bağlı iki tutar aCSF). Bu VNO-AOB ex vivo hazırlık ince bir kanül yoluyla VNO doğru kontrollü uyaranların girişine izin verir, vehedeflenen elektrot yerleştirme ve / veya canlı floresan mikroskobu için küçük AOB doğrudan görsel erişim. Bir anestetik yokluğunda, bu devrelerin çalışma istediği, bu yöntem avantajlıdır. Bu yaklaşım, santrifüj bağlantıları koparır, çünkü iyi AOB fonksiyon santrifüj modülasyonu içine sorularınız için uygun değildir. VNO-AOB ex vivo hazırlama öğrenmek zordur, ama bir kez elde bu güçlü duyusal devrede devre organizasyon, bilgi işleme ve nöral plastisite araştırmak için bunun üzerine güvenilir bir platform oluşturur.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Straight Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14002-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors-Straight</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors-Curved</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14061-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11006-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#3 Scalpel Handle</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#11 Scalpel Blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>3120030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Carbon Steel Razor Blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Petri Dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Chamber</td>
			<td>Custom&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>See Fig. 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delrin plastic plank 0.6 cm x 1.5 cm x 0.1 cm</td>
			<td>Custom&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning Silicon Vacuum grease</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>146355D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#5 Forceps, Student</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#5 Forceps, Biologie Tip</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#5 Forceps, Student</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.0045&#34; Polyimide Tubing</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>823400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/16&#34; Male Luer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-45505-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/16&#34; Tubing</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-171-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two ton epoxy</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>5E157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ValveBank Pressurized Perfusion Kit</td>
			<td>AutoMate Scientific</td>
			<td>09-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ValveLink digital/manual controller</td>
			<td>AutoMate Scientific</td>
			<td>01-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>myo-inositol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-ascorbate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo preparations of the intact vomeronasal organ and accessory olfactory bulb

Mouse aksesuar koku alma sistemi (AOS) kalıcı sosyal koku, feromonlar ve Kayromonlar tespit için özel bir duyusal yoludur. AOS yolunda ilk nöral devre, aksesuar koku ampul (AOB), bu tür bölgesel saldırganlık ve çiftleşme gibi seks-tipik davranışları kurulmasında önemli bir rol oynar denir. Bu küçük (&lt;1 mm 3) Devre böyle conspecifics salgıları ve dışkı içinde kimyasal duyusal ipuçlarının seks, gerginlik ve stres gibi benzersiz davranış durumları, ayırt etme kapasitesine sahiptir. Bu sistemin organizasyonu aynı zamanda kompakt bir devrenin büyük bölümleri kayıt için benzersiz bir fırsat sunmaktadır da, AOB duyusal işleme araştırılması büyük ölçüde beyindeki deneysel olarak dezavantajlı bir konuma, zor olmaya devam etmektedir. Burada, bağlantı bırakarak anterior fare kafatası tek bir yarıküre içindeki, dokunulmamış AAM kaldırır çok aşamalı bir diseksiyon göstermekher ikisi de çevresel vomeronasal duyu nöronları (VSNs) ve lokal nöronal devre sağlam için iyonları. Prosedür anestezik yokluğunda elektrofizyolojik ve AOB devre elemanlarının optik kayıt kolaylaştıran, görsel muayene yönlendirmek için AOB yüzeyi ortaya koyar. AOB içinde aşağı aktivite kaydederken VSNs evler vomeronasal organ (VNO), içine ince bir kanül yerleştirdikten sonra, biri doğrudan sosyal koku ve feromonlar çevresini açığa çıkarabilir. Bu prosedür, davranış değişiklikleri feromon maruz bağlantı mekanizmalarına ışık tutabilecek, AOS bilgi işlem kontrollü olarak soruşturma sağlar.

Bu hazırlık ile başarıya ulaşmak geniş uygulama alır ve başarısız hangi birkaç adım vardır. Bir başarıya ulaşmak önce birçok deneme gerektirebilir beklemesin. Özel diseksiyon odası bu protokolün başarıyla tamamlanması için gerekli olan ve önceki diseksiyon sonraki aşamalarını başlamadan alınmalıdır. Şekil 1&#39;de sunulan odası tasarımı bu amaç için yeterlidir, ve en az işleme talepleri ile nispeten ucuz plastikten yapılabilir. Böyle bir bölmeyi üretmek için ...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb at JoVE.com

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Fare aksesuar koku ampul (AOB) duyusal kodlama bağlamında çalışma zor olmuştur. Burada, biz AOB nöronlar fare feromonlar ve Kayromonlar bir bilgi işleme araştırmalarını kolaylaştırmak, onların çevresel girişlerine işlevsel bağlı kaldığı bir ex vivo hazırlık üreten bir diseksiyon göstermektedir.

Bozulmamış Vomeronasal Organ ve Aksesuar Koku Ampul Ex Vivo Hazırlıklar

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

ex-vivo-preparations-intact-vomeronasal-organ-accessory-olfactory

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

10.7K Görüntüleme.  UT Southwestern Medical Center.  Fare aksesuar koku ampul (AOB) duyusal kodlama bağlamında çalışma zor olmuştur. Burada, biz AOB nöronlar fare feromonlar ve Kayromonlar bir bilgi işleme araştırmalarını kolaylaştırmak, onların çevresel girişlerine işlevsel bağlı kaldığı bir ex vivo hazırlık üreten bir diseksiyon göstermektedir. 

Video: Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Multielectrode Array Recordings of the Vomeronasal Epithelium

Understanding neural circuits requires methods to record from many neurons simultaneously. For in vitro studies, one currently available technology is planar multielectrode array (MEA) recording. Here we document the use of MEAs to study the mouse vomeronasal organ (VNO), which plays an essential role in the detection of pheromones and social cues via a diverse population of sensory neurons expressing hundreds of types of receptors. Combining MEA recording with a robotic liquid handler to deliver chemical stimuli, the sensory responses of a large and diverse population of neurons can be recorded. The preparation allows us to remove the intact neuroepithelium of the VNO from the mouse and stimulate with a battery of chemicals or potential ligands while monitoring the electrical activity of the neurons for several hours. Therefore, this technique serves as a useful method for assessing ligand activity as well as exploring the properties of receptor neurons. We present the techniques needed to prepare the vomeronasal epithelium, MEA recording, and chemical stimulation.

Multielectrode array (MEA) recordings provide a method for studying the electrical activity of large populations of neurons. Here, we present the details of a MEA preparation to record from the mouse vomeronasal epithelium while simultaneously stimulating the tissue.

Vomeronasal Epitel Multielectrode Dizi Kayıtlar

Understanding neural circuits requires methods to record from many neurons simultaneously. For in vitro studies, one currently available technology is ...

Nörobilim

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

Bozulmamış Duyu Organ Öncü Hücreler Canlı hücre Görüntüleme Drosophila Pupa

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the olfactory bulb (OB). The molecular mechanisms of OSN axon growth and targeting are not well understood. Manipulating gene expression and subsequent 
visualizing of single OSN axons and their terminal arbor morphology have thus far been challenging. To study gene function at the single cell level within a specified 
time frame, we developed a lentiviral based technique to manipulate gene expression in OSNs in vivo. Lentiviral particles are delivered to OSNs by microinjection 
into the olfactory epithelium (OE). Expression cassettes are then permanently integrated into the genome of transduced OSNs. Green fluorescent protein expression 
identifies infected OSNs and outlines their entire morphology, including the axon terminal arbor. Due to the short turnaround time between microinjection and 
reporter detection, gene function studies can be focused within a very narrow period of development. With this method, we have detected GFP expression within as 
few as three days and as long as three months following injection. We have achieved both over-expression and shRNA mediated knock-down by lentiviral microinjection. 
This method provides detailed morphologies of OSN cell bodies and axons at the single cell level in vivo, and thus allows characterization of candidate gene function 
during olfactory development.

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

We present a lentiviral technique for genetic manipulation and visualization of single olfactory sensory neuron axon and its terminal arborization in vivo.

Koku Duyu Nöronlar lentivirüs aracılı Genetik Manipülasyon ve Görselleştirme In vivo</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific regions of developing embryos, including those of C. elegans, chick, Xenopus, zebrafish, and mouse 1. In zebrafish, in vivo electroporation has been shown to have excellent spatial and temporal resolution for the delivery of these reagents 2-7. The temporal resolution of this method is important because it allows for incorporation of these reagents at specific stages in development. Furthermore, because expression from electroporated vectors occurs within 6 hours 7, this method is more timely than transgenic approaches. While the spatial resolution can be extremely precise when targeting a single cell 2, 6, it is often preferable to incorporate reagents into a specific cell population within a tissue or structure. When targeting multiple cells, in vivo electroporation is efficient for delivery to a specific region of the embryo; however, particularly within the developing nervous system, it is difficult to target specific cell types solely through spatially discrete electroporation. Alternatively, enhancer trap transgenic lines offer excellent cell type-specific expression of transgenes 8. Here we describe an approach that combines transgenic Gal4-based enhancer trap lines 8 with spatially discrete in vivo electroporation 7, 9 to specifically target developing neurons of the zebrafish olfactory bulb. The Et(zic4:Gal4TA4,UAS:mCherry)hzm5 (formerly GA80_9) enhancer trap line previously described 8, displays targeted transgenic expression of mCherry mediated by a zebrafish optimized Gal4 (KalTA4) transcriptional activator in multiple regions of the developing brain including hindbrain, cerebellum, forebrain, and the olfactory bulb. To target GFP expression specifically to the olfactory bulb, a plasmid with the coding sequence of GFP under control of multiple Gal4 binding sites (UAS) was electroporated into the anterior end of the forebrain at 24-28 hours post-fertilization (hpf). Although this method incorporates plasmid DNA into multiple regions of the forebrain, GFP expression is only induced in cells transgenically expressing the KalTA4 transcription factor. Thus, by using the GA080_9 transgenic line, this approach led to GFP expression exclusively in the developing olfactory bulb. GFP expressing cells targeted through this approach showed typical axonal projections, as previously described for mitral cells of the olfactory bulb 10. This method could also be used for targeted delivery of other reagents including short-hairpin RNA interference expression plasmids, which would provide a method for spatially and temporally discrete loss-of-function analysis.

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

The temporal and spatial resolution of genetic manipulations determines the spectrum of biological phenomena that they can perturb. Here we use temporally and spatially discrete in vivo electroporation, combined with transgenic lines of zebrafish, to induce expression of a GFP transgene specifically in neurons of the developing olfactory bulb.

Kombine Kullanımı Hedefleme Koku Ampul Nöronlar In Vivo Elektroporasyon ve Gal4 Tabanlı Enhancer Trap Zebra balığı Hatları

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific ...

Imaging Odor-Evoked Activities in the Mouse Olfactory Bulb using Optical Reflectance and Autofluorescence Signals

In the brain, sensory stimulation activates distributed populations of neurons among functional modules which participate to the coding of the stimulus. Functional optical imaging techniques are advantageous to visualize the activation of these modules in sensory cortices with high spatial resolution. In this context, endogenous optical signals that arise from molecular mechanisms linked to neuroenergetics are valuable sources of contrast to record spatial maps of sensory stimuli over wide fields in the rodent brain.
Here, we present two techniques based on changes of endogenous optical properties of the brain tissue during activation. First the intrinsic optical signals (IOS) are produced by a local alteration in red light reflectance due to: (i) absorption by changes in blood oxygenation level and blood volume (ii) photon scattering. The use of in vivo IOS to record spatial maps started in the mid 1980's with the observation of optical maps of whisker barrels in the rat and the orientation columns in the cat visual cortex1. IOS imaging of the surface of the rodent main olfactory bulb (OB) in response to odorants was later demonstrated by Larry Katz's group2. The second approach relies on flavoprotein autofluorescence signals (FAS) due to changes in the redox state of these mitochondrial metabolic intermediates. More precisely, the technique is based on the green fluorescence due to oxidized state of flavoproteins when the tissue is excited with blue light. Although such signals were probably among the first fluorescent molecules recorded for the study of brain activity by the pioneer studies of Britton Chances and colleagues3, it was not until recently that they have been used for mapping of brain activation in vivo. FAS imaging was first applied to the somatosensory cortex in rodents in response to hindpaw stimulation by Katsuei Shibuki's group4.
The olfactory system is of central importance for the survival of the vast majority of living species because it allows efficient detection and identification of chemical substances in the environment (food, predators). The OB is the first relay of olfactory information processing in the brain. It receives afferent projections from the olfactory primary sensory neurons that detect volatile odorant molecules. Each sensory neuron expresses only one type of odorant receptor and neurons carrying the same type of receptor send their nerve processes to the same well-defined microregions of &tilde;100&mu;m3 constituted of discrete neuropil, the olfactory glomerulus (Fig. 1). In the last decade, IOS imaging has fostered the functional exploration of the OB5, 6, 7 which has become one of the most studied sensory structures. The mapping of OB activity with FAS imaging has not been performed yet.
Here, we show the successive steps of an efficient protocol for IOS and FAS imaging to map odor-evoked activities in the mouse OB.

This article presents the protocols of intrinsic optical signals and flavoproteins autofluorescence signals imaging to map odor-evoked activities at the surface of the olfactory bulb in mice.

Optik Yansıtma ve Otofloresans Sinyalleri kullanarak, Fare Koku Ampul Görüntüleme Koku-Uyarılmış Etkinlikler

In the brain, sensory stimulation activates distributed populations of neurons among functional modules which participate to the coding of the stimulus. ...

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within the same species 1,2. These intraspecies signals, the pheromones, as well as signals from some predators 3, activate the vomeronasal sensory neurons (VSNs) with high levels of specificity and sensitivity 4. At least three distinct families of G-protein coupled receptors, V1R, V2R and FPR 5-14, are expressed in VNO neurons to mediate the detection of the chemosensory cues. To understand how pheromone information is encoded by the VNO, it is critical to analyze the response profiles of individual VSNs to various stimuli and identify the specific receptors that mediate these responses.
The neuroepithelia of VNO are enclosed in a pair of vomer bones. The semi-blind tubular structure of VNO has one open end (the vomeronasal duct) connecting to the nasal cavity. VSNs extend their dendrites to the lumen part of the VNO, where the pheromone cues are in contact with the receptors expressed at the dendritic knobs. The cell bodies of the VSNs form pseudo-stratified layers with V1R and V2R expressed in the apical and basal layers respectively 6-8. Several techniques have been utilized to monitor responses of VSNs to sensory stimuli 4,12,15-19. Among these techniques, acute slice preparation offers several advantages. First, compared to dissociated VSNs 3,17, slice preparations maintain the neurons in their native morphology and the dendrites of the cells stay relatively intact. Second, the cell bodies of the VSNs are easily accessible in coronal slice of the VNO to allow electrophysiology studies and imaging experiments as compared to whole epithelium and whole-mount preparations 12,20. Third, this method can be combined with molecular cloning techniques to allow receptor identification.
Sensory stimulation elicits strong Ca2+ influx in VSNs that is indicative of receptor activation 4,21. We thus develop transgenic mice that express G-CaMP2 in the olfactory sensory neurons, including the VSNs 15,22. The sensitivity and the genetic nature of the probe greatly facilitate Ca2+ imaging experiments. This method has eliminated the dye loading process used in previous studies 4,21. We also employ a ligand delivery system that enables application of various stimuli to the VNO slices. The combination of the two techniques allows us to monitor multiple neurons simultaneously in response to large numbers of stimuli. Finally, we have established a semi-automated analysis pipeline to assist image processing.

The vomeronasal organ (VNO) detects intraspecies chemical signals that convey social and reproductive information. We have performed Ca2+ imaging experiments using transgenic mice expressing G-CaMP2 in VNO tissue. This approach allows us to analyze the complicated response patterns of the vomeronasal neurons to large numbers of pheromone stimuli.

Görüntüleme Nöronal cevaplar Vomeronasal Organ Dilim hazırlıklar Genetiği Kodlanmış Kalsiyum Sensör ifade

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for investigating the cell biology and development of central brain structures by allowing acute pharmacological interventions and live imaging of cellular processes. As an example of the technique, prior work from our lab1 has shown that a previously unrecognized subcellular compartment lies between the axonal and somatodendritic compartments of axons of the Drosophila central brain. The development of this compartment, referred to as the axon initial segment (AIS)2, was shown genetically to depend on the neuron-specific cyclin-dependent kinase, Cdk5. We show here that ex vivo treatment of wild-type Drosophila larval brains with the Cdk5-specific pharmacological inhibitors roscovitine and olomoucine3 causes acute changes in actin organization, and in localization of the cell-surface protein Fasciclin 2, that mimic the changes seen in mutants that lack Cdk5 activity genetically.
A second example of the ex vivo culture technique is provided for remodeling of the connections of embryonic mushroom body (MB) gamma neurons during metamorphosis from larva to adult. The mushroom body is the center of olfactory learning and memory in the fly4, and these gamma neurons prune their axonal and dendritic branches during pupal development and then re-extend branches at a later timepoint to establish the adult innervation pattern5. Pruning of these neurons of the MB has been shown to occur via local degeneration of neurite branches6, by a mechanism that is triggered by ecdysone, a steroid hormone, acting at the ecdysone receptor B17, and that is dependent on the activity of the ubiquitin-proteasome system6. Our method of ex vivo culturing can be used to interrogate further the mechanism of developmental remodeling. We found that in the ex vivo culture setting, gamma neurons of the MB recapitulated the process of developmental pruning with a time course similar to that in vivo. It was essential, however, to wait until 1.5 hours after puparium formation before explanting the tissue in order for the cells to commit irreversibly to metamorphosis; dissection of animals at the onset of pupariation led to little or no metamorphosis in culture. Thus, with appropriate modification, the ex vivo culture approach can be applied to study dynamic as well as steady state aspects of central brain biology.

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

This article describes a method by which one can mimic in vivo development of the Drosophila mushroom body in an ex vivo culture system.

Tüm ex vivo ekimi ise, Gelişmekte Drosophila Brains

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

Bir Model Olarak Koku Sistemi Akson Büyüme Modelleri ve Morfoloji Eğitim için<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Observation of the Ciliary Movement of Choroid Plexus Epithelial Cells Ex Vivo

The choroid plexus is located in the ventricular wall of the brain, the main function of which is believed to be production of cerebrospinal fluid. Choroid plexus epithelial cells (CPECs) covering the surface of choroid plexus tissue harbor multiple unique cilia, but most of the functions of these cilia remain to be investigated. To uncover the function of CPEC cilia with particular reference to their motility, an ex vivo observation system was developed to monitor ciliary motility during embryonic, perinatal and postnatal periods. The choroid plexus was dissected out of the brain ventricle and observed under a video-enhanced contrast microscope equipped with differential interference contrast optics. Under this condition, a simple and quantitative method was developed to analyze the motile profiles of CPEC cilia for several hours ex vivo. Next, the morphological changes of cilia during development were observed by scanning electron microscopy to elucidate the relationship between the morphological maturity of cilia and motility. Interestingly, this method could delineate changes in the number and length of cilia, which peaked at postnatal day (P) 2, while the beating frequency reached a maximum at P10, followed by abrupt cessation at P14. These techniques will enable elucidation of the functions of cilia in various tissues. While related techniques have been published in a previous report1, the current study focuses on detailed techniques to observe the motility and morphology of CPEC cilia ex vivo.

Observation of the Ciliary Movement of Choroid Plexus Epithelial Cells Ex Vivo

In this study, a detailed light microscopic technique was optimized for real-time observation and analysis of the motion of CPEC cilia ex vivo together with an electron microscopic method for ultrastructural analysis.

Koroid Pleksus Epitel Hücreleri Silier Hareketi Gözlem<em&gt; Ex Vivo</em

The choroid plexus is located in the ventricular wall of the brain, the main function of which is believed to be production of cerebrospinal fluid. ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. However, there is piling evidence that olfaction is not solely limited to chemical sensitivity, but also includes temperature sensitivity. Premetamorphic Xenopus laevis are translucent animals, with protruding nasal cavities deprived of the cribriform plate separating the nose and the olfactory bulb. These characteristics make them well suited for studying olfaction, and particularly thermosensitivity. The present article describes the complete procedure for measuring temperature responses in the olfactory bulb of X. laevis larvae. Firstly, the electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) is performed with spectrally distinct dyes loaded into the nasal cavities in order to stain their axon terminals in the bulbar neuropil. The differential staining between left and right receptor neurons serves to identify the &#947;-glomerulus as the only structure innervated by contralateral presynaptic afferents. Secondly, the electroporation is combined with focal bolus loading in the olfactory bulb in order to stain mitral cells and their dendrites. The 3D brain volume is then scanned under line-illumination microscopy for the acquisition of fast calcium imaging data while small temperature drops are induced at the olfactory epithelium. Lastly, the post-acquisition analysis allows the morphological reconstruction of the thermosensitive network comprising the &#947;-glomerulus and its innervating mitral cells, based on specific temperature-induced Ca2+ traces. Using chemical odorants as stimuli in addition to temperature jumps enables the comparison between thermosensitive and chemosensitive networks in the olfactory bulb.

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Here we describe a protocol for measuring and analyzing temperature responses in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Olfactory receptor neurons and mitral cells are differentially stained, after which calcium changes are recorded, reflecting a sensitivity of some neural networks in the bulb to temperature drops induced at the nose.

koku ampul kalsiyum Değişiklikleri İzleme yoluyla Sıcaklık kaynaklı Nöronal Aktivite Kayıt<em&gt; Xenopus laevis</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...