P2X7受容体は非常に汎用性が高く、存在するアゴニストの量によって異なる機能を有する。このように、P2X7は異なる機能を有し、多くの異なるシステムの生理学を調節することができる。このプロトコルはP2X7受容体の3つの主要な機能の調査を可能にする。
それは、その機能を理解するための迅速で、再現可能で定量可能な方法です。P2X7受容体が神経前駆細胞でどのように調節できるかに焦点を当てています。しかし、この方法は、任意の細胞タイプに合わせて容易に適合させることができる。
この手順を試みる前に十分な文献を読んだ学生は、わずか1日でそれを学び、2〜3回の試みでこれを一人で実行することができます。テキストプロトコルに記載されているように、成体マウスの脳前駆細胞および成体マウスの海馬から神経前駆細胞を得ることによって、この手順を開始する。5%の二酸化炭素で37°Cの文化を維持する。
神経球は、7〜10日後に形成されるべきであり、海馬培養における通過ゼロ室帯培養および15〜20日後である。初期の通路ゼロ培養相に続いて、生物学的安全キャビネットおよび標準的な組織培養の実践を用いて必要に応じて7〜10日ごとに通過する。彼らは直径150〜200ミクロンに達したときに球を通過します。
15ミリリットルのチューブに球と媒体を収集し、2分間低速でスピンします。培地を取り出し、球体の大きさに応じて摂氏37度で7~10分間解離試薬で細胞をインキュベートします。最後に、ヘモサイトメーターまたは自動セルカウンターを使用して細胞を数えます。
カルシウムを含まないナトリウム培地の1ミリリットルで単一細胞を懸濁する。その後、カルシウム指標色素のミリリットル当たり2つのニニグラムと5%pluron酸の10マイクロリットルで細胞をロードします。30分間摂氏37度で細胞をインキュベートします。
カルシウムフリーのナトリウム培地を3~5ミリリットル加え、静かに遠心分離して細胞を洗います。上清を取り除き、カルシウムフリーのナトリウム培地で細胞を再び懸濁し、もう一度洗います。カルシウムを含まないナトリウム培地の1ミリリットルで細胞を再懸濁する。
その後、氷の上に細胞を置き、30分間脱エステル化させます。カリウム培地と遠心分離機を3~5ミリリットル加えて細胞をもう一度洗います。カリウム培地中の細胞を再懸濁した後、FACSチューブあたり500マイクロリットルあたり100万個の細胞の濃度で蛍光活性化細胞選別またはFACSチューブにeliquateします。
細胞が分析できる状態になるまで、FACSチューブを氷の上に置きます。細胞を長期間氷の上に置いたままにせず、できるだけ早くアッセイを開始してください。いくつかのサンプルについては、テキストプロトコルに記載されているように、P2X7受容体特異的阻害剤で細胞を事前インキュベートする。
最初のサンプルを実行する数分前に、1ミリモルの最終濃度に塩化カルシウムを加え、37°Cの水浴にチューブを入れ、回収します。FACSチューブにきれいな小さな磁気スターラーをドロップし、サンプル温度を制御するために、循環37°Cの水浴にリンクされている時間モジュールにチューブを配置します。渦効果を導入せずにサンプルの動きを確実にするために、低攪拌速度を選択します。
水差しとチューブアダプターをサンプルプラットフォームに配置し、FACS マシンのレバーアームを閉じます。サンプルの取得を開始し、1 秒あたり約 1,000 イベントで 3 分間サンプルを実行します。40秒のマークで、すぐにチューブを取り外し、P2X7アゴニストを追加します。
1ミリモルATPまたは300マイクロモルBzATPのいずれか。その後、チューブを交換して取得を継続します。最初のサンプルが記録されている間、2番目のサンプルを塩化カルシウムで準備します。
分析前に細胞がウォームアップするのに十分な時間を確保するために摂氏37度にします。最初のサンプルが完了したら、水サンプルを実行して、摂取量をきれいにします。次に、2番目のサンプルの取得は、以前と同様に開始することができます。
常にサンプル間の摂取量をきれいにします。以前のように単細胞懸濁液を作成し、調整された培地の数ミリリットルを保存します。培地を使用して、FACSチューブあたり100マイクロリットルあたり100万個の細胞の濃度で細胞を再中断し、準備ができるまで細胞を氷の上に置きます。
アッセイを実行する前に、900マイクロリットルのカリウム培地を1ミリリットルの最終体積に加えます。チューブを摂氏37度の水浴に10分間入れ、回収します。該当する場合は、P2X7特異的阻害剤を含む治療を行って細胞を事前インキュベートする。
アッセイを実行する直前に、FACSチューブに25マイクロモルエチジウム臭化エチジウムを加えます。次に磁気スターラーを追加し、チューブをFACSマシンに置き、以前と同様に取得を開始します。細胞膜内の細孔の形成を誘導するために、取得開始から40秒後に1ミリモルATPまたは100マイクロモルBzATPを加える。
1 秒あたり約 1,000 イベントでサンプルを 6 分間実行します。最初のサンプルが実行されている間、氷から2番目のサンプルを取り出し、分析前に細胞が回復するのに十分な時間を確保するために37°Cの水浴に入れます。最初のサンプルの取得が完了し、取り込みが完了したら、2番目のサンプルを機械に置いて記録を開始できます。
我々は、コンディションされた培地で単一細胞を中断し、FACSチューブあたり100マイクロリットルあたり少なくとも100万個の細胞の濃度でFACSチューブにeliquate。ナトリウム培地で1ミリリットル当たり100万個の細胞の最終濃度に細胞を希釈し、分析が行われるまで細胞を氷の上に置きます。リアルタイム食細胞化アッセイの貪食ターゲットとして1ミクロン幅Gビーズを使用してください。
最初のサンプルを実行する前に、細胞を摂氏37度の水浴に移し、約7〜10分間インキュベートして細胞を回収させます。ATP、酸化ATP、サイトケリシンD、4%パラホルムアルデヒドを含むそれぞれのチューブにプレインキュベーションを必要とする任意の治療を追加します。5%のヒト血清に対するプレインキュベーションは必要ありません。
治療がほぼ同時に加えられる場合、サンプルは連続して実行することができ、他の人はインキュベーション時間が異なるためインキュベートを続けます。サンプルを磁気スターラーでサイトメーターに置き、サンプルの取得を開始します。取得開始後15~20秒後にサンプルチューブを機械から取り出し、希釈されていないYGビーズを5マイクロリットル加える。
サンプル FACS チューブを計測器に戻し、集録を続行します。1 秒あたり約 1,000 イベントで 7 ~ 8 分間サンプルを実行します。最初のサンプルが実行されている間、氷から2番目のサンプルを取り出し、分析前に細胞が回復するのに十分な時間を確保するために37°Cの水浴に入れます。
最初のサンプルが完了し、取り入れが洗浄されたら、2番目のサンプルで取得を開始します。時間の経過とともにプロットすると、カルシウム流入は海馬および脳室領域神経前駆細胞で一般的に類似していた。アゴニストは42番目のマークに追加されました。
BzATPはP2X7受容体を急速に活性化し、イオンチャネルを開き、フルオロ8と蛍光フッ素に結合するカルシウム流入を可能にする。ATPの適用は一般的により緩やかなカルシウム流入をもたらす。BzATPと比較するとP2X7に対する親和性が低く、Gタンパク質共役受容体活性化も生じる。
アゴニストのATPおよびBzATPの適用に続いて、時間分解流サイトメトリーは、膜貫通細孔を通して細胞に入る臭化エチジウムをリアルタイムで捕捉する。この効果はP2X7特異的阻害剤によって減衰した。ATP濃度応答アッセイは、時間の経過に応じて臭化エチジウム蛍光の変化を用いたP2X7ポア形成に対するアゴニスト濃度の影響を示す。
ここでP2X7受容体関与性食細胞症は海馬及び脳前駆細胞による神経前駆細胞がリアルタイムで示されている。YGラテックスビーズの無抑制食細胞性レベルは、陽性対照として確立された。ATPは、非特異的阻害剤と同程度にYGビーズの食作用を阻害し、即ちパラホルムアルデヒド固定化とアクチン重合阻害剤のサイトケリンD.5%血清を全ての自然な食作用を廃止した。
健康な細胞集団を維持し、氷上の時間を短縮することは、再現性のある結果を得る上で不可欠です。可変性は、細胞全体のアッセイに同じバッチの ATP を使用することで最小化できます。ここで示すフローサイトメトリーの時間指定結果は、フローの量とターゲットサブ集団の変化を選択し続けることができる唯一のメッセージです。
代替方法は、蛍光顕微鏡および蛍光プラッタリーダーである。しかし、この方法では、蛍光親和性プログラムのために蛍光変化を継続的に測定することはできません。P2X7 は、一意にマルチモーダルです。
関心のあるセルでその表現を発見すると、調査官が探求するための一連のユニークな質問が開きます。
