私たちは、フローサイトメーターにアクセスするためのローリー·Destroismaisonsと卓越した技術サポートのためのサラPeyrardとDr.Alexandreプラットに感謝します。また、調製物からのミエリンの除去に関する彼の貢献のために博士ティモシー·ミラーを承認したいと思います。この作品は、ヘルスリサーチ（CIHR）神経筋研究パートナーシップ、革新のためのカナダの財団、カナダのALS協会、ALS研究フリック財団、CHUM財団とフォン·ド·ラ·ルシェルシュエンサンテ·デュ·ケベック（CVV）のカナダの研究所によってサポートされていました。 CVVおよびNAの両方がフォン·ド·ラ·ルシェルシュエンサンテ·デュ·ケベック州とCIHR新しい研究者の研究学​​者である。 SPはカナダのALS協会からティム·ノエル学生の身分によってサポートされています。

本研究で用いた動物は、カナダ人によって概説されるように国の基準に従って動物の保護のためのセンター·デ·ルシェルシュ·デュ·センターHospitalierドゥモントリオール大学（CRCHUM）制度委員会により承認されたプロトコル（N08001CVsr）に厳密に従って処理した。動物管理評議会（CCAC）。 このプロトコール（ 表1）を実行するために必要な全ての試薬 ​​を準備する。機器、消耗品や仕入先に関する他のすべての詳細は、材料のリストに記載されています。 <img alt="表1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51887/51887table1.jpg" width="500" /> 表1バッファー組成。 ラット脊髄の1集<ol><li>深く4％イソフルランでラット（ドーリー）を麻酔し。目のピンチの際に反射の欠如によってanaesthetizationを確認する電子の前足。ギロチンを経由して断頭によりラットを安楽死させる。安楽死のこの方法は、脊髄を歪めるかもしれない他のものよりも好ましい。 </li><li>背骨を露出させるために背中の皮膚をカット。ちょうど骨盤骨の上に骨ハサミで脊柱をカット​​。脊柱の開口部を可視化。 </li><li>脊柱に、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で満たされ、（炎の上にわずかに融解を介して結合）を200μlピペットの先端で、10ミリリットルの注射器を挿入します。 </li><li>プランジ​​ャーに圧力媒体量を適用することにより、脊髄を洗い流す。 </li><li>いずれかの血液が脊髄に存在する場合、次の手順に進む前に、PBSですすいでください。 注：このメソッドはまた、脳や肝臓のために検証されています。これらの組織を含めた場合は、半分に安楽死させたラットからの脳や脊髄への重量の等しい肝臓の一部を収集します。他のすべての手順は同じままである。 </li></ol>脊髄ミットの2の単離（ヴァンデヴェルデらから適応。4）ochondria <ol><li> 5ボリューム（〜3.25ミリリットル）均質化バッファー（HB）と5ミリリットルガラスホモジナイザー中の全無傷の脊髄と場所を収集します。単離されたミトコンドリアの最適な回復のために、氷の上または低温室ですべての手順を実行します。組織の大きな片がなくなるまで、手で約8ストロークを、組織をホモジナイズする。 2（2 ml）または3（1.7ミリリットル）マイクロ遠心チューブにホモジネートを置きます。卓上型マイクロ遠心4℃で10分間遠心1300×gで。 </li><li> 5ミリリットルの超遠心管に上清と場所を回復します。ペレットを含むマイクロ遠心チューブに750μlの（〜0.5容量）HBを加え、穏やかにペレットを再懸濁します。繰り返し遠心分離および再懸濁をさらに2回繰り返します。上記と同じ5ミリリットル超遠心チューブにプールのすべての上清（S1aとS1bとして）。このステップは、小さな破片を除去するのに役立つ。 </li><li>遠心分離機は、S1はスイングバケット腐敗を装備した超遠心機を使用してプールされたまたは4℃で15分間、17000×gで遠心する。 </li><li>細胞質ゾル画分（ウエスタンブロット分析のためなど）興味がある場合は、さらなる処理のために上清（S2）を保つ。 4ミリリットルのHB + 50mMのKClで、ペレット（P2）、粗製のミトコンドリア分画を再懸濁します。スイングバケットローター中4℃で15分間遠心17000×gで。上清を捨て、軽く800μlのHBでペレット（P3）を懸濁します。 NOTE：ミトコンドリアは、任意の非特異的ミトコンドリア関連汚染物質を除去するHB + 50mMのKClで洗浄する。 </li><li>新しい5ミリリットル超遠心管中で、再懸濁したペレット（P3）のちょうど800μlを添加する。 </li><li>この管に、それによって12％イオジキサノールの最終濃度を作成し、イオジキサノール（密度勾配培地）を200μlを追加。優しく、しかし徹底的にP1000とピペッティングを経由してチューブの内容を混ぜる。最初のイオジキサノールを加え、その後、ペレット（P3）は、完全な混合を容易にすることが好ましい場合がある。 ULT遠心し4°Cで15分間17000×gで、スイングバケットローターを備えracentrifuge。 </li><li>注：肝臓は、ミエリンが含まれていないとだけ肝臓が処理されている場合は、そのため、この手順は必要ありません。肝臓は中枢神経系のミトコンドリアと同時に処理されている場合は、それは平等にすべての組織を治療することをお勧めします。 </li><li>管の上部にあるミエリンの層を吸引し、慎重に取り外し、上清を捨てる。ペレットがゆるんでいる可能性があり。 4ミリリットルのHBでペレットを再懸濁。 4℃で10分間、17000×gで再び遠心分離します。上澄みを捨て、4ミリリットルのHBでペレットを再懸濁します。遠心分離を繰り返し、上清を除去します。 </li><li> 100-200μlのHBで最終ペレット（P7）を再懸濁し、1.7ミリリットルマイクロ遠心チューブに移す。このサンプルでは、​​単離されたミトコンドリアが含まれています。 </li><li>タンパク質の定量に進みます。ミトコンドリア対応時間の適切な可溶化を確実にするためにサンプルを、2％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）で標準曲線を希釈ngのタンパク質の定量。 </li></ol>フローサイトメトリー用単離されたミトコンドリアの3。免疫標識<ol><li>試験対象の各染色ミックス1.7 mlマイクロ遠心チューブに単離されたミトコンドリアのピペット25μgのために。各実験で染色されていないサンプルを含める。そして各抗体について、適切なアイソタイプコントロールのためのサンプルを含めるようにしてください。 </li><li>卓上型マイクロ遠心において、4℃で2分間17000×gで遠心分離します。 </li><li>上清を除去し、4℃（ブロッキング工程）で15分間、10％の脂肪酸フリーのBSAを添加した50μlのミトコンドリアバッファー（Mバッファ）で単離されたミトコンドリアを懸濁します。 注：ラベルの間に、4℃の冷蔵庫でインキュベーションを行う。 </li><li>管に一次抗体（ウサギ抗MFN2、1mlあたり20μgの）を追加し、4℃で30分間インキュベートする。 注：滴定により実験的に各抗体の最適濃度を決定する。により濃度の変動性および/またはpへurity、同一メーカーの同一の抗体の異なるロットは、異なる結果になる場合があります。したがって、滴定は、抗体のそれぞれの新しいロットのために必要とされる。 </li><li> 4℃で2分間17000×gで遠心分離：バインドされていない一次抗体を洗浄する。上清を除去し、穏やかに200μlのM緩衝液にペレットを再懸濁します。 4℃で2分間17000×gで遠心分離します。上清を除去し、50μlのMバッファーでペレットを再懸濁します。 </li><li>管に二次抗体（ロバ抗ウサギIgGをフィコエリトリン（PE）1mlあたり、0.5μgの）を追加し、光から保護し、4℃で30分間、サンプルをインキュベートする。 </li><li> 4℃で2分間17000×gで遠心分離：未結合の二次抗体を洗浄する。上清を除去し、200μlのM緩衝液にペレットを再懸濁します。 4℃で2分間17000×gで遠心分離します。上清を除去し、500μlのM緩衝液にペレットを再懸濁します。 </li><li>イベントは実際にはミトコンドリア内にあることを確認するために、と汚れ単離されたミトコンドリア光から保護し、室温で15分間、ミトコンドリア特異的な蛍光色素。他の機能のパラメータ（ミトコンドリア膜電位またはスーパーオキシド産生）の染色が必要な場合は、そうでない場合は、取得のために、手順5に進み、ステップ4に進みます。 注：二次抗体の発光スペクトルは、機能性染料のそれと互換性があることを確認することが重要です。例えば、テトラメチルローダミンメチルエステル（TMRM）とFITC及び膜電位に類似のスペクトル特性を有する市販の色素でミトコンドリアの純度を確認した場合、実行可能な二次抗体は、（：元は650nm /エム660nmのAPC）アロされることになる。適用可能な場合、すなわち 、単一のフルオロフォアで免疫標識または染色された標本を補償コントロールを追加します。 </li><li>ロードフローサイトメーターに適したチューブに移します。 （小さなサンプルサイズを容易にするために、マイクロタイターチューブは3がチューブフローサイトメーターミリリットルの内側に配置されます。）サンプルを氷上に保ち、直ちに進める取得のためのフローサイトメーター。 </li></ol>フローサイトメトリーによる4のアッセイミトコンドリア膜電位およびミトコンドリアスーパーオキシド生産<ol><li>単離されたミトコンドリアは、光から保護し、室温で15分間、のために、ステップ3.8で、100 nMのTMRM（例548 nmの/エム574 nm）を5で染色することにより無傷の膜電位を持っていることを確認します。サンプル集団間の膜電位、TMRM（1nMの30）の下側/非消光濃度の使用を比較するために、6より適切であるかもしれない。 <ol><li> TMRM染色、100μMのカルボニルシアニドmのクロロフェニルヒドラジン（CCCP）の存在下で100 nMのTMRMで染色する単離されたミトコンドリア、ミトコンドリアを脱分極しますミトコンドリア脱共役剤の対照として。染料のより低い濃度が使用される場合、ミトコンドリアを脱分極するために必要なCCCPの濃度は、少なくてもよい。 </li></ol></li><li>単離されたミトコンドリアがSTによってミトコンドリアのスーパーオキシドを生成することを確認してください光から保護して室温で15分間、のために、また、ステップ3.8において、適切なミトコンドリアのスーパーオキシドインジケータ7 aining。 <ol><li>ミトコンドリアのスーパーオキシド産生のための対照として、汚れを10μMアンチマイシンA、ミトコンドリアのスーパーオキシド産生を増大させるであろう呼吸鎖の複合体IIIの阻害剤の存在下で染料とミトコンドリアを単離した。 </li></ol></li></ol> 5。フローサイトメトリーによる免疫標識単離されたミトコンドリアの取得と解析に<ol><li>インストゥルメントを設定：リニアから切り替え電圧は、単離されたミトコンドリアの分析を容易にするためにモードを記録し、電圧（FSC：450; SSC：250）を設定する。イベントはFSC-A（面積）モードと同様に、FSC-W（幅）に回収されていることを確認し、FSC-H（高さ）、ダブレット（ すなわち、2つのイベントを除外することができるように、同時に検出器を通過する）分析後のデータ収集中。 100,000収集されるイベントの数を設定します。補償のコントロールを取得（該当する場合）。 </li><li>データ収集：データ収集の前に、サンプルをボルテックス避ける。代わりに優しくチューブをタップして混ぜる。当初ゲー中に、低圧でイベントを収集。総人口上のゲート。それに応じてヒストグラムの電圧を調整し、通常は無染色サンプルのピークが2番目の10年（10 2）に対応することになる。ゲートが確立され、そしてサンプルが処理されると、圧力が高いに切り替えることができる。 </li><li>分析：FSC対FSC-Wをプロットしてダブレットを可視化。シングレットダブレットを特定します。シングレット上のゲート。ミトコンドリア選択性色素で陽性に染色されたイベントにゲーティングすることによってミトコンドリアの人口を選択します。 </li><li>アイソタイプコントロールから背景ラベルを決定します。アイソタイプコントロールサンプルを使用して、MFN2抗体に対して陽性のミトコンドリアの人口ラベリングの割合を決定。 </li></ol>

<ol>
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P., Arbour, N., Vande Velde, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+damage+revealed+by+immunoselection+for+ALS-linked+misfolded+SOD1.">Mitochondrial damage revealed by immunoselection for ALS-linked misfolded SOD1.</a> Hum Mol Genet. 22, 3947-3959 (2013).</li><li>Frank, S., Gaume, B., Bergmann-Leitner, E. S., Leitner, W. W., Robert, E. G., Catez, F., Smith, C. L., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+dynamin-related+protein+1,+a+mediator+of+mitochondrial+fission,+in+apoptosis.">The role of dynamin-related protein 1, a mediator of mitochondrial fission, in apoptosis.</a> Dev Cell. 1, 515-525 (2001).</li><li>West, A. P., Brodsky, I. E., Rahner, C., Woo, D. K., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Walsh, M. C., Choi, Y., Shadel, G. S., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR+signalling+augments+macrophage+bactericidal+activity+through+mitochondrial+ROS.">TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS.</a> Nature. 472, 476-480 (2011).</li><li>Abad, M. F., Di Benedetto, G., Magalh&#227;es, P. J., Filippin, L., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+pH+monitored+by+a+new+engineered+green+fluorescent+protein+mutant.">Mitochondrial pH monitored by a new engineered green fluorescent protein mutant.</a> J Biol Chem. 279, 11521-11529 (2004).</li><li>Murphy, A. N., Bredesen, D., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bcl-2+potentiates+the+maximal+calcium+uptake+capacity+of+neural+cell+mitochondria.">Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 9893-9898 (1996).</li><li>Tantama, M., Martinez-Fran&#231;ois, J. R., Mongeon, R., Yellen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+energy+status+in+live+cells+with+a+fluorescent+biosensor+of+the+intracellular+ATP-to-ADP+ratio.">Imaging energy status in live cells with a fluorescent biosensor of the intracellular ATP-to-ADP ratio.</a> Nat Commun. 4, 2550 (2013).</li></ol>

著者らは、開示することは何もない。

これは、ミトコンドリアが正常な生理と病気の両方で重要なプレーヤーであることがますます明らかである。免疫ブロッティングながら全人口の平均で、この方法のレポートは、特定の条件でミトコンドリア内またはミトコンドリア表面で見出されるタンパク質を決定することができます。この方法は、ミトコンドリアの亜集団またはサブセットの相対存在量についての情報を得ることはで?...

ミトコンドリアは、高エネルギー需要部位に輸送され、生理的刺激1に迅速に対応している、核分裂と核融合の複数のラウンドを受ける非常にダイナミックな細胞小器官である。それはますます異なる組織内のミトコンドリア、さらには異なる細胞区画には、異なる機能プロファイルを有することが認識されているので、新しい方法は、これらの異なるミトコンドリアのサブセットを識別するために必要とされる。 顕微鏡検査は、個別のミトコンドリアを視覚化することができ、ミトコンドリアでのまたは中のタンパク質の存在が免疫蛍光2によって決定することができる手段を提供する。しかしながら、この方法による定量分析は、労働集約的であり、不死化または初代細胞株を用いた実験に適している。組織に由来する個別のミトコンドリアの研究が著しく困難であり、ほとんどの方法はevaluと同時にミトコンドリアのサブセットを容易に識別を可能にしないミトコンドリア機能3のation。 このハードルに対処するために、ミトコンドリアげっ歯類組織から単離し、続いてフローサイトメトリーにより分析を免疫標識するための新規な方法が開発されている。これは、顕微鏡による分析に比べてミトコンドリア外膜に局在するタンパク質の迅速な検出および定量を可能にする、はるかに少ない労働集約的であり、単一のサンプル中のミトコンドリアの数千の分析を可能にする。このアッセイは、ミトコンドリアにおいて構成的に存在すると考えられているミトコンドリア外膜タンパク質の運命および相対量を監視するために適用することができ、ミトコンドリアの表面へのタンパク質の補充、または病理学的状態におけるミトコンドリアにmislocalizedタンパク質の検出。また、従来の蛍光指示色素の取り込みは、異なるミトコンドリアにおけるミトコンドリア機能の特定の側面の同時評価を可能にする亜集団。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1276">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:349px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:543px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:267px;">Rats</td>
			<td style="width:349px;">Charles River</td>
			<td style="width:119px;">Strain code 400</td>
			<td style="width:543px;">Adult (9 weeks to 18 weeks) male or female rats can be used for the isolation protocol. Weight of rats is dependent on gender and age (males between 300 to 500 g and females between 200 to 350 g) are typically used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Dounce homogenizer</td>
			<td style="width:349px;">Kontes Glass Co.&#160;</td>
			<td style="width:119px;">885450-0022</td>
			<td>Duall 22</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:349px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sorvall Legend Micro 17 R</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Ulara-Clear Ultracentrifuge tubes</td>
			<td style="width:349px;">Beckman Coultier</td>
			<td style="width:119px;">344057</td>
			<td>Transparent, thin walled&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Sorvall Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:349px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sorvall WX UltraSeries</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">AH-650 rotor and buckets&#160;&#160;</td>
			<td style="width:349px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:267px;">Opti-prep</td>
			<td style="width:349px;">Axis-Shield</td>
			<td style="width:119px;">1114542</td>
			<td>Iodixanol, density gradient medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Fatty acid free Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:349px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A8806</td>
			<td>Must be fatty acid free for mitochondria</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Sodium succinate dibasic hexahydrate&#160;&#160;</td>
			<td style="width:349px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S9637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;width:267px;">Rabbit anti-Mitofusin2 antibody</td>
			<td style="width:349px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M6319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:267px;">Rabbit IgG</td>
			<td style="width:349px;">Jackson Immuno Research&#160;</td>
			<td style="width:119px;">011-000-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Anti-Rabbit IgG PE</td>
			<td style="width:349px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">12-4739-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Micro titer tube</td>
			<td style="width:349px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">223-9391</td>
			<td>For sample acquisition by flow cytometry&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">MitoTrackerGreen (MTG)</td>
			<td style="width:349px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">M7514</td>
			<td>100 nM: Ex490 nm/Em516 nm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">TMRM</td>
			<td style="width:349px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">T668</td>
			<td>100 nM: Ex548 nm/Em574 nm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">CCCP</td>
			<td style="width:349px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C2759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">MitoSOX Red</td>
			<td style="width:349px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">M36008</td>
			<td>5 &#181;M: Ex540 nm/Em600 nm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Antimycin A</td>
			<td style="width:349px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A8874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">LSR II flow cytometer</td>
			<td style="width:349px;">BD</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">BS FACSDiva Software</td>
			<td style="width:349px;">BD</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">FlowJo</td>
			<td style="width:349px;">TreeStar Inc.&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Software used for analysis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">BCA protein assay kit&#160;&#160;</td>
			<td style="width:349px;">Pierce/Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">23225</td>
			<td style="width:543px;">Bradford assay is not recomended as it is not compatible with high concentrations of SDS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunodetection of outer membrane proteins by flow cytometry of isolated mitochondria

動物組織内のミトコンドリア外膜タンパク質成分を検出し、監視するための方法は、ミトコンドリアの生理学および病態生理学を研究するために不可欠である。このプロトコルは、齧歯類の組織から単離されたミトコンドリアは、免疫標識およびフローサイトメトリーによって分析する技術が記載されている。ミトコンドリアは、齧歯類脊髄から単離され、ミエリン、神経組織から調製されたミトコンドリア画分の主要な汚染物質を除去するために急速な濃縮工程に供される。単離されたミトコンドリアは、その後、選択した抗体と、蛍光結合二次抗体で標識する。フローサイトメトリーによる分析は、免疫標識タンパク質の検出および定量に続いて、ミトコンドリア特異的色素で染色することにより、ミトコンドリア調製物の相対的な純度を検証します。この技術は、サンプルあたりのミトコンドリアの数十万の分析を可能にする、迅速な定量化及びハイスループットである。それは、新規なpを評価するために適用され正常な生理的条件下で、ミトコンドリアの表面でroteinsだけでなく、病理中にこの細胞小器官にmislocalizedなる可能性がタンパク質。重要なことに、この方法は、ミトコンドリア亜​​集団の特定の活動を報告する蛍光指示薬色素に結合され、中枢神経系（脳および脊髄）、ならびに肝臓からミトコンドリアに対して実行可能であることができる。

ラット脊髄から派生ミトコンドリアはMitofusin2（MFN2）、ミトコンドリア8の外膜の融合に関与するタンパク質を標的とした抗体で免疫することができます。 MFN2特異的な抗体と、蛍光結合二次抗体を用いて単離およびラベリングの後、ミトコンドリアは、フローサイトメトリー（ 図1）によって処理される。データ収集後、試料を第1のドットプロット（ 図2A）?...

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Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

ここで説明するフローサイトメトリーによりげっ歯類組織分析から単離されたミトコンドリアの免疫標識によってミトコンドリア外膜タンパク質を検出および定量するための方法である。この方法は、ミトコンドリア亜​​集団の機能的側面を評価するために拡張することができる。

単離されたミトコンドリアのフローサイトメトリーによる外膜タンパク質の免疫検出

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and ...

immunodetection-outer-membrane-proteins-flow-cytometry-isolated

Research

JoVE Journal

Biology

15.4K ビュー.  Université de Montréal, CRCHUM. ここで説明するフローサイトメトリーによりげっ歯類組織分析から単離されたミトコンドリアの免疫標識によってミトコンドリア外膜タンパク質を検出および定量するための方法である。この方法は、ミトコンドリア亜​​集団の機能的側面を評価するために拡張することができる。 

ビデオ: Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

IP-FCM:  Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic principle extends that of sandwich ELISA, wherein the captured primary analyte can be detected together with other molecules physically associated within multiprotein complexes. The procedure involves covalent coupling of polystyrene latex microbeads with immunoprecipitating monoclonal antibodies (mAb) specific for a protein of interest, incubating these beads with cell lysates, probing captured protein complexes with fluorochrome-conjugated probes, and analyzing bead-associated fluorescence by flow cytometry. IP-FCM is extremely sensitive, allows analysis of proteins in their native (non-denatured) state, and is amenable to either semi-quantitative or quantitative analysis. As additional advantages, IP-FCM requires no genetic engineering or specialized equipment, other than a flow cytometer, and it can be readily adapted for high-throughput applications.

The IP-FCM method is presented, which allows a sensitive, robust, biochemical assessment of native protein-protein interactions, without requiring genetic engineering or large sample sizes.

IP - FCM：フローサイトメトリーにより検出免疫沈降

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic ...

生物学

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces glucose uptake by insulin-sensitive tissues, most notably the brain, skeletal muscle, and adipocytes. Patients suffering from type-2 diabetes and/or obesity often develop insulin resistance and are unable to control their glucose homeostasis. New insights into the mechanisms of insulin resistance may provide new treatment strategies for type-2 diabetes.
The GLUT family of glucose transporters consists of thirteen members distributed on different tissues throughout the body1. Glucose transporter type 4 (GLUT4) is the major transporter that mediates glucose uptake by insulin sensitive tissues, such as the skeletal muscle. Upon binding of insulin to its receptor, vesicles containing GLUT4 translocate from the cytoplasm to the plasma membrane, inducing glucose uptake. Reduced GLUT4 translocation is one of the causes of insulin resistance in type-2 diabetes2,3.
The translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane can be visualized by immunocytochemistry, using fluorophore-conjugated GLUT4-specific antibodies.
Here, we describe a technique to quantify total amounts of GLUT4 translocation to the plasma membrane of cells during a chosen duration, using flow cytometry. This protocol is rapid (less than 4 hours, including incubation with insulin) and allows the analysis of as few as 3,000 cells or as many as 1 million cells per condition in a single experiment. It relies on anti-GLUT4 antibodies directed to an external epitope of the transporter that bind to it as soon as it is exposed to the extracellular medium after translocation to the plasma membrane.

This protocol describes a rapid technique to quantify the translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane of cells by flow cytometry.

フローサイトメトリーによる細胞膜へのGLUT4転の定量的測定

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

マウス減数分裂細胞のフローサイトメトリーの精製

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

脂質中間相における膜タンパク質のハイスループット結晶化のためのロボットの使用

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at atomic resolution. Presently, there is only one way to capture such information as applied to integral membrane proteins (Figure 1), and the complexes they form, and that method is macromolecular X-ray crystallography (MX). To do MX diffraction quality crystals are needed which, in the case of membrane proteins, do not form readily. A method for crystallizing membrane proteins that involves the use of lipidic mesophases, specifically the cubic and sponge phases1-5, has gained considerable attention of late due to the successes it has had in the G protein-coupled receptor field6-21 (<a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">www.mpdb.tcd.ie</a>). However, the method, henceforth referred to as the in meso or lipidic cubic phase method, comes with its own technical challenges. These arise, in part, due to the generally viscous and sticky nature of the lipidic mesophase in which the crystals, which are often micro-crystals, grow. Manipulating crystals becomes difficult as a result and particularly so during harvesting22,23. Problems arise too at the step that precedes harvesting which requires that the glass sandwich plates in which the crystals grow (Figure 2)24,25 are opened to expose the mesophase bolus, and the crystals therein, for harvesting, cryo-cooling and eventual X-ray diffraction data collection.
The cubic and sponge mesophase variants (Figure 3) from which crystals must be harvested have profoundly different rheologies4,26. The cubic phase is viscous and sticky akin to a thick toothpaste. By contrast, the sponge phase is more fluid with a distinct tendency to flow. Accordingly, different approaches for opening crystallization wells containing crystals growing in the cubic and the sponge phase are called for as indeed different methods are required for harvesting crystals from the two mesophase types. Protocols for doing just that have been refined and implemented in the Membrane Structural and Functional Biology (MS&amp;FB) Group, and are described in detail in this JoVE article (Figure 4). Examples are given of situations where crystals are successfully harvested and cryo-cooled. We also provide examples of cases where problems arise that lead to the irretrievable loss of crystals and describe how these problems can be avoided. In this article the Viewer is provided with step-by-step instructions for opening glass sandwich crystallization wells, for harvesting and for cryo-cooling crystals of membrane proteins growing in cubic and in sponge phases.

Herein is described procedures implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to harvest and cryo-cool membrane protein crystals grown in lipidic cubic and sponge phases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography.

高分子結晶学による構造決定のための脂質メソフェーズで栽培膜タンパク質の収穫とクライオ冷却結晶

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with a molecular mass smaller than 1.5 kDa. Although the definitive molecular identity of the pore is still under debate, proteins such as cyclophilin D, VDAC and ANT contribute to mtPTP formation. While the involvement of mtPTP opening in cell death is well established1, accumulating evidence indicates that the mtPTP serves a physiologic role during mitochondrial Ca2+ homeostasis2, bioenergetics and redox signaling 3.
mtPTP opening is triggered by matrix Ca2+ but its activity can be modulated by several other factors such as oxidative stress, adenine nucleotide depletion, high concentrations of Pi, mitochondrial membrane depolarization or uncoupling, and long chain fatty acids4. In vitro, mtPTP opening can be achieved by increasing Ca2+ concentration inside the mitochondrial matrix through exogenous additions of Ca2+ (calcium retention capacity). When Ca2+ levels inside mitochondria reach a certain threshold, the mtPTP opens and facilitates Ca2+ release, dissipation of the proton motive force, membrane potential collapse and an increase in mitochondrial matrix volume (swelling) that ultimately leads to the rupture of the outer mitochondrial membrane and irreversible loss of organelle function.
Here we describe a fluorometric assay that allows for a comprehensive characterization of mtPTP opening in isolated mouse heart mitochondria. The assay involves the simultaneous measurement of 3 mitochondrial parameters that are altered when mtPTP opening occurs: mitochondrial Ca2+ handling (uptake and release, as measured by Ca2+ concentration in the assay medium), mitochondrial membrane potential, and mitochondrial volume. The dyes employed for Ca2+ measurement in the assay medium and mitochondrial membrane potential are Fura FF, a membrane impermeant, ratiometric indicator which undergoes a shift in the excitation wavelength in the presence of Ca2+, and JC-1, a cationic, ratiometric indicator which forms green monomers or red aggregates at low and high membrane potential, respectively. Changes in mitochondrial volume are measured by recording light scattering by the mitochondrial suspension. Since high-quality, functional mitochondria are required for the mtPTP opening assay, we also describe the steps necessary to obtain intact, highly coupled and functional isolated heart mitochondria.

A spectrofluorometric protocol for the measurement of the mitochondrial permeability transition pore opening in isolated mouse heart mitochondria is presented here. The assay involves the simultaneous measurement of mitochondria Ca2+ handling, mitochondrial membrane potential and mitochondrial volume. The procedure for obtaining high-quality and functional heart mitochondria is also described.

単離ミトコンドリアマウス心臓における透水性遷移孔の開口部のマルチパラメータ測定

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

細胞トラッキング染料を使用して細胞分裂監視のための最適化された染色と増殖モデリング方法

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.

Calcium is involved in numerous physiological and pathophysiological signaling pathways. Live cell imaging requires specialized equipment and can be time consuming. A quick, simple method using a flow cytometer to determine relative changes in cytosolic calcium in adherent epithelial cells brought into suspension was optimized.

フローサイトメトリーによる腎上皮細胞における細胞質ゾルカルシウム測定

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

MitoCeption: Transferring Isolated Human MSC Mitochondria to Glioblastoma Stem Cells

Mitochondria play a central role for cell metabolism, energy production and control of apoptosis. Inadequate mitochondrial function has been found responsible for very diverse diseases, ranging from neurological pathologies to cancer. Interestingly, mitochondria have recently been shown to display the capacity to be transferred between cell types, notably from human mesenchymal stem cells (MSC) to cancer cells in coculture conditions, with metabolic and functional consequences for the mitochondria recipient cells, further enhancing the current interest for the biological properties of these organelles.
Evaluating the effects of the transferred MSC mitochondria in the target cells is of primary importance to understand the biological outcome of such cell-cell interactions. The MitoCeption protocol described here allows the transfer of the mitochondria isolated beforehand from the donor cells to the target cells, using MSC mitochondria and glioblastoma stem cells (GSC) as a model system. This protocol has previously been used to transfer mitochondria, isolated from MSCs, to adherent MDA-MB-231 cancer cells. This mitochondria transfer protocol is adapted here for GSCs that present the specific particularity of growing as neurospheres in vitro. The transfer of the isolated mitochondria can be followed by fluorescence-activated cell sorting (FACS) and confocal imaging using mitochondria vital dyes. The use of mitochondria donor and target cells with distinct haplotypes (SNPs) also allows detection of the transferred mitochondria based on the concentration of their circular mitochondrial DNA (mtDNA) in the target cells. Once the protocol has been validated with these criteria, the cells harboring the transferred mitochondria can be further analyzed to determine the effects of the exogenous mitochondria on biological properties such as cell metabolism, plasticity, proliferation and response to therapy.

Here, a protocol (MitoCeption) is presented to transfer mitochondria, isolated from human mesenchymal stem cells (MSC), to glioblastoma stem cells (GSC), with the goal of studying their biological effects on GSC metabolism and functions. A similar protocol can be adapted to transfer mitochondria between other cell types.

MitoCeption：神経膠芽腫幹細胞に単離されたヒトMSCミトコンドリアの転送

Mitochondria play a central role for cell metabolism, energy production and control of apoptosis. Inadequate mitochondrial function has been found ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to the analysis of a few fluorochromes, currently there are dozens of different fluorescent dyes, and up to 14-18 different dyes can be combined at a time. However, several limitations still impair the analytical capabilities. Because of the multiplicity of fluorescent probes, data analysis has become increasingly complex due to the need of large, multi-parametric compensation matrices. Moreover, mutant mouse models carrying fluorescent proteins to detect and trace specific cell types in different tissues have become available, so the analysis (by flow cytometry) of auto-fluorescent cell suspensions obtained from solid organs is required. Spectral flow cytometry, which distinguishes the shapes of emission spectra along a wide range of continuous wavelengths, addresses some of these problems. The data is analyzed with an algorithm that replaces compensation matrices and treats auto-fluorescence as an independent parameter. Thus, spectral flow cytometry should be capable of discriminating fluorochromes with similar emission peaks and can provide a multi-parametric analysis without compensation requirements.
This protocol describes the spectral flow cytometry analysis, allowing for a 21-parameter (19 fluorescent probes) characterization and the management of an auto-fluorescent signal, providing high resolution in minor population detection. The results presented here show that spectral flow cytometry presents advantages in the analysis of cell populations from tissues difficult to characterize in conventional flow cytometry, such as the heart and the intestine. Spectral flow cytometry thus demonstrates the multi-parametric analytical capacity of high-performing conventional flow cytometry without the requirement for compensation and enables auto-fluorescence management.

This article describes spectral cytometry, a new approach in flow cytometry that uses the shapes of emission spectra to distinguish fluorochromes. An algorithm replaces compensations and can treat auto-fluorescence as an independent parameter. This new approach allows for the proper analysis of cells isolated from solid organs.

スペクトラルフローサイトメトリーにより固形組織から単離された細胞懸濁液の分析

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...