M.E.H.は、Deutsche Forschungsgemeinschaft(DFG)プロジェクト番号413985647の資金援助に感謝します。著者らは、ミュンヘンのルートヴィヒ・マクシミリアン大学のミヒャエル・キーブラー博士の寛大で広範な支援に感謝します。ウォルター・ノイペルト氏の科学的なインプット、有益な議論、そして継続的なインスピレーションに感謝します。J.F.は、ミュンヘン生命科学大学院(LSM)の支援に感謝します。

1. バッファーとストック溶液
<ol><li>1 M 3-モルホリノプロパン-1-スルホン酸(MOPS)溶液を脱イオン水(pH 7.4)で調製します。4°Cで保存してください。</li>
	<li>500 mM エチレンジアミン四酢酸(EDTA)を脱イオン水、pH 8.0 で調製します。室温で保存してください。</li>
	<li>脱イオン水に2.4 Mソルビトールを調製します。オートクレーブ後、室温で保存してください。</li>
	<li>脱イオン水で2.5Mスクロースを調製します。オートクレーブ後、室温で保存してください。</li>
	<li>イソプロパノール中に 200 mM フェニルメチルスルホニルフッ化物(PMSF)を調製します。-20°Cで保存してください。 注意: PMSFは飲み込むと有毒であり、重度の皮膚火傷や眼の損傷を引き起こします。ほこりを吸い込まず、保護手袋とゴーグルを着用してください。</li>
	<li>脱イオン水で72%トリクロロ酢酸(TCA)を調製します。4°Cで保存してください。 注意: TCAは、呼吸器への刺激、重度の皮膚の火傷、および目の損傷を引き起こす可能性があります。ほこりを吸い込まず、保護手袋とゴーグルを着用してください。</li>
	<li>SMバッファー(20 mM MOPSおよび0.6 Mソルビトール、pH 7.4)を調製します。</li>
	<li>膨潤バッファー(20 mM MOPS、0.5 mM EDTA、1 mM PMSF、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル(pH 7.4))を調製します。</li>
	<li>スクロースグラジエントバッファー(0.8 M、0.96 M、1.02 M、1.13 M、1.3 M スクロース)を 20 mM MOPS で調製し、0.5 mM EDTA、pH 7.4 で溶液を調製します。 注:すべてのバッファーは4°Cで保存できます。ただし、真菌の増殖を防ぐために、スクロース含有バッファーを-20°Cで保存することを推奨します。プロテアーゼ阻害剤は、使用前に新たに添加する必要があります。</li>
</ol>2. 服従軟骨小胞の生成
<ol><li>粗酵母ミトコンドリアを確立されたプロトコルに従って新たに分離します34,35。 注:この実験では、ミトコンドリアを 出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)から単離しました。他の細胞小器官を欠いた勾配の純粋なミトコンドリアの生成は必要ありません。</li>
	<li>単離したばかりのミトコンドリア10 mgを1.6 mLのSMバッファー(4°C)にピペッティングで再懸濁します(図2、ステップ1)。</li>
	<li>ミトコンドリア懸濁液を予冷した100 mL三角フラスコに移します。</li>
	<li>20 mLのガラスピペットを使用して、16 mLの膨潤緩衝液をゆっくりと加えます。添加中は、氷上で絶えず穏やかに攪拌します。この浸透圧処理により、マトリックス空間に水分が取り込まれます。ミトコンドリアの内膜の腫れは外膜を破壊します。ただし、両方の膜は接触部位9で接触したままになります(図2、ステップ2)。</li>
	<li>氷上で30分間、一定の穏やかな攪拌下でサンプルをインキュベートします。</li>
	<li>5 mLのガラスピペットを使用して、5 mLの2.5 Mショ糖溶液をゆっくりと加え、サンプル中のスクロース濃度を約0.55 Mに上げます。この浸透圧処理は、マトリックス36からの水の流出をもたらす。内膜の収縮は、外膜の残留断片までの距離を最大化することを目的としています。これにより、超音波処理によって内膜と外膜の人工ハイブリッド小胞が生成される可能性が低下します(図2、ステップ3)。</li>
	<li>氷上で15分間穏やかに撹拌しながらサンプルをインキュベートします。</li>
	<li>ミトコンドリアを超音波処理して、提出軟骨膜小胞を生成します(図2、ステップ4)。<ol><li>ミトコンドリア懸濁液を予冷したロゼットセルに移します。</li>
		<li>ミトコンドリア懸濁液を10%の振幅で30秒間超音波処理し、ロゼットセルを氷浴で冷却します。</li>
		<li>懸濁液を氷浴で30秒間休ませます。.</li>
		<li>手順2.8.2と手順2.8.3をさらに3回繰り返します。 注:超音波処理条件は、使用する超音波処理装置によって異なります。個々のマシンに対して最適化が必要になります。過酷すぎる超音波処理は、ミトコンドリアの内膜と外膜からなる小胞の人工的な形成につながります。</li>
	</ol></li>
</ol>3. 服従軟骨小胞の分離
<ol><li>生成された小胞を、20,000 x g で4°Cで20分間遠心分離することにより、残りの無傷のミトコンドリアから分離します。 無傷のミトコンドリアはペレット化し、小胞は上清にとどまります。</li>
	<li>小胞混合物を濃縮します。<ol><li>上清を新しい超遠心分離チューブに移します。</li>
		<li>0.8 mm x 120 mmのカニューレを装備した1 mLのシリンジを使用して、チューブの底部に0.3 mLの2.5 Mショ糖溶液のクッションをロードします。</li>
		<li>118,000 x g で4°Cで100分間遠心分離します。 注:ここでは、最大半径153.1mmのスイングバケットローターを使用しました。遠心分離条件はローターに大きく依存し、別のローターを使用する場合は適合させる必要があります。</li>
	</ol></li>
	<li>小胞は、遠心分離後、スクロースクッションの上部にディスクとして現れます。上澄み液の約90%を捨てる。次に、ピペッティングで上下に動かし、2.5 Mスクロースを含む残りのバッファーに再懸濁することにより、濃縮小胞を回収します。懸濁液を氷冷したDounceホモジナイザーに移します。</li>
	<li>ポリテトラフルオロエチレンポッターを使用して、少なくとも10回のストロークで懸濁液を均質化します。</li>
	<li>スクロースグラジエントを準備します。<ol><li>5 ステップ(20 mM MOPS および 0.5 mM EDTA、pH 7.4 中の 1.3 M、1.13 M、1.02 M、0.96 M、0.8 M スクロース)を含む 11 mL のステップグラジエントの場合、各層には 2.2 mL のスクロース溶液があります。 注意: スクロース濃度を測定および調整するには、屈折計をお勧めします。ただし、必須ではありません。10 μLの緩衝液を屈折計に塗布し、それぞれの屈折率を検出します。ショ糖濃度の計算は次のとおりです。 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65444/65444eq01v2.jpg" style="margin: auto;"> 1.3333は水の屈折率を表します。0.048403は、水溶液中のモル屈折率からスクロース濃度への線形スケーリングから得られるスクロース特異的変換指数 である37。</li>
		<li>遠心分離チューブに最高濃度のショ糖を加え、チューブを-20°Cに保ちます。 レイヤーが完全にフリーズするまで待ってから、次のレイヤーを適用します。最後の層が追加されるまで適宜進み、グラジエントを-20°Cで保存します。 注:実験を開始するときは、グラジエントを融解するために、凍結グラジエントを 4 °C に移すことを忘れないでください。これには約3時間かかります。ここでの遠心分離には、容量13.2 mLのスイングバケットローターを使用しました。別のローターを使用する場合は、グラジエントステップボリュームをそれに応じて調整する必要があります。</li>
	</ol></li>
	<li>屈折計を使用してサンプルのスクロース濃度を測定します。屈折計にアクセスできない場合は、スクロース濃度が2 Mであると仮定することもできます。この想定されるスクロース濃度は、次のステップの基礎となります。</li>
	<li>適切な量の 20 mM MOPS、0.5 mM EDTA、1 mM PMSF、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル(pH 7.4)を添加して、スクロース濃度を 0.6 M に調整します。スクロース濃度が測定されずに2 Mと推定される場合は、調整後に濃度が十分に低いかどうかをテストすることをお勧めします。試験管内の200 μLの0.8 Mスクロースの上に、サンプルの少量のアリコート(約50 μL)を塗布します。サンプルは 0.8 M スクロースの上に留まる必要があります。</li>
	<li>サンプル(約 1 mL)をスクロースグラジエントの上にロードします(後で参照できるように 10% を保持します)。グラジエントの乱れを避けるためには、慎重なピペッティングが重要です(図2、ステップ5)。</li>
	<li>200,000 x g 、4°Cで12時間遠心分離して小胞を分離します。可能であれば、遠心分離機をゆっくりと加速および減速に設定して、グラジエントの乱れを回避します(図2、ステップ6)。 注:ここでは、最大半径153.1mmのスイングバケットローターを使用しました。遠心分離条件はローターに大きく依存し、別のローターを使用する場合は適合させる必要があります。</li>
	<li>1 mLのピペットを使用して、上から下へのグラジエントを700 μLのフラクションで回収します。これにより、17 のフラクションが得られ、十分な分離能が得られます。</li>
</ol>4. 服従軟骨小胞の解析
<ol><li>各画分を2回連続して実施されたTCA沈殿38に供することにより、タンパク質を濃縮し、SDS-PAGEサンプルを調製する。<ol><li>200 μL の 72% TCA を個々のフラクションに加え、溶液が均一になるまで混合します。フラクションを氷上で30分間インキュベートし、沈殿したタンパク質を20,000 x g および4°Cで20分間遠心分離してペレット化します。上清を廃棄し、500 μLの28%TCA溶液を加え、よく混合し、遠心分離ステップを繰り返します。</li>
		<li>ペレットを1 mLのアセトン(-20°C)で洗浄し、20,000 x g 、4°Cで10分間遠心分離します。 上澄みを捨て、ペレットを自然乾燥させます。ペレットを60 μLのSDSサンプルバッファーに再懸濁し、サンプルを95°Cで5分間インキュベートします。 注:最初のTCA沈殿後、特に高密度画分に大量のスクロースが残ります。これは、追加のTCA降水によって除去されます。</li>
	</ol></li>
	<li>各画分20 μLをSDS-PAGE39およびイムノブロッティング40、41、42、43で分析します。</li>
</ol>

ミトコンドリア接触部位の分離

著者らは、利益相反がないことを宣言します。

ミトコンドリアの分画は、いくつかの非常に複雑なステップからなる複雑な実験です。したがって、確立された方法32をさらに改善し、ある程度簡素化することを目指しました。ここでの課題は、複雑で高度に専門化された機器が必要であり、多くの場合、個別の構造であり、膨大な時間とエネルギーを消費することでした。そのために、線状勾配の鋳造と収穫に用いたポ?...

ミトコンドリアは真核生物においてさまざまな機能を果たしており、最もよく知られているのは酸化的リン酸化によるATPの産生です。その他の機能には、鉄-硫黄クラスターの生成、脂質合成、および高等真核生物ではCa2+シグナル伝達、およびアポトーシスの誘導が含まれます1,2,3,4。これらの機能は、その複雑な超微細構造と不可分に結びついています。
ミトコンドリアの超微細構造は、電子顕微鏡5によって最初に記述された。ミトコンドリアは、ミトコンドリア外膜とミトコンドリア内膜の2つの膜からなるかなり複雑な細胞小器官であることが示されました。したがって、2つの水性区画がこれらの膜によって形成される:膜間空間およびマトリックス。ミトコンドリアの内膜は、さらに異なるセクションに分けることができます。内側の境界膜は外側の膜に近接しており、クリステは陥入を形成します。いわゆるクリスタ接合部は、内側の境界膜とクリステをつなぎます(図1)。さらに、浸透圧的に縮小したミトコンドリアの電子顕微鏡写真は、ミトコンドリア膜が緊密に結合している部位が存在することを明らかにした6,7。これらのいわゆるコンタクトサイトは、2つの膜にまたがるタンパク質複合体によって形成されます(図1)。これらの相互作用部位は、ミトコンドリアの動態と遺伝の調節、ならびに細胞質とマトリックスの間の代謝産物とシグナルの伝達にとって重要であるため、細胞の生存に不可欠であると考えられている8。
ミトコンドリア内膜のMICOS複合体は、おそらく最もよく特徴付けられ、最も用途の広いコンタクトサイト形成複合体です。MICOSは2011年に酵母で記載され、Mic60、Mic27、Mic26、Mic19、Mic12、Mic10の6つのサブユニット9,10,1で構成されています。これらは約1.5MDaの複合体を形成し、クリスタ接合部9,10,11に局在する。Mic10またはMic60のいずれかのコアサブユニットが欠失すると、この複合体が欠損する9,11ため、これら2つのサブユニットがMICOSの安定性に不可欠である。興味深いことに、MICOSは、TOM複合体11,12、TOB/SAM複合体9,12,13,14,15,16、Fzo1-Ugo1複合体9、Por1 10、OM45 10、Miro 17など、様々なミトコンドリア外膜タンパク質および複合体と1つだけでなく複数の接触部位を形成します.このことは、MICOS複合体が、タンパク質の取り込み、リン脂質代謝、ミトコンドリアの超微細構造の生成など、様々なミトコンドリアプロセスに関与していることを強く示唆している18。後者の機能は、MIC10またはMIC60の欠失によって誘導されるMICOS複合体の欠如が、事実上完全に規則的なクリステを欠く異常なミトコンドリアの超微細構造をもたらすため、おそらくMICOSの主要な機能である。その代わりに、内界膜と接続していない内膜小胞が蓄積する19、20。重要なことに、MICOSは酵母からヒトまで形態と機能が保存されています21。MICOSサブユニットの変異と重篤なヒト疾患との関連は、高等真核生物にとっての重要性も強調している22,23。MICOSは非常に用途が広いですが、追加の接触サイトが存在する必要があります(未発表の観察に基づく)。実際、ミトコンドリア特異的リン脂質カルジオリピンの生合成に関与するミトコンドリア融合機構Mgm1-Ugo1/Fzo124,25,26またはMdm31-Por1など、他のいくつかの接触部位が同定されている27。最近、我々はMICOSの同定に至った手法を改良し、外膜複合体Por1-Om14と形成される新規接触部位の一部としてCqd1を同定した28。興味深いことに、この接触部位は、ミトコンドリア膜の恒常性、リン脂質代謝、コエンザイムQ28,29の分布などの複数のプロセスにも関与しているようです。
ここでは、先に述べたミトコンドリア9,30,31,32,33の分画の変形を用いた。ミトコンドリアの浸透圧処理は、ミトコンドリア外膜の破壊とマトリックス空間の収縮をもたらし、2つの膜は接触部位でのみ近接した状態になります。これにより、ミトコンドリア外膜またはミトコンドリア内膜のみからなる、または軽度の超音波処理による両方の膜の接触部位を含む小胞の生成が可能になります。ミトコンドリア内膜はタンパク質と脂質の比率がはるかに高いため、ミトコンドリア内膜小胞はミトコンドリア外膜小胞と比較してより高い密度を示します。密度の差を利用して、スクロース浮力密度勾配遠心分離により膜小胞を分離することができます。したがって、ミトコンドリア外膜小胞は低スクロース濃度で蓄積し、ミトコンドリア内膜小胞は高スクロース濃度で濃縮されます。接触部位を含む小胞は、中程度のスクロース濃度で濃縮されます(図2)。以下のプロトコルは、以前に確立されたもの32と比較して、より少ない専門機器、時間、およびエネルギーを必要とするこの改良された方法を詳細に説明し、可能な接触部位タンパク質の同定のための有用なツールを提供します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>13.2 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89mm</td>
			<td>Beckman Instruments, Germany</td>
			<td>344059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL, Open-Top Thickwall Polycarbonate Open-Top Tube, 29 x 104mm</td>
			<td>Beckman Instruments, Germany</td>
			<td>363647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-25.50 Fixed-Angle Rotor- Aluminum, 8 x 50 mL, 25,000 rpm, 75,600 x g</td>
			<td>Beckman Instruments, Germany</td>
			<td>363055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Abbe refractometer</td>
			<td>Zeiss, Germany</td>
			<td></td>
			<td>discontinued, 
			any pipet controller will suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>accu-jet pro Pipet Controller</td>
			<td>Brandtech, USA</td>
			<td>BR26320</td>
			<td>discontinued, 
			any pipet controller will suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker 1000 mL</td>
			<td>DWK Life Science, Germany</td>
			<td>C118.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson&#160; Digital Sonifier W-250 D</td>
			<td>Branson Ultrasonics, USA</td>
			<td>FIS15-338-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson Ultrasonic 3mm TAPERED MICROTIP</td>
			<td>Branson Ultrasonics, USA</td>
			<td>101-148-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson Ultrasonics 200- and 400-Watt Sonifiers: Rosette Cooling Cell</td>
			<td>Branson Ultrasonics, USA</td>
			<td>15-338-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Avanti JXN-26</td>
			<td>Beckman Instruments, Germany</td>
			<td>B37912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Optima XPN-100 ultra</td>
			<td>Beckman Instruments, Germany</td>
			<td>8043-30-0031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Proteaseinhibtor-Cocktail</td>
			<td>Roche, Switzerland</td>
			<td>11697498001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sorbit</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>6213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (Ethylendiamin-tetraacetic acid disodium salt dihydrate)</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>8043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flask, 100 mL</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>X747.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>graduated pipette, Kl. B, 25:0, 0.1</td>
			<td>Hirschmann, Germany</td>
			<td>1180170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>graduated pipette, Kl. B, 5:0, 0.05</td>
			<td>Hirschmann, Germany</td>
			<td>1180153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ice bath</td>
			<td>neoLab, Germany</td>
			<td>&#160;S12651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer RCT basic</td>
			<td>IKA-Werke GmbH, Germany</td>
			<td>Z645060GB-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulphonic acid)</td>
			<td>Gerbu, Germany</td>
			<td>1081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyPipetman Select P1000</td>
			<td>Gilson, USA</td>
			<td>FP10006S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyPipetman Select P20</td>
			<td>Gilson, USA</td>
			<td>FP10003S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyPipetman Select P200</td>
			<td>Gilson, USA</td>
			<td>FP10005S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnifix 1 mL</td>
			<td>Braun, Germany</td>
			<td>4022495251879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Serva, Germany</td>
			<td>32395.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STERICAN cannula 21 Gx4 4/5 0.8x120 mm</td>
			<td>Braun, Germany</td>
			<td>4022495052414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stirring bar, 15 mm</td>
			<td>VWR, USA</td>
			<td>442-0366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Merck, Germany</td>
			<td>S8501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor</td>
			<td>Beckman Instruments, Germany</td>
			<td>331362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test tubes</td>
			<td>Eppendorf, Germany</td>
			<td>3810X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL glass vessel</td>
			<td>VWR, USA</td>
			<td>432-0200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL plunger with serrated tip</td>
			<td>VWR, USA</td>
			<td>432-0212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid (TCA)</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>33731</td>
			<td>discontinued, 
			any TCA will suffice (CAS: 73-03-9)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>4855</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an improved method to isolate mitochondrial contact sites

ミトコンドリアは、事実上すべての真核細胞に存在し、例えば、鉄硫黄クラスター、脂質、またはタンパク質の合成、Ca2+ 緩衝、およびアポトーシスの誘導など、エネルギー生産をはるかに超える重要な機能を果たします。同様に、ミトコンドリアの機能不全は、癌、糖尿病、神経変性などの重篤な人間の病気を引き起こします。これらの機能を実行するために、ミトコンドリアは、2つの膜からなるエンベロープを介して細胞の残りの部分と通信する必要があります。したがって、これら2つの膜は常に相互作用する必要があります。ミトコンドリアの内膜と外膜の間のタンパク質接触部位は、この点で不可欠です。これまでのところ、いくつかの接触サイトが特定されています。本明細書に記載の方法では、 出芽酵母ミトコンドリア(Saccharomyces cerevisiae mitochondria)を用いて接触部位を単離し、したがって、接触部位タンパク質に適格な候補を同定する。この手法を用いて、酵母からヒトまで保存されているミトコンドリア内膜における主要なコンタクトサイト形成複合体の1つであるミトコンドリアコンタクトサイトとクリステ組織システム(MICOS)複合体を同定しました。最近では、この手法をさらに改良し、Cqd1とPor1-Om14複合体からなる新規コンタクトサイトを同定しました。

Mitochondria perform a variety of different functions in eukaryotes, with the most well-known being the production of ATP through oxidative phosphorylation. Other functions include the production of iron-sulfur clusters, lipid synthesis, and in higher eukaryotes, Ca2+ signaling, and the induction of apoptosis1,2,3,4. These functions are inseparably linked to their complex ultrastructure.
The mitochondrial ultrastructure was first described by electron microscopy5. It was shown that mitochondria are rather complex organelles consisting of two membranes: the mitochondrial outer membrane and the mitochondrial inner membrane. Thus, two aqueous compartments are formed by these membranes: the intermembrane space and the matrix. The mitochondrial inner membrane can be even further divided into different sections. The inner boundary membrane stays in close proximity to the outer membrane, and the cristae form invaginations. So-called crista junctions connect the inner boundary membrane and the cristae (Figure 1). Furthermore, electron micrographs of osmotically shrunken mitochondria reveal that sites exist at which the mitochondrial membranes are tightly connected6,7. These so-called contact sites are formed by protein complexes spanning the two membranes (Figure 1). It is thought that these interaction sites are essential for cell viability due to their importance for the regulation of mitochondrial dynamics and inheritance, as well as the transfer of metabolites and signals between the cytosol and the matrix8.
The MICOS complex in the mitochondrial inner membrane is probably the best characterized and the most versatile contact site-forming complex. MICOS was described in yeast in 2011, and it consists of six subunits9,10,11: Mic60, Mic27, Mic26, Mic19, Mic12, and Mic10. These form a complex of approximately 1.5 MDa that localizes to the crista junctions9,10,11. The deletion of either core subunit, Mic10 or Mic60, leads to the absence of this complex9,11, meaning these two subunits are essential for the stability of MICOS. Interestingly, MICOS forms not only one but multiple contact sites with various mitochondrial outer membrane proteins and complexes: the TOM complex11,12, the TOB/SAM complex9,12,13,14,15,16, the Fzo1-Ugo1 complex9, Por110, OM4510, and Miro17. This strongly indicates that the MICOS complex is involved in various mitochondrial processes, such as protein import, phospholipid metabolism, and the generation of the mitochondrial ultrastructure18. The latter function is probably the major function of&#160;MICOS, as the absence of the MICOS complex induced through the deletion of MIC10&#160;or MIC60&#160;leads to an abnormal mitochondrial ultrastructure that virtually completely lacks regular cristae. Instead, internal membrane vesicles without connection to the inner boundary membrane accumulate19, 20. Importantly, MICOS is conserved in form and function from yeast to&#160;human21. The association of mutations in MICOS subunits with severe human diseases also emphasizes its importance for higher eukaryotes22,23. Although MICOS is highly versatile, additional contact sites must exist (based on our unpublished observations). Indeed, several other contact sites have been identified, for instance, the mitochondrial fusion machineries Mgm1-Ugo1/Fzo124,25,26&#160;or Mdm31-Por1, which is involved in the biosynthesis of the mitochondrial-specific phospholipid cardiolipin27. Recently, we improved the method that led us to the identification of MICOS to identify Cqd1 as part of a novel contact site formed with the outer membrane complex Por1-Om1428. Interestingly, this contact site also seems to be involved in multiple processes such as mitochondrial membrane homeostasis, phospholipid metabolism, and the distribution of coenzyme Q28,29.
Here, we used a variation of the previously described fractionation of mitochondria9,30,31,32,33. Osmotic treatment of mitochondria leads to the disruption of the mitochondrial outer membrane and to a shrinkage of the matrix space, leaving the two membranes only in close proximity at contact sites. This allows for the generation of vesicles that consist exclusively of mitochondrial outer membrane or mitochondrial inner membrane or at contain contact sites of both membranes through mild sonication. Due to the mitochondrial inner membrane possessing a much higher protein-to-lipid ratio, mitochondrial inner membrane vesicles exhibit a higher density compared to mitochondrial outer membrane vesicles. The difference in density can be used to separate the membrane vesicles through sucrose buoyant density gradient centrifugation. Thus, the mitochondrial outer membrane vesicles accumulate at low sucrose concentrations, while the mitochondrial inner membrane vesicles are enriched at high sucrose concentrations. The vesicles containing contact sites concentrate at intermediate sucrose concentrations (Figure 2). The following protocol describes this improved method, which requires less specialized equipment, time, and energy compared to our previously established one32, in detail and provides a useful tool for the identification of possible contact site proteins.

著者スポットライト:ミトコンドリアの接触部位と建築的洞察の発表 

ミトコンドリア接触部位を単離するための改良された方法

We aim to understand the molecular function of mitochondrial contact sites, allowing the communication between the two mitochondrial membranes. This actually is a prerequisite to grasp the function for mitochondrial biogenesis and thus, cell viability. We discovered a new contact site between the mitochondrial inner and outer membrane created by Cqd1 and Om14-Por1.Our data suggests that this site might assist in lipid import like phosphatidic acid. Based on the identification of the MICOS complex, we contributed to get a deeper understanding of how mitochondrial membrane architecture is generated. This allowed us to develop a working model that explains how the two forms of mitochondrial cristae, lamellar and tubular cristae are formed.Our research was done in yeast in the past. However, we are convinced that the formation of correct mitochondrial architecture is important for higher eukaryotes too. So the next step in our research is analyzing the role of mitochondrial architecture elements in more complex models such as primary neurons.

ミトコンドリアの内膜と外膜を分離することは比較的簡単です。しかし、接触部位を含む小胞の生成と分離ははるかに困難です。私たちの意見では、超音波処理条件と使用される勾配の2つのステップが重要かつ不可欠です。
通常、線形グラデーションは、ステップグラデーションと比較して解像度が高いと考えられています。しかし、再現性のある生産は面倒で、特別?...

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ミトコンドリアコンタクトサイトは、ミトコンドリアの内膜および外膜タンパク質と相互作用するタンパク質複合体です。これらの部位は、ミトコンドリア膜間のコミュニケーション、したがって細胞質とミトコンドリアマトリックスの間のコミュニケーションに不可欠です。ここでは、この特定のクラスのタンパク質に適格な候補を同定する方法について説明します。

Mitochondria are present in virtually all eukaryotic cells and perform essential functions that go far beyond energy production, for instance, the ...

私たちは、ミトコンドリアの2つの膜間のコミュニケーションを可能にするミトコンドリア接触部位の分子機能の理解を目指しています。これは、ミトコンドリアの生合成機能、ひいては細胞の生存率を把握するための前提条件です。我々は、Cqd1とOm14-Por1によって作られたミトコンドリアの内膜と外膜の間に新しい接触部位を発見しました。私たちのデータは、この部位がホスファチジン酸のような脂質の輸入を助ける可能性があることを示唆しています。MICOS複合体の同定に基づき、ミトコンドリア膜構造がどのように生成されるのかをより深く理解することに貢献しました。これにより、ミトコンドリアクリステの2つの形態、ラメラと管状クリステがどのように形成されるかを説明する作業モデルを開発することができました。私たちの研究は、過去に酵母で行われました。しかし、正しいミトコンドリア構造の形成は、高等真核生物にとっても重要であると確信しています。そこで、私たちの研究の次のステップは、一次ニューロンのようなより複雑なモデルにおけるミトコンドリア構造要素の役割を分析することです。

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Improved Method to Isolate Mitochondrial Contact Sites

1.0K ビュー.  Ludwig-Maximilians University Munich. 私たちは、ミトコンドリアの2つの膜間のコミュニケーションを可能にするミトコンドリア接触部位の分子機能の理解を目指しています。これは、ミトコンドリアの生合成機能、ひいては細胞の生存率を把握するための前提条件です。我々は、Cqd1とOm14-Por1によって作られたミトコンドリアの内膜と外膜の間に新しい接触部位を発見しました。私たちのデータは、こ?...

ビデオ: 著者スポットライト:ミトコンドリアの接触部位と建築的洞察の発表 

Mitochondria are present in virtually all eukaryotic cells and perform essential functions that go far beyond energy production, for instance, the synthesis of iron-sulfur clusters, lipids, or proteins, Ca2+ buffering, and the induction of apoptosis. Likewise, mitochondrial dysfunction results in severe human diseases such as cancer, diabetes, and neurodegeneration. In order to perform these functions, mitochondria have to communicate with the rest of the cell across their envelope, which consists of two membranes. Therefore, these two membranes have to interact constantly. Proteinaceous contact sites between the mitochondrial inner and outer membranes are essential in this respect. So far, several contact sites have been identified. In the method described here, Saccharomyces cerevisiae mitochondria are used to isolate contact sites and, thus, identify candidates that qualify for contact site proteins. We used this method to identify the mitochondrial contact site and cristae organizing system (MICOS) complex, one of the major contact site-forming complexes in the mitochondrial inner membrane, which is conserved from yeast to humans. Recently, we further improved this method to identify a novel contact site consisting of Cqd1 and the Por1-Om14 complex.

Mitochondrial contact sites are protein complexes that interact with mitochondrial inner and outer membrane proteins. These sites are essential for the communication between the mitochondrial membranes and, thus, between the cytosol and the mitochondrial matrix. Here, we describe a method to identify candidates qualifying for this specific class of proteins.

生化学

Generating Submitochondrial Vesicles from Saccharomyces cerevisiae Mitochondria to Isolate Mitochondrial Contact Sites

Generating Submitochondrial Vesicles from  Saccharomyces cerevisiae Mitochondria to Isolate Mitochondrial Contact Sites  

To begin, take 10 milligrams of freshly-isolated crude yeast mitochondria and re-suspend them in 1.6 milliliters of SM buffer at four degrees celsius by pipetting. Then, transfer the mitochondrial suspension to a pre-cooled 100-milliliter Erlenmeyer flask. Slowly, add 16 milliliters of the swelling buffer, using a 20-milliliter glass pipette while applying constant mild stirring on ice.Incubate the samples under constant mild stirring for 30 minutes on ice. Then, slowly add five milliliters of 2.5-molar sucrose solution using a five-milliliter glass pipette, allowing the inner membrane to shrink. Incubate the samples under mild stirring for 15 minutes on ice.To generate sub-mitochondrial membrane vesicles, transfer the mitochondrial suspension to a pre-cool rosette cell, and sonicate the suspension at 10%amplitude for 30 seconds while cooling the rosette cell in an ice bath. Rest the suspension for 30 seconds in an ice bath.

出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)のミトコンドリアからミトコンドリアの接触部位を単離するためのサブラミ軟骨小胞の生成

Separation and Analysis of Submitochondrial Vesicles to Identify Mitochondrial Contact Site Proteins

To begin, take the prepared yeast sub-mitochondrial vesicles and centrifuge the generated vesicles and remaining intact mitochondria at 20, 000 G for 20 minutes at four degrees Celsius. The intact mitochondria formed the pellet while the vesicles stay in the supernatant. Next, transfer the supernatant to fresh ultra centrifugation tubes.Load a cushion of 0.3 milliliters of 2.5 molar sucrose solution at the bottom of the tube using a one milliliter syringe equipped with a cannula, and centrifuge at 118, 000 G for 100 minutes at four degrees Celsius. After centrifugation, the vesicles will appear as a disc on the top of the sucrose cushion. Discard approximately 90%of the supernatant.To harvest the concentrated vesicles, resuspend them in the remaining buffer, including the 2.5 molar sucrose by pipetting. Transfer the suspension to an ice cold Dounce homogenizer and homogenize the suspension using a polytetrafluoroethylene potter with at least 10 strokes. Next, prepare an 11 milliliter step gradient with each layer containing 2.2 milliliters of sucrose solution.Calculate the sucrose concentration using this formula. Add the highest sucrose concentration to the centrifugation tube and place it at minus 20 degrees Celsius until the layer is completely frozen. Measure the sucrose concentration of the samples using a refractometer.If a refractometer is unavailable, assume the sucrose concentration is 2 molar. To adjust the sucrose concentration to 0.6 molars, add the appropriate MOPS, E-D-T-A, P-M-S-F, and protease inhibitor cocktail at pH 7.4. Carefully load the samples on the sucrose gradient to avoid the disturbance of the gradient.Centrifuge the vesicles at 200, 000 G and four degree Celsius for 12 hours. If possible, set slow acceleration and deceleration to avoid disruption of the gradient. Then harvest the gradient from top to bottom in 700 microliters fractions, using a one milliliter pipette.Resulting in 17 fractions, which provides a sufficient resolution. Next, perform two sequentially executed trichloroacetic acid precipitations by adding 200 microliters of 72%trichloroacetic acid to the individual fractions and mixing until the solution is homogeneous. Incubate the fractions for 30 minutes on ice and pellet the precipitated proteins by centrifuging at 20, 000 G and four degrees Celsius for 20 minutes.Discard the supernatant. Add 500 microliters of 28%trichloroacetic acid solution. Mix well and repeat the centrifugation step.Finally, analyze the fractions by SDS-PAGE and immunoblotting. The importance of mild sonication is presented here. The mitochondrial outer membrane marker Tom40 was enriched in the early low density fractions and was virtually absent in the later ones.The mitochondrial inner membrane marker Tim17 was concentrated in high density fractions. In contrast, the contact site protein Mic60 accumulated infractions of intermediate sucrose concentration, indicating the successful generation and subsequent separation of the various membrane vesicles. In contrast, with harsher sonication conditions, the mitochondrial outer membrane marker Tom40 could be detected in lower fractions of the gradient.Additionally, there was a significant amount of Tim17 infractions of intermediate density.