This work has been supported by NINDS, RO1NS52699 and MH84874 to SA. 
We would like to thank Dr. Dave Featherstone (Department of Biological Sciences, University for Illinois at Chicago) for providing us with the suture glue used in the immunohistochemistry work. We thank Michael Alpert for his comments and proofreading of the manuscript.

ポリ-D-リジン臭化水素酸塩の調製<ol><li> 0.1Mホウ酸緩衝液（pH8.5）で1 mg / mlのポリ-D-リジン臭化水素酸塩を準備します。 </li><li> -20℃で分注し店。 </li></ol>カバーガラスの2。ポリリシンコーティング注：層流チャンバー内のすべてのクリーニングおよびコーティングステップを実施する。 <ol><li> 2時間、1N塩酸（HCl）を含むペトリ皿にカバースリップを置きます。 </li><li>吸引し、すべてのHClおよび70％エタノール（エタノール）2〜3倍で洗い流して。 </li><li> 1時間70％エタノールにしておきます。 </li><li>吸引するすべての70％エタノール、100％エタノール2〜3倍でリンスすること。 </li><li> 2時間の100％EtOH中のままにしておきます。すべてのエタノールを吸引。 </li><li>数秒間濾紙空気乾燥で乾燥したブロット。 </li><li> 1 mg / mlのポリ - リジン溶液中の場所O / N。 </li><li>ミリポア水4-5x翌日カバーグラスをすすぐ。 </li><li>エアドライポリリジンは、クリーンシャーレにガラスローラーのカバースリップをコーティングした。 </li><li> immunohistochemistr用yは、35×10ミリメートルペトリ皿の蓋を使用します。 0.3センチメートルの厚さに皿に30°CO / Nに設定することができます：SYLGARDを準備（polydimethylsilioxane、PDMS）は、PDMS（1重量エラストマーを、エージェント10を硬化させること）に注ぐことによって料理を並んでいた。これが設定された後、PDMSにはめ込み1センチメートルによって2cmにカット。カバースリップのために上記と同様の手順に従ってポリリジンで清掃やコートのインセット。 </li><li>使用するまで層流室内に覆われた店舗ポリリジンコーティングしたカバーガラスや食器（2週間までが、3〜4日ごとに定期的に調製することにより、最良の接着剤の結果を得る）。 </li><li>振動組織スライサーで脊髄ピンに、PDMSブロックを準備します。 1重量：エラストマーAとエラストマーB 1を混ぜる。 100×15mmのペトリ皿に注ぎ、30℃でO / Nを設定することを可能にする。 PMDSの長方形の部分をカットし、エポキシ接着剤を使用して、スライスベース板に接着する。接着剤が所定の位置に、PDMSを固定設定することができ、フラットを取得するために表面から複数の薄い部分をスライス上の組織をピンするために表面。 </li></ol>ヤツメウナギ脊髄の3。急性解離は孤立網様体軸索を得た<ol><li>トリカインメタンスルホネート（; 100 mg / LのMS-222）とammoecoeteまたは成体ヤツメウナギ（Petromyzonマリナス ） を麻酔。犠牲にするヤツメウナギを含む、蓋で覆われたプラスチック製のカップに、水の中に麻酔薬を追加します。 </li><li>のCaCl 2、1.8 130のNaCl、2.1のKCl、2.6のMgCl 2、4、HEPES、4ブドウ糖液（pH7.6、浸透圧270 mOsmで）と本体を削除します（単位：mm）以下の組成の低温（4℃）リンゲル液でヤツメウナギを斬首壁の筋肉は、脊髄の背側表面を露出させる。 </li><li>細かい鉗子を用いて脊髄の後面から髄膜のプリミティバを削除します。この段階では腹側髄膜のプリミティバを削除しないでください。 </li><li> 1cmの長さの断片に脊髄を切断します。 </li><li> PDMSはベースナンプラーをスライス並んで、背側を上に向け、細かい虫ピンを使用して、脊髄片をピン氷のように冷たいリンゲル溶液を含む振動組織スライサー室のTE（2.12を参照）。 </li><li>解離プロセス図2aと図2b中にハンドルとして機能するように終わり頭側と尾側に無傷の背柱部を残して、ブレードで吻側-尾側軸に沿ってスライスして、脊髄の後柱の中央部分を削除します。スライスとその下の網様体、軸索損傷のない列図2bを残すのみ脊柱を除去し、深さの設定を可能にする最も遅い速度設定を使用してください。 </li><li>エルManira＆Bussièresから適応（リンゲル液に1 mg / mlのプロテ​​アーゼ（ストレプトマイセス·グリセウスからタイプXIV）および（クロストリジウムヒストリからタイプI-A）調製した1 mg / mlのコラゲナーゼのカクテルで45分間RTでスライスし、脊髄片をインキュベート、1997 17）。 </li><li> PDMS微細ピンを使用してピン酵素処理脊髄片をシャーレコンタライニングining冷（4℃）リンゲル液。 </li><li>細かい鉗子で腹髄膜のプリミティバを削除します。 </li><li>脊髄図2dに無傷の網様体の軸索の中央列を残してスライスした背側部分の中間に外科用メスの刃で脊髄の横管をカット。 </li><li>レンズにイマージョンオイルの滴を置きます。 </li><li>記録チャンバー図3のスロットにポリリジンコーティングしたカバーガラス（ 図3a、トップピース、赤い四角形）を配置し、シールを容易にするために、すべてのエッジ（ 図3aの赤と青の矩形間の空間に真空グリースを適用します。ネジ所定の位置にトップは、記録リグ上の挿入図にチャンバーを配置します。 </li><li>パスツールピペットを用いて記録チャンバにリンゲル液を加える。 </li><li>熱電冷却デバイスの入力チューブに不凍液を含む耐圧ビンの流出チューブを接続します。 OUTPを接続します外側冷却ジャケットの入力端とリザーバ図3bの出力端に熱電冷却素子のut個のチュービング。 </li><li>記録チャンバーで一度に脊髄の一枚を置き、静かに軸索が分離されるまで、 図2eおよび図2fはテフロンコーティングされた鉗子を用いてすべての回でカバーガラスに沿って、それを維持し、脊髄を分離する。 </li><li>記録チャンバー図3bの外側の冷却ジャケットを介して、熱電冷却装置を介して、（置換により）不凍液加圧（ボトル内に押し込まれる窒素ガス）を通過させることにより10°Cまで記録液温度をもたらす。 </li><li>軸索は10℃で1時間後に解離回復できるようにします。 </li></ol><img alt="図2" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51925/51925fig2highres.jpg" width="400" /> <strong&gt;図2網様体の軸索の分離のための解離プロトコルの概略説明。脊柱の（a）の除去。矢印は、組織のスライスの方向を示している。アルファベットのV（赤フォント色）による腹側角ながら背側ホーンは、アルファベットのD（赤フォントの色）でマークされています。（b）の後柱は網様体軸索（緑の線が露出脊髄の中央部分では削除）。スライス工程後に無傷のまま腹側角は、アルファベットV（赤のフォント色）によってマークされている。（c）のプロテアーゼおよびコラゲナーゼで45分間処理はカクテル（1mg / ml）を酵素。横管（d）の切断脊髄;位置、方向、横方向の切り込みの程度を示す。（e）の脊髄の機械的解離。矢印は、鉗子および解離時の剥離力の方向の位置を示す。（f）に Representati解離した網様体軸索準備の例をVEの。緑の矢印は、任意のシナプス後のプロセスなしに急性解離し網様体の軸索の領域をマークします。 <img alt="図3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51925/51925fig3highres.jpg" width="500" /> 電気生理学実験用のチャンバーを記録する図3の回路図。提供さ寸法はインチです。 （a）は basepiece図に示されている赤い長方形がbasepieceにおけるカバースリップの溝にカバースリップの位置を示している。高真空グリースを適用した場合の（a）basepiece図に示す赤と青の長方形の間の領域であり、（b）は、組み立てられた記録チャンバーを示している。 FM 1-43と4。標識およびシナプス前終末の同定<ol><li> VへのFM 1-43を組み込むことによって、シナプス前終末にラベルを付ける高K +脱分極時にシナプスエキソサイトーシスの間にesicles。 （30 mMのKClを含む5ミリリットルリンゲル溶液中）、5μMのFM 1-43と準備を灌流。 </li><li> 1 mg / mlのAdvasep-7（5ミリリットルリンゲル溶液中で）過剰FM色素を除去する）18を有する調製物を灌流。 </li><li>どんなremant染料とAdvasepをウォッシュアウトするための15分間のリンゲル液で準備を灌流。 </li><li>デジタルCCDカメラおよび画像取得ソフトウェア细と組み合わせて倒立蛍光顕微鏡上で100×の油浸レンズ（NA 1.25）を有する画像、標準的な蛍光イメージングプロトコルを使用して。 </li><li> 図4c及び図4dを記録するために標的とするように、蛍光標識されたシナプス前終末を特定します。 </li></ol>孤立網様体軸索の5。免疫組織化学<ol><li>二価イオン（カルシウム2 +およびMg 2 +）を無料でディッシュインセット（プロトコルセクション2.10。）フィルリンゲル液。 </li><li> P-87マイクロピペットプラーでパッチピペットを作製。 （シリコーンチューブを0.89ミリメートル吸引端に取り付けられたマイクロピペットチップと内径を用いて）パッチピペット（外径1.5mmのガラス）と吸引を使用して、ポリリジンインセットの一方の端部に縫合糸少量の接着剤を配置する。 </li><li>プロトコルセクションで3 図2のように同じ手順を使用して解離を行ってください。やさしく表面に強く接着させる鉗子で縫合糸糊とプレスで脊髄の一方の端を置きます。インセットのもう一方の端に縫合糸接着剤の別のドロップを置き、静かに軸索が解離されるまで、脊髄を伸ばし、縫合のりの上に静かにドラッグすることで自由な脊髄端を接着する。穏やかに鉗子で押し下げて所定の位置に固定してください。 </li><li>為替価は、灌流による定期的なリンゲル液でリンゲル液を解放する。 </li><li>軸索は20分後にdissoc回復することを許可する10℃でiation。 </li><li> 4％パラホルムアルデヒド（PFA）中で解離軸索を修正20分間{リン酸緩衝生理食塩水（PBS、（mM）の塩化ナトリウム137、塩化カリウム2.7のNa 2 HPO 4 10 KH 2 PO 4 1.8、pH7.4）中で調製した}。 0.2μMのシリンジフィルターを通過することによって使用前にPFA溶液を濾過する。 </li><li> 10分間（PBS中）0.1Mグリシンを灌流することにより、PFAを洗浄する。 </li><li> 10分間（PBS中）0.1％トリトン-Xでインキュベートする。 </li><li> 20分間、PBSを灌流することによって洗浄する。 </li><li> 4℃で6時間（PBS中）を5％無脂肪乳でブロックする。 </li><li>興味のあるVGCCに一次抗体で[追加（PBS中1：200希釈）と4℃で20時間インキュベートする。 </li><li> 20分間、PBSを灌流することによって洗浄する。 </li><li> 4℃で10分間（PBS中）の5％無脂肪乳でブロックする。 </li><li>二次抗体で[追加（PBS中1：400希釈）と4℃で2時間、暗所でインキュベートする。 </li><li> 20分間PBSで灌流により洗浄する。 </li><li> 1％ウシ血清Albuでブロック20分間分（PBS中）。 </li><li>アレクサフルオロ488ファロイジン（5単位/μlの作業濃度を、メタノール200単位/ mlの準備の株式）を追加します。 </li><li> 20分間PBSで灌流により洗浄する。 </li><li>共焦点顕微鏡で100倍の水浸レンズを用いた画像。 </li></ol> 6。電気生理学的記録<ol><li> P-87マイクロピペットプラーでアルミノシリケートガラスパッチピペット（ピペット抵抗2-5MΩ）を作製。ピペットチップ全体シナプス前終末径を包含するように、設計上のパッチピペット。 </li><li> PDMS 23に50〜60 psiの圧力下でパッチピペットを浸漬することによってPDMS被覆パッチピペット（パッチピペットのバックエンドへの窒素ガスシリンダに接続された内径を、シリコンチューブを取り付け0.89ミリメートル）および熱を使用して乾燥させる銃。代わりに、手動で複合顕微鏡の下で可能な限り先端に近いコーティングを適用したPDMSでコーティングピペット、。 </li><li> MICRを使って火ポリッシュパッチピペットoforge（複合顕微鏡のステージに取り付けた特注のプラチナフィラメント）。 </li><li>蛍光顕微鏡でラベルされたシナプス前終末を示す孤立軸索を識別します。 </li><li>記録液を充填します。注射器を使用したパッチピペットに（CA 2 +電流を分離するために設計された電荷キャリアとして10mMのCaCl 2または90 mMののBaCl 2を 、HEPESは、pH 7.6、浸透圧270 mOsmでバッファリング）。 </li><li>電動マニピュレータMP225を使用して、お風呂の上にピペットホルダーとの位置にパッチピペットを挿入します。静かに、蛍光識別されたシナプス前末端の顔に対してバス、所定の位置にパッチピペットを下げる。 </li><li>接触が膜で行われるまで、ゆっくりとパッチピペットを進める。この時点で、ピペットホルダに取り付けられたチューブを介して穏やか口吸引によりギガオームのシールを達成する。 </li><li> Aを使用する、単一チャンネルのCa 2 +電流を記録するのに必要な極めて低いバックグラウンドノイズレベルを達成するために録音のために冷却ヘッドステージとxopatch 200B。 5kHzのベッセルフィルタを用いて、20〜50 kHzとフィルタのサンプルデータ。 Axograph Xを使用してデータ収集を行う</li><li>刺激としては10mV刻みで、標準的な段階プロトコルを使用してください。のCa 2 +チャネルの最大活性化を確実にするために、段階プロトコルの前に、プロトコルにプレパルスを組み込む。リーク電流の分析後の減算ステッププロトコルに10 mVのリークステップを組み込む。 </li></ol>

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The authors do not have any competing financial interests or other conflicts of interest to disclose.

当社の解離プロトコルは、シナプス後突起図2fの欠い孤立網様体の軸索を生じすることによって重要であるが、それでも機能的なシナプス前終末の図4c及び図4dに保持している。シナプス前終末に反対するシナプス後のプロセスが存在しないことは、以前に、中枢シナプスの可能性に成功のみ2腎杯型シナプス前終末に達していない単一のシ​​ナプス前終...

シナプス伝達は非常に迅速で正確なプロセスである。シナプス前終末の活動電位侵入は、シナプス前カルシウム結果として生じる増加、レリーズ顔膜に位置VGCCsの開口部につながる2 +小胞融合および神経伝達物質の放出1のトリガとして機能する。これらのステップのすべてがマイクロ秒2、数百内で発生するため、小胞融合機構3にVGCCsの緊密な空間結合を必要とします。シナプス前のCa 2 +フラックスは、主にカルシウム2 +感受性色素4を用いてアプローチ撮影により特徴付けられている。シナプス前ニューロン中のCa 2 +を調節組み込むのCa 2 +緩衝液は、間接的に、シナプス前カルシウムおよび神経伝達3との間の関係を特徴付けるために使用されている。また、カルシウム2 + 5アンケージングまたはmacroscopiを記録することにより、シナプス前遊離Ca 2 +濃度を調節することのCa 2 + cの電流は小胞融合および/ ​​または放出の尺度と組み合わせて使用されている;そのような静電容量測定6または後シナプス応答と同じ問題に対処するために2。しかし、カルシウムを直接解放面で2 +電流、膜の脱分極は、シナプス小胞融合及び神経伝達物質の放出をトリガするのCa 2 +電流に変換されるシナプス前膜の特殊なセクションを特徴付ける、カルシウムの正確な測定値を得るために不可欠な2+シナプス小胞の融合のための要件。また、直接小胞融合および放出の正確な同時測定と相まって個体シナプス前終末でのCa 2 +電流を特徴付ける能力は、活動電位、シナプス前のCa 2 +電流の時間的経過の間のタイミング関係の正確な解明を可能にし、小胞融合および放出。リリース面膜へのアクセスシナプス後樹状突起により並置を閉じるによるシナプス前末端の大部分では使用できません。それは個人のシナプス前終末での電流を直接測定を防ぐため、このアクセ​​ス不能にVGCCsの特性評価における主要な障害となっている。個別のシナプス前終末におけるシナプス前のCa 2 +電流の直接の特徴付けは、これまで中枢シナプスでは不可能であった2つだけ腎杯型シナプス前終末に達成された。ニワトリ毛様体神経節7-10およびラット腎杯11,12の萼型シナプス。ヤツメウナギの脊髄13内の巨大な網様体シナプスを含む他のすべてのシナプス前終末では、シナプス前のリリースの顔膜へのアクセスの欠如は、シナプス前のCa 2 +フラックスを研究するために、例えばCa 2 +イメージングなどの間接的なアプローチの使用を必要としている。 <img alt="図1" f○：コンテンツ幅= &quot;5インチ&quot; SRC = &quot;/ファイル/ ftp_upload / 51925 / 51925fig1highres.jpg&quot;幅= &quot;500&quot; /&gt; 図1：ヤツメウナギ巨人網様体シナプス。（a）はヤツメウナギの脊髄の断面は背腹方向を示す。網様体軸索は緑のアスタリスクでマークされます。シナプス後ニューロン13の上に（緑色の矢印で示される）シナプス前網様体軸索パッサン接点EN数多くのことを示すヤツメウナギの脊髄における網様体シナプスの（b）の 3次元復元。シナプス後ニューロンがアレクサフルオロ568ヒドラジド（赤）で満たされているが、シナプス前終末には、アレクサフルオロ488ヒドラジド結合ファロイジン（緑色）で標識されている。 吻側-尾側軸を図1aに脊髄並列の腹側領域に位置ヤツメウナギ巨大な網様体軸索、ニューロン上にパッサンシナプスの連絡先専用のフォームに複数の脊髄前角14 図1bは 13。巨視的全細胞のCa 2 +電流は、無傷の脊髄13,15に網様体軸索から記録されています。しかし、Caを直接測定で前回のブラインドの試みは、細胞結合型パッチクランプ法を用いて、無傷のヤツメウナギの脊髄における網様体軸索内2 +電流が原因の対向シナプス後のプロセスによるシナプス前のリリースの顔膜へのアクセスの欠如に13失敗したことが証明されている図1b。レリーズ顔膜は以前に、シナプスの機械的摂動前に12を記録するか、機械的解離16と連結酵素処理にシナプス後ニューロン11を除去することによってアクセス可能とされています。脊髄の複雑な組織を考慮すると、シナプス後ニューロンを識別し、機械的にそれを撤回または番目を撹乱することは極めて困難で証明する電子シナプス。したがって、私たちは機械的解離に続いて酵素処理17を使用することにしました。 このアプローチを使用して、私たちはそれによって個人のシナプス前終末への無制限のアクセスを提供し、あらゆるシナプス後のプロセスを欠いた機能的なシナプス前終末で実行可能な孤立網様体の軸索が得ヤツメウナギの脊髄の急性解離準備を開発しました。標準の倒立顕微鏡と蛍光画像と一緒に、それが細胞-を使用して記録するためのCa 2 +電流は図4c及び図4dに分離する記録液を含んだパッチピペットを用いて、同定および個別の蛍光同定シナプス前終末を標的にすることを可能添付の電圧クランプ法。のCa 2 +電流は、個別のシナプス前終末図4fのシナプス前のリリース面膜に直接記録されている。これはsignificaですそれは中枢シナプスで実施された最初のこのような記録であるので、シナプス伝達の分野では画期的なヌクレオチド。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="713">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:211px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td style="width:211px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">SLGV004SL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">22x60 mm coverslips</td>
			<td style="width:211px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">12545J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Advasep-7</td>
			<td style="width:211px;">Cydex Pharmaceuticals</td>
			<td style="width:119px;">ADV7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td style="width:211px;">Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Alexa-633 conjugated goat anti-rabbit secondary antibody</td>
			<td style="width:211px;">Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">A21070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Antifreeze</td>
			<td style="width:211px;">Prestone</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Boric acid</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B7660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Bright field light source</td>
			<td style="width:211px;">Dolan-Jenner</td>
			<td style="width:119px;">Fiberlite 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Calcium chloride</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Collagenase Type IA from Cloristridium histolyticum</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C9891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Cover slip</td>
			<td style="width:211px;">Fisher-Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-545-J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Dextrose</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D9559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Digital CCD Camera</td>
			<td style="width:211px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:119px;">C8484-03G01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Dissection fine forceps</td>
			<td style="width:211px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Dissection forceps</td>
			<td style="width:211px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Dissection microscope</td>
			<td style="width:211px;">Leica Biosystems</td>
			<td style="width:119px;">Leica MZ 12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Dissection scissors</td>
			<td style="width:211px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">15025-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Dissection scissors fine</td>
			<td style="width:211px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">91500-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Dissection scissors ultra fine</td>
			<td style="width:211px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">FM 1-43</td>
			<td style="width:211px;">Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">T3163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Glycine</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H7523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">High vacuum grease</td>
			<td style="width:211px;">Dow-Corning</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:211px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">SA-56-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Immersion oil</td>
			<td style="width:211px;">Fisher-Scientific</td>
			<td style="width:119px;">M2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Industrial grade Nitrogen gas tank</td>
			<td style="width:211px;">Praxair</td>
			<td style="width:119px;">UN1066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Insect pins</td>
			<td style="width:211px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">26002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:216px;">Liquid suture glue</td>
			<td>Braun Veterinary Cair Division</td>
			<td style="width:119px;">8V0305</td>
			<td>The suture glue we used in our experiments was provided to us by another lab. It is no longer manufactured. We have sourced a Histoacryl Suture Glue for future use from Aesculap (Ts1050071FP)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Methanol</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">154903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Non-fat dry milk</td>
			<td style="width:211px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:119px;">9999S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">P-87 Micropipette puller</td>
			<td style="width:211px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Perfusion pump</td>
			<td style="width:211px;">Cole-Palmer</td>
			<td style="width:119px;">Masterflex C/L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Petri dish 100x15 mm</td>
			<td style="width:211px;">Fisher-Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Petri dish 35x10 mm</td>
			<td style="width:211px;">Fisher-scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P1024</td>
			<td>MW &#62; 300000</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P5379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Primary antibodiesR-type calcium channel</td>
			<td style="width:211px;">Alomone Labs</td>
			<td style="width:119px;">ACC-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Protease Type XIV from Streptomyces griseus</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P5147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Scalpel blades</td>
			<td style="width:211px;">World Precision Instruments&#160;</td>
			<td align="right" style="width:119px;">500240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Schot Duran Preesure Bottle</td>
			<td style="width:211px;">Fisher-Scientific</td>
			<td style="width:119px;">09-841-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Silicone tubing for glue application</td>
			<td style="width:211px;">Cole-Palmer</td>
			<td>07625-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Slicing base plate</td>
			<td style="width:211px;">Leica Biosystems</td>
			<td align="right" style="width:119px;">14046327404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">Slicing chamber</td>
			<td style="width:211px;">Leica Biosystems</td>
			<td align="right">1.4046E+10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:211px;"></td>
			<td style="width:119px;">S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S9763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Sodium tetraborate</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B3545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Sylgard 160 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td style="width:211px;">Dow Corning&#160;</td>
			<td style="width:119px;">SYLGARD&#174; 160</td>
			<td>To prepare, mix elastomer A and elastomer B 10:1 by weight</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td style="width:211px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:119px;">SYLGARD&#174; 184&#160;</td>
			<td>To prepare, mix elastomer and curing agent 10:1 by weight</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Teflon coated forceps</td>
			<td style="width:211px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11626-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tricaine methanesulphonate</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Vibratome blades</td>
			<td style="width:211px;">World Precision Instruments&#160;</td>
			<td style="width:119px;">BLADES</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Xenon lamp</td>
			<td style="width:211px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

acute dissociation of lamprey reticulospinal axons to enable recording from the release face membrane of individual functional presynaptic terminals

シナプス伝達は非常に迅速なプロセスである。シナプス前末端へのCa 2 +の流入を駆動する活動電位は、リリースの顔膜に位置する電位依存性カルシウムチャネル（VGCCs）を介して、小胞融合及び神経伝達物質の放出のためのトリガーである。シナプス伝達の迅速性に不可欠な活動電位、VGCCsの到着と、神経伝達物質放出機構との間の空間的および時間的な同期性がある。直接個別のシナプス前終末の放出面膜からのCa 2 +電流を記録する機能は、シナプス前のCa 2 +および神経伝達物質放出の間の関係を正確に理解するために不可欠である。電気生理学的記録のためのシナプス前のリリースの顔膜へのアクセスは、ほとんどの準備とシナプス前カルシウムでは使用できません2+エントリはイメージング技術と巨視的現在measuremeを使用して特徴付けられているNTS - CA 2 +エントリーを視覚化するのに十分な時間分解能を持っていない技術。直接単シナプス前終末でのVGCCsの特徴付けは中枢シナプスでは不可能であったため、これまで成功した唯一のニワトリ毛様体神経節の萼型シナプスにおいて、ラットの腎杯に達成されている。私たちは、成功したシナプス後構造を欠いた機能的なシナプス前終末の孤立網様体軸索をもたらす脊髄の急性解離準備を開発することにより、ヤツメウナギの脊髄の巨大な網様体シナプスでこの問題に対処してきた。私たちは、蛍光標識し、個別のシナプス前終末を識別し、記録のためにそれらをターゲットにすることができます。この調製物を用いて、免疫組織化学および電気生理学的手法を用いて個別のシナプス前終末の放出面に直接VGCCsを特徴としている。のCa 2 +電流は、リリースの顔膜Oに直接記録されていますfは個別のシナプス前終末、中枢シナプスで実施された最初のこのような記録。

<html>この解離プロトコル利回り健康的で機能的な孤立網様体シナプス後突起図2fの欠いた軸索が、それにもかかわらず、誘発シナプス小胞のエキソサイトーシスおよび図4cと図4d可能な官能シナプス前終末を保持している。網様体軸索の隔離領域の切片は、明らかに網様体軸索膜図2fにへの無制限のアクセスを可能にする任意の他の神経のプロセスを明確?...

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Acute Dissociation of Lamprey Reticulospinal Axons to Enable Recording from the Release Face Membrane of Individual Functional Presynaptic Terminals

Recording Ca2+ currents at the presynaptic release face membrane is key to a precise understanding of Ca2+ entry and neurotransmitter release. We present an acute dissociation of the lamprey spinal cord that yields functional isolated reticulospinal axons, permitting recording directly from the release face membrane of individual presynaptic terminals.

ヤツメウナギ網様体軸索の急性解離は、個別の機能シナプス前終末のリリース顔膜から録音を有効にする方法

Synaptic transmission is an extremely rapid process. Action potential driven influx of Ca2+&#160;into the presynaptic terminal, through voltage-gated ...

acute-dissociation-lamprey-reticulospinal-axons-to-enable-recording

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.7K ビュー.  University of Illinois at Chicago. Recording Ca2+ currents at the presynaptic release face membrane is key to a precise understanding of Ca2+ entry and neurotransmitter release. We present an acute dissociation of the lamprey spinal cord that yields functional isolated reticulospinal axons, permitting recording directly from the release face membrane of individual presynaptic terminals. 

ビデオ: Acute Dissociation of Lamprey Reticulospinal Axons to Enable Recording from the Release Face Membrane of Individual Functional Presynaptic Terminals

The Subventricular Zone En-face: Wholemount Staining and Ependymal Flow

The walls of the lateral ventricles contain the largest germinal region in the adult mammalian brain. The subventricular zone (SVZ) in these walls is an extensively studied model system for understanding the behavior of neural stem cells and the regulation of adult neurogenesis. Traditionally, these studies have relied on classical sectioning techniques for histological analysis. Here we present an alternative approach, the wholemount technique, which provides a comprehensive, en-face view of this germinal region. Compared to sections, wholemounts preserve the complete cytoarchitecture and cellular relationships within the SVZ. This approach has recently revealed that the adult neural stem cells, or type B1 cells, are part of a mixed neuroepithelium with differentiated ependymal cells lining the lateral ventricles. In addition, this approach has been used to study the planar polarization of ependymal cells and the cerebrospinal fluid flow they generate in the ventricle. With recent evidence that adult neural stem cells are a heterogeneous population that is regionally specified, the wholemount approach will likely be an essential tool for understanding the organization and parcellation of this stem cell niche.

The lateral ventricle walls contain the largest germinal region in the adult mammalian brain. Traditionally, studies on neurogenesis in this region have relied on classical sectioning techniques for histological analysis. Here we present an alternative approach, the wholemount technique, which provides a comprehensive, en-face view of this germinal region.

脳室下帯恩顔：Wholemount染色と上衣の流れ

The walls of the lateral ventricles contain the largest germinal region in the adult mammalian brain. The subventricular zone (SVZ) in these walls is an ...

神経科学

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

シナプス伝達とイメージシナプス前終末を研究するために齧歯類の脳スライスからの神経細胞のVibrodissociation

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding how the brain works. The primary function of any nerve cell is to process electrical signals, usually from multiple sources. Electrical properties of neuronal processes are extraordinarily complex, dynamic, and, in the general case, impossible to predict in the absence of detailed measurements. To obtain such a measurement one would, ideally, like to be able to monitor, at multiple sites, subthreshold events as they travel from the sites of origin on neuronal processes and summate at particular locations to influence action potential initiation. This goal has not been achieved in any neuron due to technical limitations of measurements that employ electrodes. To overcome this drawback, it is highly desirable to complement the patch-electrode approach with imaging techniques that permit extensive parallel recordings from all parts of a neuron. Here, we describe such a technique - optical recording of membrane potential transients with organic voltage-sensitive dyes (Vm-imaging) - characterized by sub-millisecond and sub-micrometer resolution. Our method is based on pioneering work on voltage-sensitive molecular probes 2. Many aspects of the initial technology have been continuously improved over several decades 3, 5, 11. Additionally, previous work documented two essential characteristics of Vm-imaging. Firstly, fluorescence signals are linearly proportional to membrane potential over the entire physiological range (-100 mV to +100 mV; 10, 14, 16). Secondly, loading neurons with the voltage-sensitive dye used here (JPW 3028) does not have detectable pharmacological effects. The recorded broadening of the spike during dye loading is completely reversible 4, 7. Additionally, experimental evidence shows that it is possible to obtain a significant number (up to hundreds) of recordings prior to any detectable phototoxic effects 4, 6, 12, 13. At present, we take advantage of the superb brightness and stability of a laser light source at near-optimal wavelength to maximize the sensitivity of the Vm-imaging technique. The current sensitivity permits multiple site optical recordings of Vm transients from all parts of a neuron, including axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines. The acquired information on signal interactions can be analyzed quantitatively as well as directly visualized in the form of a movie.

An imaging technique for monitoring of membrane potential changes with sub-micrometer spatial and sub-millisecond temporal resolution is described. The technique, based on laser excitation of voltage-sensitive dyes, allows measurements of signals in axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines.

軸索、樹状突起および脳スライスにおける個々のニューロンの樹状突起棘から電位感受性色素記録

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to understand the mechanism that promotes neuronal regeneration, an in-depth analysis of the neuronal types that can remodel after injury is needed. Several studies showed that damaged climbing fibers are capable of regrowing also in adult animals1,2. The investigation of the time-lapse dynamics of degeneration and regeneration of these axons within their complex environment can be performed by time-lapse two-photon fluorescence (TPF) imaging in vivo3,4. This technique is here combined with laser surgery, which proved to be a highly selective tool to disrupt fluorescent structures in the intact mouse cortex5-9.
This protocol describes how to perform TPF time-lapse imaging and laser nanosurgery of single axonal branches in the cerebellum in vivo. Olivocerebellar neurons are labeled by anterograde tracing with a dextran-conjugated dye and then monitored by TPF imaging through a cranial window. The terminal portion of their axons are then dissected by irradiation with a Ti:Sapphire laser at high power. The degeneration and potential regrowth of the damaged neuron are monitored by TPF in vivo imaging during the days following the injury.

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Two-photon imaging, coupled to laser nanodissection, are useful tools to study degenerative and regenerative processes in the central nervous system with subcellular resolution. This protocol shows how to label, image, and dissect single climbing fibers in the cerebellar cortex in vivo.

小脳軸索のレーザーNanosurgery<em&gt;インビボ</em

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to ...

Measuring Spinal Presynaptic Inhibition in Mice By Dorsal Root Potential Recording In Vivo

Presynaptic inhibition is one of the most powerful inhibitory mechanisms in the spinal cord. The underlying physiological mechanism is a depolarization of primary afferent fibers mediated by GABAergic axo-axonal synapses (primary afferent depolarization). The strength of primary afferent depolarization can be measured by recording of volume-conducted potentials at the dorsal root (dorsal root potentials, DRP). Pathological changes of presynaptic inhibition are crucial in the abnormal central processing of certain pain conditions and in some disorders of motor hyperexcitability. Here, we describe a method of recording DRP in vivo in mice. The preparation of spinal cord dorsal roots in the anesthetized animal and the recording procedure using suction electrodes are explained. This method allows measuring GABAergic DRP and thereby estimating spinal presynaptic inhibition in the living mouse. In combination with transgenic mouse models, DRP recording may serve as a powerful tool to investigate disease-associated spinal pathophysiology. In vivo recording has several advantages compared to ex vivo isolated spinal cord preparations, e.g. the possibility of simultaneous recording or manipulation of supraspinal networks and induction of DRP by stimulation of peripheral nerves.

Measuring Spinal Presynaptic Inhibition in Mice By Dorsal Root Potential Recording In Vivo

GABAergic presynaptic inhibition is a powerful inhibitory mechanism in the spinal cord important for motor and sensory signal integration in spinal cord networks. Underlying primary afferent depolarization can be measured by recording of dorsal root potentials (DRP). Here we demonstrate a method of in vivo recording of DRP in mice.

後根潜在的記録によりマウスにおける脊髄シナプス前抑制を測定する<em&gt;インビボ</em

Presynaptic inhibition is one of the most powerful inhibitory mechanisms in the spinal cord. The underlying physiological mechanism is a depolarization of ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to blindness in many retinal diseases. Calcium (Ca2+), a key second messenger in photoreceptor signaling and metabolism, has been proposed to be indirectly linked with photoreceptor degeneration in various animal models. Systematically studying these aspects of cone physiology and pathophysiology has been hampered by the difficulties of electrically recording from these small cells, in particular in the mouse where the retina is dominated by rod photoreceptors. To circumvent this issue, we established a two-photon Ca2+ imaging protocol using a transgenic mouse line that expresses the genetically encoded Ca2+ biosensor TN-XL exclusively in cones and can be crossbred with mouse models for photoreceptor degeneration. The protocol described here involves preparing vertical sections (&#8220;slices&#8221;) of retinas from mice and optical imaging of light stimulus-evoked changes in cone Ca2+ level. The protocol also allows &#8220;in-slice measurement&#8221; of absolute Ca2+ concentrations; as the recordings can be followed by calibration. This protocol enables studies into functional cone properties and is expected to contribute to the understanding of cone Ca2+ signaling as well as the potential involvement of Ca2+ in photoreceptor death and retinal degeneration.

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

We describe a protocol to monitor Ca2+ dynamics in the axon terminals of cone photoreceptors using an ex-vivo&#160;slice preparation of the mouse retina. This protocol allows comprehensive studies of cone Ca2+ signaling in an important mammalian model system, the mouse.

イメージングカルシウム<sup&gt; 2+</supマウス網膜の光受容コーン軸索末端で&gt;ダイナミクス

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) is an important mechanism for neuromodulation by acetylcholine (ACh). The difficulty with access to probing the signaling mechanisms within intact axons and at nerve terminals both in vitro and in vivo has limited progress in the study of the pre-synaptic components of synaptic plasticity. Here we introduce a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal (vHipp)&#8211;accumbens (nAcc) circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze both the pre- and post-synaptic components of transmission while selectively varying the genetic profile of the pre- vs post-synaptic neurons. We demonstrate that projections from vHipp microslices, as pre-synaptic axonal input, form multiple, reliable glutamatergic synapses with post-synaptic targets, the dispersed neurons from nAcc. The pre-synaptic localization of various subtypes of nAChRs are detected and the pre-synaptic nicotinic signaling mediated synaptic transmission are monitored by concurrent electrophysiological recording and live cell imaging. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of glutamatergic synaptic plasticity in vitro.

We developed a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal &#8211; accumbens circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze presynaptic mechanisms of nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) mediated synaptic transmission. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of synaptic plasticity.

ニコチン誘導性カルシウムシグナリングおよび腹側海馬軸索に沿って神経伝達物質放出のライブイメージング

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

少量循環、血流 - と水没型チャンバー システムで管理急性海馬スライスにおけるシナプス可塑性を記録

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. Single-molecule imaging is gaining momentum as it provides exceptional access to the visualization of individual molecules in living cells. Here, we describe a technique that we developed to perform single-particle tracking photo-activated localization microscopy (sptPALM) in Drosophila larvae. Synaptic communication relies on key presynaptic proteins that act by docking, priming, and promoting the fusion of neurotransmitter-containing vesicles with the plasma membrane. A range of protein-protein and protein-lipid interactions tightly regulates these processes and the presynaptic proteins therefore exhibit changes in mobility associated with each of these key events. Investigating how mobility of these proteins correlates with their physiological function in an intact live animal is essential to understanding their precise mechanism of action. Extracting protein mobility with high resolution in vivo requires overcoming limitations such as optical transparency, accessibility, and penetration depth. We describe how photoconvertible fluorescent proteins tagged to the presynaptic protein Syntaxin-1A can be visualized via slight oblique illumination and tracked at the motor nerve terminal or along the motor neuron axon of the third instar Drosophila larva.

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

Here we illustrate how single molecule photo-activated localization microscopy can be carried out on the motor nerve terminal of a live Drosophila melanogaster third instar larva.

生体内で1 分子追跡ショウジョウバエ運動神経がシナプス前ターミナルで

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. ...

Single Synapse Indicators of Glutamate Release and Uptake in Acute Brain Slices from Normal and Huntington Mice

Synapses are highly compartmentalized functional units that operate independently on each other. In Huntington&#39;s disease (HD) and other neurodegenerative disorders, this independence might be compromised due to insufficient glutamate clearance and the resulting spill-in and spill-out effects. Altered astrocytic coverage of the presynaptic terminals and/or dendritic spines as well as a reduced size of glutamate transporter clusters at glutamate release sites have been implicated in the pathogenesis of diseases resulting in symptoms of dys-/hyperkinesia. However, the mechanisms leading to the dysfunction of glutamatergic synapses in HD are not well understood. Improving and applying synapse imaging we have obtained data shedding new light on the mechanisms impeding the initiation of movements. Here, we describe the principle elements of a relatively inexpensive approach to achieve single synapse resolution by using the new genetically encoded ultrafast glutamate sensor iGluu, wide-field optics, a scientific CMOS (sCMOS) camera, a 473 nm laser and a laser positioning system to evaluate the state of corticostriatal synapses in acute slices from age appropriate healthy or diseased mice. Glutamate transients were constructed from single or multiple pixels to obtain estimates of i) glutamate release based on the maximal elevation of the glutamate concentration [Glu] next to the active zone and ii) glutamate uptake as reflected in the time constant of decay (TauD) of the perisynaptic [Glu]. Differences in the resting bouton size and contrasting patterns of short-term plasticity served as criteria for the identification of corticostriatal terminals as belonging to the intratelencephalic (IT) or the pyramidal tract (PT) pathway. Using these methods, we discovered that in symptomatic HD mice ~40% of PT-type corticostriatal synapses exhibited insufficient glutamate clearance, suggesting that these synapses might be at risk to excitotoxic damage. The results underline the usefulness of TauD as a biomarker of dysfunctional synapses in Huntington mice with a hypokinetic phenotype.

We present a protocol to evaluate the balance between glutamate release and clearance at single corticostriatal glutamatergic synapses in acute slices from adult mice. This protocol uses the fluorescent sensor iGluu for glutamate detection, a sCMOS camera for signal acquisition and a device for focal laser illumination.