Name: patch clamp recordings on intact dorsal root ganglia from adult rats
Uploaded: 2016-09-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Patch Clamp Recordings on Intact Dorsal Root Ganglia from Adult Rats at JoVE.com

The authors would like to acknowledge the Painless Research Foundation for support of the work. This work was also supported by the NIH grants R01 NS080921-01 and R21 NS079897-01A1.

倫理声明：実験動物のメンテナンスと使用のためのすべての手順は、動物実験にUCSF委員会の規制に適合し、動物使用とケアにNIH規制のガイドラインに従って実施した（文献85から23まで、1996年改訂）。 UCSF制度動物実験委員会は、この研究で使用されるプロトコルを承認しました。 楽器、ソリューションおよび料理の作製<ol><li>人工脳脊髄液（aCSFの）を準備します。 <ol><li> （溶液調製については表1および2参照 ）10倍低いカチオン溶液500ml、及び10倍重炭酸塩溶液500mlを調製します。 4 O Cで保存し、1ヶ月以内に使用します。 </li><li>重炭酸塩溶液60mlで10倍低いカチオン溶液の60ミリリットルを混合することによって、新鮮なaCSFのの600ミリリットルを準備し、その後、600ミリリットルの最終容量に到達するための脱イオン水480ミリリットルを追加します。バブルaCSFのカーボゲンと使用前に少なくとも10分間（5％O 2及び95％CO 2）。 </li></ol></li><li>キャピラリーガラスからパッチピペットを引き出します。 <ol><li>記録ピペットを準備するために、ピペットプラーに薄壁キャピラリーガラスを置きます。 注意：私たちの研究室では、プーラーの次の設定パラメータは、理想的なピペット形状を達成するために使用されている：熱（510）、速度（32）。無傷のDRGの記録のための理想的なピペット形状が低い円錐角を有する緩やかな細いテーパを有するべきであり、これは最高の試行錯誤することによって達成することができます。 </li><li>内部ソリューション（解決策の準備のため、表3を参照）を充填したときのピペットの抵抗は3-5MΩであることを確認してください。ピペット抵抗18を測定する具体的な方法のための軸索ガイドを参照してください。 </li></ol></li><li> 13単位/ mlの最終濃度を与えるために、aCSFの400μlにコラゲナーゼの1ミリグラムを追加します。その後、コラゲナーゼ溶液の約20μlの各ガラスピペットを埋めます。格納-20°Cの冷凍庫で満たされたピペットと3週間以内にそれらを使用しています。 </li><li>冷たいaCSFの（約4 Oの C）の200ミリリットルを準備します。それが凍結し始めるまで迅速にaCSFを冷却ビーカーにそれを配置するには、約20分間、-20°Cの冷凍庫にプラスチックラップと場所で密封します。 10分間、カルボゲンで氷浴やバブルにビーカーを置きます。バブルRTでカーボゲンとaCSFの残りの400ミリリットル。 </li><li> aCSFの、冷却されている間、5mmの直径の開口部（これはDRGを転送するために使用される）を拡大するためにプラスチック製の使い捨てのトランスファーピペットの端部を切断します。次の手術器具を収集：メス（＃15）、メイヨーは、直線と曲線はさみ、罰金2ミリメートルの先端骨鉗子、Adson（歯付き）鉗子、アイリスはさみ、春のはさみと2細かい鉗子。 3ガラスペトリ皿（さ：10 cm外径）に酸素冷たいaCSFのを注ぎます。 </li></ol> 2. DRG解剖<ol><li>ナトリウムPEでラット（200〜220グラム）を麻酔ntobarbitalた（100mg / kg、腹腔内）麻酔のレベルがペダル反射し、目の瞬目反射をテストして適切であることを確認してください。 </li><li>ラットを麻酔されていることを確認した後、腰部を剃ると正中線に沿って皮膚や皮下組織を切開。細かい骨膜エレベーターを使用して、L1-S2レベルで棘突起から傍脊柱の筋肉を切り離します。 </li><li> S2にL1から棘突起をカットする湾曲したハサミを使用してください。 2-3分間（ステップ1.5で調製した）露出した脊柱で約L1とS1における横カットを行い、 一括脊柱のこのセグメントを削除し、すぐに冷たいaCSFの中にそれを沈めるためにまっすぐマヨはさみを使用してください。ラットは深いペントバルビタール麻酔下にある間に腰椎のDRGを除去した後、安楽死は、二国間の開胸術によって行われます。 </li><li>削除された脊柱と付着した組織から血液をオフにフラッシュし、冷たいaCSFのペトリ皿に移します。 U薄層を除去するための細かい骨鉗子をSE。脊髄を露出させるためにmicroscissorsで正中線に沿って硬膜をカット。静かに脊髄を持ち上げ、虹彩のはさみを使用して、脊髄にそのエントリポイントで神経根をカットし、脊髄を除去します。 </li><li>冷たいaCSFので充填された第2のペトリ皿にDRGを持つ残りの椎骨を転送します。横突起と坐骨神経への相対的な位置に基づいて、L4とL5のDRGを特定します。 注：無傷の坐骨神経を維持することは、L4とL5 DRG（坐骨神経がL4-6脊髄神経に由来する）を識別するのに役立ちます。 </li><li>周囲の結合組織からのDRGを解放するためにデュモンの鉗子とノイエスはさみを使用してください。 DRGに取り付けられた神経根や脊髄神経をしてください。 </li><li>さらに解剖のための第三のペトリ皿にDRGをを移動するために、転送ピペットを使用してください。 </li><li>解剖顕微鏡下で、慎重に神経上膜周囲の目のできるだけ多くを削除電子のDRG。 <ol><li>背側と腹側根がDRGに参加し、DRGから前根を分離する開口部をカットするノイス春のはさみを使用してください。神経上膜を保持するためにデュモン位に鈍い先端を有する5ピンセットを使用し、神経上膜からDRGを展開する別の細かい鉗子を使用しています。 </li><li>細かい鉗子を使用したDRGに取り付けられた神経上膜のできるだけ多くを除去するために続けます。 注：よく解剖DRGは、次のステップでは良い消化を得ることが重要です。 </li></ol></li></ol> 3. DRG消化<ol><li>記録チャンバーにDRGを転送します。神経根が顔を下に発信DRGの側面を確認してください。 注：この方法では、ほとんどのニューロンがアクセス可能です。 </li><li> DRGを安定させるためにアンカーを使用してください。次の記録リグにテーブルの上に置かれている蠕動ポンプと接続されたプラスチックチューブを通して0.5ml /分の速度で酸素aCSFので灌流DRG。 </li><li>細胞が回復できるようにするために30分間待ちます。 CCDカメラを通して40X対物倍率で赤外線差動インタフェースコントラスト（IR-DIC）光学系の下でDRGの品質を評価します。 注：良いのDRGは、通常、多くのラウンド、よく対比、その表面に衛星グリア細胞に囲まれたニューロンが含まれています。 </li><li> DRGの表面の小さな領域を消化。 注：ガラスパッチピペットは、チューブは、気密シールをガラスピペットに取り付けることを可能にする小さなカップリングでピペットホルダ内に配置されています。 <ol><li>個別小径ゴム管の2枚を通してピペットホルダーへの2つの1ミリリットルのシリンジを接続します。 1ピペットホルダーのいずれかにコラゲナーゼを充填したガラスピペットと空のガラスピペットは、他の一つに入れてください。 </li><li>ちょうどDRGの上にピペットを配置するためにマイクロマニピュレーターを使用してください。その後、顕微鏡の倍率の下で、理想的には（静かにピペットチップの開口部を拡大するために、5-の直径をお互いに対して2ピペットの先端を衝突10ミクロン）。 </li><li>近いDRGの表面に酵素を充填したピペットを移動して、簡単にプランジャーを約0.5mlをずらすことによりホルダーと注射器を接続管を介してコラゲナーゼを含むピペットに正圧を適用します。 注：圧力の下で、ピペットからの酵素の流れが若干酵素アプリケーションのための記号としての役割を果たすことができるのDRGニューロン、間にスペースを拡大します。 </li><li> 10〜15分後、残りの神経上膜の破片が観察された場合、破片を離れて吸うために空のピペットに穏やかな負圧を適用します。 注：この方法では、ニューロンおよび周囲の衛星グリア細胞が明確にさらされると、パッチ記録の準備ができて。 </li><li>シャープコンテナに2ピペットを捨てます。 </li></ol></li></ol> 4.パッチクランプ記録<ol><li>劣化を防ぐために、氷の上に電極溶液（ 表3参照）を配置します。とガラスパッチピペットを埋めますフィルタリング細胞内液（シリンジフィルター、孔径0.2μmの）とヘッドステージピペットホルダーにピペットを配置します。浴溶液中にピペットを下げる前に、1ミリリットル程度のプランジャを移動させることによって5ミリリットル注射器を介してピペットに優しい正圧を適用します。 注：これは詰まるからピペットを防ぐことができます。 </li><li>その後、ソフトウェアで「膜テスト」インターフェイスを開き、アンプのモードつまみを回して、「V-クランプ」モードを選択します。顕微鏡検査で標的ニューロンの近くにピペットを移動します。 注：無傷のDRGの準備では、衛星グリア細胞の薄い層は、各ニューロンをカプセル化します。 </li><li>ニューロンと衛星グリア細胞の周囲の層との間の空間の急激な拡大が観察されるまでの衛星グリア細胞層を横断するピペットから正圧を使用してください。 「ディンプル」は、ニューロンに観察されるまで、ニューロンに向かってピペットを動かし続けます。 注：と比較して解離したニューロンからの記録は、正の圧力は、衛星グリア細胞層に浸透し、成功したパッチ適用のための可能性を高めるのに役立つであろう、少し大きくする必要があります。 </li><li>正圧を減らします。次に、穏やかな吸引ギガオームシールを達成します。 注：この方法では、記録の成功率が少なくとも70％です。 </li><li>以前19記載されているように、全細胞記録の設定を取得します。 <ol><li>簡潔には、短いが強い吸引を介して、神経細胞膜を貫通します。吸引が印加されている間に別の方法として、アンプの「ザップ」関数を使用します。 </li><li>全細胞モードが確立されると、アンプの容量と抵抗補償ノブを回すことにより、全セル容量および直列抵抗（Rs）を補償します。 注：Rsは通常5-20MΩです。 </li><li> Rsが30MΩよりも、最初は大きければ、セルを放棄します。または録音中に20％以上の変更をRS。また静止膜電位を測定します。静止膜電位がより-50mVでより多くのであれば、セルを放棄します。 </li></ol></li><li> 「膜テスト」ウィンドウを閉じます。アンプのモードつまみを回して「I-クランプノーマル」モードを選択します。 </li><li> 、ソフトウェアの「オープンプロトコル」をクリックして選択し、基電流を測定するためのプロトコルをロードします。録音を開始する「記録」をクリックしてください。 100 pAのステップで電流を脱分極の段階的な一連を注入することによって、神経細胞の興奮性を調べるために、入力抵抗と基電流を測定します。 <ol><li>再び「オープンプロトコル」をクリックして、膜の閾値を測定するためのプロトコルを選択します。ランプ電流（2000 PA /秒）脱分極500ミリ秒は、ニューロンに注入されます。 </li><li>製造業者の指示に従って記録されたトレースを分析するためにデータ収集および分析ソフトウェア（ 例えば、Clampfit）を使用します。定常状態IVのrelatに基づいて入力抵抗（RIN）を計算するためのソフトウェアを使用して配信過分極電流の間にionship。基電流および膜しきい値の値を測定するためにカーソルを移動します。 注：APを誘導するのに必要な電流の振幅は、基電流として定義され、APを誘導するための最低電圧は、膜閾値として定義されます。 </li></ol></li><li>リガンド誘導電流を記録します。 <ol><li>特異的アゴニストでピペットを埋めます。 注：現在のレポートでは、我々はそれぞれグルタミン酸受容体とTRPA1受容体によって媒介される電流を誘導するために、100μMのグルタミン酸および100μMAITCを使用。 </li><li>内部に気泡がないことを確認するピペットを確認してください。ピペットホルダーにピペットを置きます。薬物分配システムに接続されたチューブにピペットホルダーを接続します。 </li><li>ニューロンの50ミクロン以内にピペットを移動するためにマニピュレータを使用してください。 1 PSIへの薬物分配システム圧力及び1秒の持続時間を設定します。電圧クランプの記録モードを切り替えて、-70 mVのにクランプ。簡潔には、薬物誘発性電流を記録するために、薬物分配システムを介して圧力を加えます。 </li></ol></li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

私たちは、パッチクランプ研究のための全体のDRGを調製するための方法を報告しています。理想的な試料を調製するためのいくつかの重要な要素があります。第一に、添付の背側根でのDRGを分析することが重要です。その後、神経上膜は、ニューロンへの損傷を回避しながら慎重に除去する必要があります。最終的に、ニューロンおよびその周囲の衛星グリア細胞が露出するように、残りの?...

センセーションは、生物の生存と福祉に不可欠です。刺激の伝達は、一次感覚ニューロンからの軸索の末梢終末から始まる感覚経路に依存しています。一次感覚ニューロンは、三叉神経の脳核を除いて、三叉神経節および後根神経節（DRG）内に配置されています。彼らは、感覚情報1のゲートキーパーとして機能します。 perikarial膜では、ちょうど中枢および末梢端子のように、DRGニューロンは、グルタミン酸受容体として、受容体及びイオンチャネルを発現し、TNFアルファ受容体、一過性受容体電位陽イオンチャネルサブファミリーVメンバー1（TRPV1）、ナトリウムチャネルなど 2 -7。 perikarial膜のパッチクランプ記録は、ニューロン全体でこれらの受容体およびチャネルの多くの機能的変化を理解することができます。 パッチクランプ記録技術は、STUのための強力なツールです。チャネルもしくは受容体および研究の多くの活動を瀕死はDRGニューロン8-10にこの技術を適用することによって行われています。ほとんどの研究ではDRGは、背側根神経節に近い脊髄神経を切断することによって除去されます。ミンチした後、神経節は、次いで、記録する前に数日間、直ちにまたは培養記録されていてもよいDRGニューロンの解離をもたらす消化酵素に配置されます。残念ながら、DRGニューロンの解離はperikaryonの複数形に近い必要な軸索切断を伴います。いったん分離し、軸索切断し、DRGニューロンは、膜興奮11,12における表現型の変化だけでなく、変化を受けます。通常はそれらを囲む個々のニューロンのperikaryonの複数形及び衛星グリア細胞間の接触の損失は、これらの変化13に貢献する可能性があります。ニューロンと衛星グリア細胞間のクロストークは、生理的条件下において必須とpathologへの適応の両方でありますこのような難治性疼痛14,15につながるものとiCalの条件。解離したDRGの準備を使用して、ニューロンと衛星グリア細胞間の相互作用を研究するために挑戦することになります。 無傷のDRGを、一方、 インビボ条件に近い提供します。過去数年間で、私たちの研究室だけでなく、いくつかの他のグループは、慢性疼痛3-5,11,15-17に関連したさまざまな条件での一次感覚ニューロンの変化を調査するために成体ラットから無傷のDRGを使用しています。これらの研究で使用される技術は多少確立されていますが、ステップバイステップの説明がまだ公開されていません。本原稿では、我々は、無傷のDRGおよびパッチクランプ記録のためのそれらの使用を準備するための便利で高速な方法を記述する。

<table><tbody><tr><td>Pentobarbital sodium</td><td>vortech Pharmaceuticals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>syringe</td><td>BD</td><td>309659</td><td>1 ml, 5 ml.</td></tr><tr><td>scalpel</td><td>BD</td><td></td><td>size: 15</td></tr><tr><td>Mayo straight scissor</td><td>Fine Science Tools</td><td>14010-15</td><td></td></tr><tr><td>Mayo curved scissor</td><td>Fine Science Tools</td><td>14011-15</td><td></td></tr><tr><td>Rongeur</td><td>Fine Science Tools</td><td>16021-14</td><td></td></tr><tr><td>Adson toothed forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11027-12</td><td></td></tr><tr><td>Iris Scissor</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Noyes spring scissor</td><td>Fine Science Tools</td><td>15124-12</td><td></td></tr><tr><td>Bone scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>16044-10</td><td>Special for cutting the bones.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Forceps: Dumont, Dumoxel Biologie #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-30</td><td>These have the fine tips that do not need sharpening when first purchased.</td></tr><tr><td>periosteal elevator</td><td>Sklar</td><td>97-0530</td><td></td></tr><tr><td>Dissection microscope</td><td>WILD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipette</td><td>Fisher brand</td><td>13-711-5AM</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish (10 cm)</td><td>Pyrex</td><td></td><td>Glass petri dish can avoid damaging the tips of fine forceps</td></tr><tr><td>Collagenase (Liberase TM)</td><td>Roche</td><td>05-401-119-001</td><td>dissolve at the concentration of 13 U/ml, aliquot into glass pipette. Avoid repeated freeze and thaw.</td></tr><tr><td>filter</td><td>Thermo scientific</td><td>7232520</td><td>Filter the internal solutions for patch clamp recording to avoid clog.</td></tr><tr><td>Glass pipette</td><td>Sutter</td><td>BF150-110-7.5</td><td></td></tr><tr><td>Anchor</td><td>Havard apparatus</td><td>64-0250</td><td>stabilize the DRG to avoid drift.</td></tr><tr><td>Peristaltic pump</td><td>WPI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette puller</td><td>Sutter</td><td>P97</td><td></td></tr><tr><td>Amplifier</td><td>Molecular devices</td><td>Axopatch 200B</td><td></td></tr><tr><td>Digitizer</td><td>Molecular devices</td><td>1440D</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>NIKON</td><td>FN600</td><td></td></tr><tr><td>Micro-manipulator</td><td>Sutter</td><td>MPC200</td><td></td></tr><tr><td>microinjection dispense system</td><td>General Valve</td><td>Picrospitzer II</td><td>fast drug application system</td></tr><tr><td>Carbogen (95% O2, 5% CO2)</td><td>Local Medical Gas supplier</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

patch clamp recordings on intact dorsal root ganglia from adult rats

後根神経節（DRG）を切り出し、神経細胞からのパッチクランプ研究は、末梢神経系の我々の理解が高まっています。現在、レコーディングの大部分は、ほとんどの研究室のための標準的な製剤である解離DRGニューロン上で行われています。ニューロンの特性は、しかしながら、解離したニューロンを取得する際に用いられる酵素消化から生じる軸索損傷によって変更することができます。一次感覚ニューロンを取り囲む衛星グリア細胞との接触の損失は、この方法の避けられない結果であるので、解離ニューロン製剤は完全にDRGの微小環境を表すことができません。パッチクランプ記録のために、従来の解離DRGニューロンを使用して制限を克服するために、この報告書では、我々は、ex vivoで 、無傷のDRGを作成し、個々の一次感覚ニューロンにパッチクランプ記録を行う方法について説明します。このアプローチはで模倣、無傷のDRGの高速かつ簡単な製造を可能その周囲の衛星グリア細胞と基底膜に関連したDRGニューロンを維持することにより、インビボ条件。さらに、この方法は、操作からの軸索の損傷を回避し、そのようなDRGを解離するときのように消化酵素。このエクスビボ製剤はさらに、一次感覚ニューロンおよび衛星グリア細胞間の相互作用を研究するために使用することができます。

図1は、パッチ記録のために無傷のDRGの製造方法を示している。 図1Aは、椎弓切除後に神経節の暴露と場所を示している。Figure1Bは、脊髄を除去した後に取り付けられた神経根とL3、L4とL5のDRGを示しています。そして、L4と5 DRGを慎重に解剖し、椎骨から解放されます。次に、神経上膜、DRGを囲む透明な膜は、（黄色の矢印、 <strong...

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Patch Clamp Recordings on Intact Dorsal Root Ganglia from Adult Rats

This manuscript describes how to prepare intact dorsal root ganglia for patch clamp recordings. This preparation maintains the microenvironment for neurons and satellite glial cells, thus avoiding the phenotypic and functional changes seen using dissociated DRG neurons.

成体ラットから無傷の後根神経節上のパッチクランプ記録

Patch clamp studies from dorsal root ganglia (DRGs) neurons have increased our understanding of the peripheral nervous system. Currently, the majority of ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

14.2K ビュー.  University of California, San Francisco. This manuscript describes how to prepare intact dorsal root ganglia for patch clamp recordings. This preparation maintains the microenvironment for neurons and satellite glial cells, thus avoiding the phenotypic and functional changes seen using dissociated DRG neurons.

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Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells

Ganglion cells are the output neurons of the retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs arising from specific neural circuits. Patch clamp techniques, in voltage clamp and current clamp configurations, are commonly used to study the physiological properties of neurons and to characterize their synaptic inputs. Although the application of these techniques is highly informative, they pose various limitations. For example, it is difficult to quantify how the precise interactions of excitatory and inhibitory inputs determine response output. To address this issue, we used a modified current clamp technique, dynamic clamp, also called conductance clamp 1, 2, 3 and examined the impact of excitatory and inhibitory synaptic inputs on neuronal excitability. This technique requires the injection of current into the cell and is dependent on the real-time feedback of its membrane potential at that time. The injected current is calculated from predetermined excitatory and inhibitory synaptic conductances, their reversal potentials and the cell's instantaneous membrane potential. Details on the experimental procedures, patch clamping cells to achieve a whole-cell configuration and employment of the dynamic clamp technique are illustrated in this video article. Here, we show the responses of mouse retinal ganglion cells to various conductance waveforms obtained from physiological experiments in control conditions or in the presence of drugs. Furthermore, we show the use of artificial excitatory and inhibitory conductances generated using alpha functions to investigate the responses of the cells.

This video article illustrates the set-up, the procedures to patch cell bodies and how to implement dynamic clamp recordings from ganglion cells in whole-mount mouse retinae. This technique allows the investigation of the precise contribution of excitatory and inhibitory synaptic inputs, and their relative magnitude and timing to neuronal spiking.

マウスの網膜神経節細胞におけるシナプスと人工コンダクタンスによるダイナミッククランプの実装

Ganglion cells are the output neurons of the  retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs  arising from specific neural ...

神経科学

Measuring Spinal Presynaptic Inhibition in Mice By Dorsal Root Potential Recording In Vivo

Presynaptic inhibition is one of the most powerful inhibitory mechanisms in the spinal cord. The underlying physiological mechanism is a depolarization of primary afferent fibers mediated by GABAergic axo-axonal synapses (primary afferent depolarization). The strength of primary afferent depolarization can be measured by recording of volume-conducted potentials at the dorsal root (dorsal root potentials, DRP). Pathological changes of presynaptic inhibition are crucial in the abnormal central processing of certain pain conditions and in some disorders of motor hyperexcitability. Here, we describe a method of recording DRP in vivo in mice. The preparation of spinal cord dorsal roots in the anesthetized animal and the recording procedure using suction electrodes are explained. This method allows measuring GABAergic DRP and thereby estimating spinal presynaptic inhibition in the living mouse. In combination with transgenic mouse models, DRP recording may serve as a powerful tool to investigate disease-associated spinal pathophysiology. In vivo recording has several advantages compared to ex vivo isolated spinal cord preparations, e.g. the possibility of simultaneous recording or manipulation of supraspinal networks and induction of DRP by stimulation of peripheral nerves.

Measuring Spinal Presynaptic Inhibition in Mice By Dorsal Root Potential Recording In Vivo

GABAergic presynaptic inhibition is a powerful inhibitory mechanism in the spinal cord important for motor and sensory signal integration in spinal cord networks. Underlying primary afferent depolarization can be measured by recording of dorsal root potentials (DRP). Here we demonstrate a method of in vivo recording of DRP in mice.

後根潜在的記録によりマウスにおける脊髄シナプス前抑制を測定する<em&gt;インビボ</em

Presynaptic inhibition is one of the most powerful inhibitory mechanisms in the spinal cord. The underlying physiological mechanism is a depolarization of ...

The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to network properties. We show how to prepare viable oblique slices of the spinal cord of young mice (P2 - P11). In this preparation, the motoneurons retain&#160;their axons coming out from the ventral roots of the&#160;spinal cord. Stimulation of these axons elicits back-propagating action potentials invading the motoneuron&#160;somas and exciting the motoneuron&#160;collaterals within the spinal cord. Recording of antidromic action potentials is an immediate, definitive and elegant way to characterize motoneuron identity, which surpasses&#160;other identification methods. Furthermore, stimulating the motoneuron collaterals is a simple and reliable way to excite the collateral targets of the motoneurons within the spinal cord, such as other motoneurons or Renshaw cells. In this protocol, we present antidromic recordings from the motoneuron somas as well as Renshaw cell excitation, resulting from ventral root stimulation.

We show how to prepare oblique slices of the spinal cord in young mice. This preparation allows for the stimulation of the ventral roots.

前根刺激のための斜め脊髄スライスの調製

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to ...

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding these fundamental functions will shed light on the information transfer in these neurons. Dendritic patch-clamp recordings provide the possibility to directly examine the electrical properties of dendrites and underlying voltage-gated ion channels. However, these fine structures are not easily accessible to patch pipettes because of their small diameter. This report describes a step-by-step procedure to collect stable and reliable recordings from the dendrites of dopaminergic neurons in acute slices. Electrophysiological measurements are combined with post hoc recovery of cell morphology. Successful experiments rely on improved preparation of slices, solutions and pipettes, adequate adjustment of the optics and stability of the pipette in contact with the recorded structure. Standard principles of somatic patch-clamp recording are applied to dendrites but with a gentler approach of the pipette. These versatile techniques can be implemented to address various questions concerning the excitable properties of dendrites.

Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.

黒質ドーパミンニューロンの細胞体樹状突起のドメインからの亜細胞パッチクランプ記録

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...

Use of In Vivo Single-fiber Recording and Intact Dorsal Root Ganglion with Attached Sciatic Nerve to Examine the Mechanism of Conduction Failure

Single-fiber recording has been a classical and effective electrophysiological technique over the last few decades because of its specific application for nerve fibers in the central and peripheral nervous systems. This method is particularly applicable to dorsal root ganglia (DRG), which are primary sensory neurons that exhibit a pseudo-unipolar structure of nervous processes. The patterns and features of the action potentials passed along axons are recordable in these neurons. The present study uses in vivo single-fiber recordings to observe the conduction failure of sciatic nerves in complete Freund&#8217;s adjuvant (CFA)-treated rats. As the underlying mechanism cannot be studied using in vivo single-fiber recordings, patch-clamp-recordings of DRG neurons are performed on preparations of intact DRG with the attached sciatic nerve. These recordings reveal a positive correlation between conduction failure and the rising slope of the after-hyperpolarization potential (AHP) of DRG neurons in CFA-treated animals. The protocol for in vivo single fiber-recordings allows the classification of nerve fibers via the measurement of conduction velocity and monitoring of abnormal conditions in nerve fibers in certain diseases. Intact DRG with attached peripheral nerve allows observation of the activity of DRG neurons in most physiological conditions. Conclusively, single-fiber recording combined with electrophysiological recording of intact DRGs is an effective method to examine the role of conduction failure during the analgesic process.

Single-fiber recording is an effective electrophysiological technique that is applicable to the central and peripheral nervous systems. Along with the preparation of intact DRG with the attached sciatic nerve, the mechanism of conduction failure is examined. Both protocols improve the understanding of the peripheral nervous system&#39;s relationship with pain.

インビボシングルファイバー記録と無傷の後部根神経を用いて伝導障害のメカニズムを調べる

Single-fiber recording has been a classical and effective electrophysiological technique over the last few decades because of its specific application for ...

Isolating and Culturing Vestibular and Spiral Ganglion Somata from Neonatal Rodents for Patch-Clamp Recordings

The compact morphology of isolated and cultured inner ear ganglion neurons allows for detailed characterizations of the ion channels and neurotransmitter receptors that contribute to cell diversity across this population. This protocol outlines the steps necessary for successful dissecting, dissociating, and short-term culturing of the somata of inner ear bipolar neurons for the purpose of patch-clamp recordings. Detailed instructions for preparing vestibular ganglion neurons are provided with the necessary modifications needed for plating spiral ganglion neurons. The protocol includes instructions for performing whole-cell patch-clamp recordings in the perforated-patch configuration. Example results characterizing the voltage-clamp recordings of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN)-mediated currents highlight the stability of perforated-patch recording configuration in comparison to the more standard ruptured-patch configuration. The combination of these methods, isolated somata plus perforated-patch-clamp recordings, can be used to study cellular processes that require long, stable recordings and the preservation of intracellular milieu, such as signaling through G-protein coupled receptors.

Presented here are methods providing detailed instructions for dissecting, dissociating, culturing, and patch-clamp recording from vestibular ganglion and spiral ganglion neurons of the inner ear.

パッチクランプ記録のための新生児げっ歯類からの前庭およびらせん状神経節体細胞の分離と培養

The compact morphology of isolated and cultured inner ear ganglion neurons allows for detailed characterizations of the ion channels and neurotransmitter ...

脊髄刺激に対する運動ニューロン応答の理解

The Ex vivo Preparation of Spinal Cord Slice for the Whole-Cell Patch-Clamp Recording in Motor Neurons During Spinal Cord Stimulation

Spinal cord stimulation (SCS) can effectively restore locomotor function after spinal cord injury (SCI). Because the motor neurons are the final unit to execute sensorimotor behaviors, directly studying the electrical responses of motor neurons with SCS can help us understand the underlying logic of spinal motor modulation. To simultaneously record diverse stimulus characteristics and cellular responses, a patch-clamp is a good method to study the electrophysiological characteristics at a single-cell scale. However, there are still some complex difficulties in achieving this goal, including maintaining cell viability, quickly separating the spinal cord from the bony structure, and using the SCS to successfully induce action potentials. Here, we present a detailed protocol using patch-clamp to study the electrical responses of motor neurons to SCS with high spatiotemporal resolution, which can help researcher improve their skills in separating the spinal cord and maintaining the cell viability at the same time to smoothly study the electrical mechanism of SCS on motor neuron and avoid unnecessary trial and mistake.

著者スポットライト:脊髄刺激の進歩 - パッチクランプ電気生理学による運動ニューロンの細胞応答の探索 

This protocol describes a method using a patch-clamp to study the electrical responses of motor neurons to spinal cord stimulation (SCS) with high spatiotemporal resolution, which can help researchers improve their skills in separating the spinal cord and maintaining cell viability simultaneously.

脊髄刺激時の運動ニューロンにおける全細胞パッチクランプ記録のための脊髄スライスの ex vivo 調製

Spinal cord stimulation (SCS) can effectively restore locomotor function after spinal cord injury (SCI). Because the motor neurons are the final unit to ...

<meta charset="utf8"></head><body>心肺感覚ニューロンのための胸部T1 DRGのカルシウムイメージング

In Vivo Thoracic Dorsal Root Ganglia (DRG) Calcium Imaging and ECG Recording for Studying Peripheral Nerve Stimulation

The dorsal root ganglia (DRG), housing primary sensory neurons, transmit somatosensory and visceral afferent inputs to the dorsal horn of the spinal cord. They play a pivotal role in both physiological and pathological states, including neuropathic and visceral pain. In vivo calcium imaging of DRG enables real-time observation of calcium transients in single units or neuron ensembles. Accumulating evidence indicates that DRG neuronal activities induced by somatic stimulation significantly affect autonomic and visceral functions. While lumbar DRG calcium imaging has been extensively studied, thoracic segment DRG calcium imaging has been less explored due to surgical exposure and stereotaxic fixation challenges. Here, we utilized in vivo calcium imaging at the thoracic1 dorsal root ganglion (T1-DRG) to investigate changes in neuronal activity resulting from somatic stimulations of the forelimb. This approach is crucial for understanding the somato-cardiac reflex triggered by peripheral nerve stimulations (PENS), such as acupuncture. Notably, synchronization of cardiac function was observed and measured by electrocardiogram (ECG), with T-DRG neuronal activities, potentially establishing a novel paradigm for somato-visceral reflex in the thoracic segments.

<meta charset="utf8"></head><body>末梢神経刺激研究のためのin vivo胸部背根神経節(DRG)カルシウムイメージングとECG記録

This study presents a surgical manipulation to expose the T-DRG in anesthetized mice for in vivo calcium imaging, along with synchronous ECG recordings. This method represents a cutting-edge tool for studying peripheral electric nerve stimulation and thoracic visceral organ inputs, as well as their interactions at the primary sensory level.

末梢神経刺激研究のためのin vivo胸部背根神経節(DRG)カルシウムイメージングとECG記録

The dorsal root ganglia (DRG), housing primary sensory neurons, transmit somatosensory and visceral afferent inputs to the dorsal horn of the spinal cord. ...

成体ラットから無傷の後根神経節上のパッチクランプ記録

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マウスの網膜神経節細胞におけるシナプスと人工コンダクタンスによるダイナミッククランプの実装

後根潜在的記録によりマウスにおける脊髄シナプス前抑制を測定する

前根刺激のための斜め脊髄スライスの調製

黒質ドーパミンニューロンの細胞体樹状突起のドメインからの亜細胞パッチクランプ記録

インビボシングルファイバー記録と無傷の後部根神経を用いて伝導障害のメカニズムを調べる

パッチクランプ記録のための新生児げっ歯類からの前庭およびらせん状神経節体細胞の分離と培養

脊髄刺激時の運動ニューロンにおける全細胞パッチクランプ記録のための脊髄スライスの ex vivo 調製

脊髄刺激時の運動ニューロンにおける全細胞パッチクランプ記録のための脊髄スライスの ex vivo 調製

脊髄刺激時の運動ニューロンにおける全細胞パッチクランプ記録のための脊髄スライスの ex vivo 調製

末梢神経刺激研究のためのin vivo胸部背根神経節(DRG)カルシウムイメージングとECG記録