The authors would like to acknowledge the Painless Research Foundation for support of the work. This work was also supported by the NIH grants R01 NS080921-01 and R21 NS079897-01A1.

倫理声明：実験動物のメンテナンスと使用のためのすべての手順は、動物実験にUCSF委員会の規制に適合し、動物使用とケアにNIH規制のガイドラインに従って実施した（文献85から23まで、1996年改訂）。 UCSF制度動物実験委員会は、この研究で使用されるプロトコルを承認しました。 楽器、ソリューションおよび料理の作製<ol><li>人工脳脊髄液（aCSFの）を準備します。 <ol><li> （溶液調製については表1および2参照 ）10倍低いカチオン溶液500ml、及び10倍重炭酸塩溶液500mlを調製します。 4 O Cで保存し、1ヶ月以内に使用します。 </li><li>重炭酸塩溶液60mlで10倍低いカチオン溶液の60ミリリットルを混合することによって、新鮮なaCSFのの600ミリリットルを準備し、その後、600ミリリットルの最終容量に到達するための脱イオン水480ミリリットルを追加します。バブルaCSFのカーボゲンと使用前に少なくとも10分間（5％O 2及び95％CO 2）。 </li></ol></li><li>キャピラリーガラスからパッチピペットを引き出します。 <ol><li>記録ピペットを準備するために、ピペットプラーに薄壁キャピラリーガラスを置きます。 注意：私たちの研究室では、プーラーの次の設定パラメータは、理想的なピペット形状を達成するために使用されている：熱（510）、速度（32）。無傷のDRGの記録のための理想的なピペット形状が低い円錐角を有する緩やかな細いテーパを有するべきであり、これは最高の試行錯誤することによって達成することができます。 </li><li>内部ソリューション（解決策の準備のため、表3を参照）を充填したときのピペットの抵抗は3-5MΩであることを確認してください。ピペット抵抗18を測定する具体的な方法のための軸索ガイドを参照してください。 </li></ol></li><li> 13単位/ mlの最終濃度を与えるために、aCSFの400μlにコラゲナーゼの1ミリグラムを追加します。その後、コラゲナーゼ溶液の約20μlの各ガラスピペットを埋めます。格納-20°Cの冷凍庫で満たされたピペットと3週間以内にそれらを使用しています。 </li><li>冷たいaCSFの（約4 Oの C）の200ミリリットルを準備します。それが凍結し始めるまで迅速にaCSFを冷却ビーカーにそれを配置するには、約20分間、-20°Cの冷凍庫にプラスチックラップと場所で密封します。 10分間、カルボゲンで氷浴やバブルにビーカーを置きます。バブルRTでカーボゲンとaCSFの残りの400ミリリットル。 </li><li> aCSFの、冷却されている間、5mmの直径の開口部（これはDRGを転送するために使用される）を拡大するためにプラスチック製の使い捨てのトランスファーピペットの端部を切断します。次の手術器具を収集：メス（＃15）、メイヨーは、直線と曲線はさみ、罰金2ミリメートルの先端骨鉗子、Adson（歯付き）鉗子、アイリスはさみ、春のはさみと2細かい鉗子。 3ガラスペトリ皿（さ：10 cm外径）に酸素冷たいaCSFのを注ぎます。 </li></ol> 2. DRG解剖<ol><li>ナトリウムPEでラット（200〜220グラム）を麻酔ntobarbitalた（100mg / kg、腹腔内）麻酔のレベルがペダル反射し、目の瞬目反射をテストして適切であることを確認してください。 </li><li>ラットを麻酔されていることを確認した後、腰部を剃ると正中線に沿って皮膚や皮下組織を切開。細かい骨膜エレベーターを使用して、L1-S2レベルで棘突起から傍脊柱の筋肉を切り離します。 </li><li> S2にL1から棘突起をカットする湾曲したハサミを使用してください。 2-3分間（ステップ1.5で調製した）露出した脊柱で約L1とS1における横カットを行い、 一括脊柱のこのセグメントを削除し、すぐに冷たいaCSFの中にそれを沈めるためにまっすぐマヨはさみを使用してください。ラットは深いペントバルビタール麻酔下にある間に腰椎のDRGを除去した後、安楽死は、二国間の開胸術によって行われます。 </li><li>削除された脊柱と付着した組織から血液をオフにフラッシュし、冷たいaCSFのペトリ皿に移します。 U薄層を除去するための細かい骨鉗子をSE。脊髄を露出させるためにmicroscissorsで正中線に沿って硬膜をカット。静かに脊髄を持ち上げ、虹彩のはさみを使用して、脊髄にそのエントリポイントで神経根をカットし、脊髄を除去します。 </li><li>冷たいaCSFので充填された第2のペトリ皿にDRGを持つ残りの椎骨を転送します。横突起と坐骨神経への相対的な位置に基づいて、L4とL5のDRGを特定します。 注：無傷の坐骨神経を維持することは、L4とL5 DRG（坐骨神経がL4-6脊髄神経に由来する）を識別するのに役立ちます。 </li><li>周囲の結合組織からのDRGを解放するためにデュモンの鉗子とノイエスはさみを使用してください。 DRGに取り付けられた神経根や脊髄神経をしてください。 </li><li>さらに解剖のための第三のペトリ皿にDRGをを移動するために、転送ピペットを使用してください。 </li><li>解剖顕微鏡下で、慎重に神経上膜周囲の目のできるだけ多くを削除電子のDRG。 <ol><li>背側と腹側根がDRGに参加し、DRGから前根を分離する開口部をカットするノイス春のはさみを使用してください。神経上膜を保持するためにデュモン位に鈍い先端を有する5ピンセットを使用し、神経上膜からDRGを展開する別の細かい鉗子を使用しています。 </li><li>細かい鉗子を使用したDRGに取り付けられた神経上膜のできるだけ多くを除去するために続けます。 注：よく解剖DRGは、次のステップでは良い消化を得ることが重要です。 </li></ol></li></ol> 3. DRG消化<ol><li>記録チャンバーにDRGを転送します。神経根が顔を下に発信DRGの側面を確認してください。 注：この方法では、ほとんどのニューロンがアクセス可能です。 </li><li> DRGを安定させるためにアンカーを使用してください。次の記録リグにテーブルの上に置かれている蠕動ポンプと接続されたプラスチックチューブを通して0.5ml /分の速度で酸素aCSFので灌流DRG。 </li><li>細胞が回復できるようにするために30分間待ちます。 CCDカメラを通して40X対物倍率で赤外線差動インタフェースコントラスト（IR-DIC）光学系の下でDRGの品質を評価します。 注：良いのDRGは、通常、多くのラウンド、よく対比、その表面に衛星グリア細胞に囲まれたニューロンが含まれています。 </li><li> DRGの表面の小さな領域を消化。 注：ガラスパッチピペットは、チューブは、気密シールをガラスピペットに取り付けることを可能にする小さなカップリングでピペットホルダ内に配置されています。 <ol><li>個別小径ゴム管の2枚を通してピペットホルダーへの2つの1ミリリットルのシリンジを接続します。 1ピペットホルダーのいずれかにコラゲナーゼを充填したガラスピペットと空のガラスピペットは、他の一つに入れてください。 </li><li>ちょうどDRGの上にピペットを配置するためにマイクロマニピュレーターを使用してください。その後、顕微鏡の倍率の下で、理想的には（静かにピペットチップの開口部を拡大するために、5-の直径をお互いに対して2ピペットの先端を衝突10ミクロン）。 </li><li>近いDRGの表面に酵素を充填したピペットを移動して、簡単にプランジャーを約0.5mlをずらすことによりホルダーと注射器を接続管を介してコラゲナーゼを含むピペットに正圧を適用します。 注：圧力の下で、ピペットからの酵素の流れが若干酵素アプリケーションのための記号としての役割を果たすことができるのDRGニューロン、間にスペースを拡大します。 </li><li> 10〜15分後、残りの神経上膜の破片が観察された場合、破片を離れて吸うために空のピペットに穏やかな負圧を適用します。 注：この方法では、ニューロンおよび周囲の衛星グリア細胞が明確にさらされると、パッチ記録の準備ができて。 </li><li>シャープコンテナに2ピペットを捨てます。 </li></ol></li></ol> 4.パッチクランプ記録<ol><li>劣化を防ぐために、氷の上に電極溶液（ 表3参照）を配置します。とガラスパッチピペットを埋めますフィルタリング細胞内液（シリンジフィルター、孔径0.2μmの）とヘッドステージピペットホルダーにピペットを配置します。浴溶液中にピペットを下げる前に、1ミリリットル程度のプランジャを移動させることによって5ミリリットル注射器を介してピペットに優しい正圧を適用します。 注：これは詰まるからピペットを防ぐことができます。 </li><li>その後、ソフトウェアで「膜テスト」インターフェイスを開き、アンプのモードつまみを回して、「V-クランプ」モードを選択します。顕微鏡検査で標的ニューロンの近くにピペットを移動します。 注：無傷のDRGの準備では、衛星グリア細胞の薄い層は、各ニューロンをカプセル化します。 </li><li>ニューロンと衛星グリア細胞の周囲の層との間の空間の急激な拡大が観察されるまでの衛星グリア細胞層を横断するピペットから正圧を使用してください。 「ディンプル」は、ニューロンに観察されるまで、ニューロンに向かってピペットを動かし続けます。 注：と比較して解離したニューロンからの記録は、正の圧力は、衛星グリア細胞層に浸透し、成功したパッチ適用のための可能性を高めるのに役立つであろう、少し大きくする必要があります。 </li><li>正圧を減らします。次に、穏やかな吸引ギガオームシールを達成します。 注：この方法では、記録の成功率が少なくとも70％です。 </li><li>以前19記載されているように、全細胞記録の設定を取得します。 <ol><li>簡潔には、短いが強い吸引を介して、神経細胞膜を貫通します。吸引が印加されている間に別の方法として、アンプの「ザップ」関数を使用します。 </li><li>全細胞モードが確立されると、アンプの容量と抵抗補償ノブを回すことにより、全セル容量および直列抵抗（Rs）を補償します。 注：Rsは通常5-20MΩです。 </li><li> Rsが30MΩよりも、最初は大きければ、セルを放棄します。または録音中に20％以上の変更をRS。また静止膜電位を測定します。静止膜電位がより-50mVでより多くのであれば、セルを放棄します。 </li></ol></li><li> 「膜テスト」ウィンドウを閉じます。アンプのモードつまみを回して「I-クランプノーマル」モードを選択します。 </li><li> 、ソフトウェアの「オープンプロトコル」をクリックして選択し、基電流を測定するためのプロトコルをロードします。録音を開始する「記録」をクリックしてください。 100 pAのステップで電流を脱分極の段階的な一連を注入することによって、神経細胞の興奮性を調べるために、入力抵抗と基電流を測定します。 <ol><li>再び「オープンプロトコル」をクリックして、膜の閾値を測定するためのプロトコルを選択します。ランプ電流（2000 PA /秒）脱分極500ミリ秒は、ニューロンに注入されます。 </li><li>製造業者の指示に従って記録されたトレースを分析するためにデータ収集および分析ソフトウェア（ 例えば、Clampfit）を使用します。定常状態IVのrelatに基づいて入力抵抗（RIN）を計算するためのソフトウェアを使用して配信過分極電流の間にionship。基電流および膜しきい値の値を測定するためにカーソルを移動します。 注：APを誘導するのに必要な電流の振幅は、基電流として定義され、APを誘導するための最低電圧は、膜閾値として定義されます。 </li></ol></li><li>リガンド誘導電流を記録します。 <ol><li>特異的アゴニストでピペットを埋めます。 注：現在のレポートでは、我々はそれぞれグルタミン酸受容体とTRPA1受容体によって媒介される電流を誘導するために、100μMのグルタミン酸および100μMAITCを使用。 </li><li>内部に気泡がないことを確認するピペットを確認してください。ピペットホルダーにピペットを置きます。薬物分配システムに接続されたチューブにピペットホルダーを接続します。 </li><li>ニューロンの50ミクロン以内にピペットを移動するためにマニピュレータを使用してください。 1 PSIへの薬物分配システム圧力及び1秒の持続時間を設定します。電圧クランプの記録モードを切り替えて、-70 mVのにクランプ。簡潔には、薬物誘発性電流を記録するために、薬物分配システムを介して圧力を加えます。 </li></ol></li></ol>

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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+patch+clamp+recording+and+calcium+imaging+of+neurons+in+the+intact+dorsal+root+ganglion+in+rats.">An improved method for patch clamp recording and calcium imaging of neurons in the intact dorsal root ganglion in rats.</a> J Neurosci Methods. 173, 74-82 (2008).</li><li>Yagi, J., Sumino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+a+hyperpolarization-activated+current+by+clonidine+in+rat+dorsal+root+ganglion+neurons.">Inhibition of a hyperpolarization-activated current by clonidine in rat dorsal root ganglion neurons.</a> J Neurophysiol. 80, 1094-1104 (1998).</li><li>Ma, C., Donnelly, D. F., LaMotte, R. 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The authors declare that they have no competing financial interests.

私たちは、パッチクランプ研究のための全体のDRGを調製するための方法を報告しています。理想的な試料を調製するためのいくつかの重要な要素があります。第一に、添付の背側根でのDRGを分析することが重要です。その後、神経上膜は、ニューロンへの損傷を回避しながら慎重に除去する必要があります。最終的に、ニューロンおよびその周囲の衛星グリア細胞が露出するように、残りの?...

センセーションは、生物の生存と福祉に不可欠です。刺激の伝達は、一次感覚ニューロンからの軸索の末梢終末から始まる感覚経路に依存しています。一次感覚ニューロンは、三叉神経の脳核を除いて、三叉神経節および後根神経節（DRG）内に配置されています。彼らは、感覚情報1のゲートキーパーとして機能します。 perikarial膜では、ちょうど中枢および末梢端子のように、DRGニューロンは、グルタミン酸受容体として、受容体及びイオンチャネルを発現し、TNFアルファ受容体、一過性受容体電位陽イオンチャネルサブファミリーVメンバー1（TRPV1）、ナトリウムチャネルなど 2 -7。 perikarial膜のパッチクランプ記録は、ニューロン全体でこれらの受容体およびチャネルの多くの機能的変化を理解することができます。 パッチクランプ記録技術は、STUのための強力なツールです。チャネルもしくは受容体および研究の多くの活動を瀕死はDRGニューロン8-10にこの技術を適用することによって行われています。ほとんどの研究ではDRGは、背側根神経節に近い脊髄神経を切断することによって除去されます。ミンチした後、神経節は、次いで、記録する前に数日間、直ちにまたは培養記録されていてもよいDRGニューロンの解離をもたらす消化酵素に配置されます。残念ながら、DRGニューロンの解離はperikaryonの複数形に近い必要な軸索切断を伴います。いったん分離し、軸索切断し、DRGニューロンは、膜興奮11,12における表現型の変化だけでなく、変化を受けます。通常はそれらを囲む個々のニューロンのperikaryonの複数形及び衛星グリア細胞間の接触の損失は、これらの変化13に貢献する可能性があります。ニューロンと衛星グリア細胞間のクロストークは、生理的条件下において必須とpathologへの適応の両方でありますこのような難治性疼痛14,15につながるものとiCalの条件。解離したDRGの準備を使用して、ニューロンと衛星グリア細胞間の相互作用を研究するために挑戦することになります。 無傷のDRGを、一方、 インビボ条件に近い提供します。過去数年間で、私たちの研究室だけでなく、いくつかの他のグループは、慢性疼痛3-5,11,15-17に関連したさまざまな条件での一次感覚ニューロンの変化を調査するために成体ラットから無傷のDRGを使用しています。これらの研究で使用される技術は多少確立されていますが、ステップバイステップの説明がまだ公開されていません。本原稿では、我々は、無傷のDRGおよびパッチクランプ記録のためのそれらの使用を準備するための便利で高速な方法を記述する。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1016">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:252px;">Pentobarbital sodium</td>
			<td style="width:172px;">vortech Pharmaceuticals</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:484px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td>1 ml, 5 ml.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">scalpel</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td>size: 15</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mayo straight scissor</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14010-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mayo curved scissor</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14011-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rongeur</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>16021-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Adson toothed forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11027-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Iris Scissor</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14084-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Noyes spring scissor</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15124-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bone scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>16044-10</td>
			<td>Special for cutting the bones.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Forceps: Dumont, Dumoxel Biologie #5</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-30</td>
			<td>These have the fine tips that do not need sharpening when first purchased.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">periosteal elevator</td>
			<td>Sklar</td>
			<td>97-0530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dissection microscope</td>
			<td>WILD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Transfer pipette</td>
			<td>Fisher brand</td>
			<td>13-711-5AM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Petri dish (10 cm)</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td></td>
			<td>Glass petri dish can avoid damaging the tips of fine forceps</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Collagenase (Liberase TM)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>05-401-119-001</td>
			<td>dissolve at the concentration of 13 u/ml, aliquot into glass pipette. Avoid repeated freeze and thaw.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">filter</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>7232520</td>
			<td>Filter the internal solutions for patch clamp recording to avoid clog.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass pipette</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>BF150-110-7.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anchor</td>
			<td>Havard apparatus</td>
			<td>64-0250</td>
			<td>stabilize the DRG to avoid drift.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Peristaltic pump</td>
			<td>WPI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pipette puller</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>P97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Amplifier</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td>Axopatch 200B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Digitizer</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td>1440D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microscope</td>
			<td>NIKON</td>
			<td>FN600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micro-manipulator</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>MPC200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">microinjection dispense system</td>
			<td>General Valve</td>
			<td>Picrospitzer II</td>
			<td>fast drug application system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Carbogen (95% O2, 5% CO2)</td>
			<td>Local Medical Gas supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

patch clamp recordings on intact dorsal root ganglia from adult rats

後根神経節（DRG）を切り出し、神経細胞からのパッチクランプ研究は、末梢神経系の我々の理解が高まっています。現在、レコーディングの大部分は、ほとんどの研究室のための標準的な製剤である解離DRGニューロン上で行われています。ニューロンの特性は、しかしながら、解離したニューロンを取得する際に用いられる酵素消化から生じる軸索損傷によって変更することができます。一次感覚ニューロンを取り囲む衛星グリア細胞との接触の損失は、この方法の避けられない結果であるので、解離ニューロン製剤は完全にDRGの微小環境を表すことができません。パッチクランプ記録のために、従来の解離DRGニューロンを使用して制限を克服するために、この報告書では、我々は、ex vivoで 、無傷のDRGを作成し、個々の一次感覚ニューロンにパッチクランプ記録を行う方法について説明します。このアプローチはで模倣、無傷のDRGの高速かつ簡単な製造を可能その周囲の衛星グリア細胞と基底膜に関連したDRGニューロンを維持することにより、インビボ条件。さらに、この方法は、操作からの軸索の損傷を回避し、そのようなDRGを解離するときのように消化酵素。このエクスビボ製剤はさらに、一次感覚ニューロンおよび衛星グリア細胞間の相互作用を研究するために使用することができます。

図1は、パッチ記録のために無傷のDRGの製造方法を示している。 図1Aは、椎弓切除後に神経節の暴露と場所を示している。Figure1Bは、脊髄を除去した後に取り付けられた神経根とL3、L4とL5のDRGを示しています。そして、L4と5 DRGを慎重に解剖し、椎骨から解放されます。次に、神経上膜、DRGを囲む透明な膜は、（黄色の矢印、 <strong...

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Patch Clamp Recordings on Intact Dorsal Root Ganglia from Adult Rats

This manuscript describes how to prepare intact dorsal root ganglia for patch clamp recordings. This preparation maintains the microenvironment for neurons and satellite glial cells, thus avoiding the phenotypic and functional changes seen using dissociated DRG neurons.

成体ラットから無傷の後根神経節上のパッチクランプ記録

Patch clamp studies from dorsal root ganglia (DRGs) neurons have increased our understanding of the peripheral nervous system. Currently, the majority of ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

14.1K ビュー.  University of California, San Francisco. This manuscript describes how to prepare intact dorsal root ganglia for patch clamp recordings. This preparation maintains the microenvironment for neurons and satellite glial cells, thus avoiding the phenotypic and functional changes seen using dissociated DRG neurons.

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Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. Hydrogen-Deuterium Exchange (HDX) measured at rapid time scales is uniquely suited to detect structures and hydrogen bonding networks that are briefly populated, allowing for the characterization of transient conformers in native ensembles. Coupling of HDX to mass spectrometry offers several key advantages, including high sensitivity, low sample consumption and no restriction on protein size. This technique has advanced greatly in the last several decades, including the ability to monitor HDX labeling times on the millisecond time scale. In addition, by incorporating the HDX workflow onto a microfluidic platform housing an acidic protease microreactor, we are able to localize dynamic properties at the peptide level. In this study, Time-Resolved ElectroSpray Ionization Mass Spectrometry (TRESI-MS) coupled to HDX was used to provide a detailed picture of residual structure in the tau protein, as well as the conformational shifts induced upon hyperphosphorylation.

Conformational flexibility plays a critical role in protein function. Herein, we describe the use of time-resolved electrospray ionization mass spectrometry coupled to hydrogen-deuterium exchange for probing the rapid structural changes that drive function in ordered and disordered proteins.

時間分解エレクトロスプレーイオン化水素 - 重水素交換質量分析タンパク質の構造とダイナミクスを学ぶために

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

生化学

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where real-time measurements of fluorescence and currents simultaneously report on local rearrangements and global function, respectively1. While high-resolution structural techniques such as cryo-electron microscopy or X-ray crystallography provide static images of the proteins of interest, VCF provides dynamic structural data that allows us to link the structural rearrangements (fluorescence) to dynamic functional data (electrophysiology). Until recently, the thiol-reactive chemistry used for site-directed fluorescent labeling of the proteins restricted the scope of the approach because all accessible cysteines, including endogenous ones, will be labeled. It was thus required to construct proteins free of endogenous cysteines. Labeling was also restricted to sites accessible from the extracellular side. This changed with the use of Fluorescent Unnatural Amino Acids (fUAA) to specifically incorporate a small fluorescent probe in response to stop codon suppression using an orthogonal tRNA and tRNA synthetase pair2. The VCF improvement only requires a two-step injection procedure of DNA injection (tRNA/synthetase pair) followed by RNA/fUAA co-injection. Now, labelling both intracellular and buried sites is possible, and the use of VCF has expanded significantly. The VCF technique thereby becomes attractive for studying a wide range of proteins and &#8211; more importantly &#8211; allows investigating numerous cytosolic regulatory mechanisms.

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

This article describes an enhancement of conventional Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) where Fluorescent Unnatural Amino Acids (fUAA) are used instead of maleimide dyes, to probe structural rearrangements in ion channels. The procedure includes Xenopus oocyte DNA injection, RNA/fUAA coinjection, and simultaneous current and fluorescence measurements.

電圧クランプ<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;蛍光性の非天然アミノ酸を用いた卵母細胞

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where ...

Glycoproteomics of the Extracellular Matrix: A Method for Intact Glycopeptide Analysis Using Mass Spectrometry

Fibrosis is a hallmark of many cardiovascular diseases and is associated with the exacerbated secretion and deposition of the extracellular matrix (ECM). Using proteomics, we have previously identified more than 150 ECM and ECM-associated proteins in cardiovascular tissues. Notably, many ECM proteins are glycosylated. This post-translational modification affects protein folding, solubility, binding, and degradation. We have developed a sequential extraction and enrichment method for ECM proteins that is compatible with the subsequent liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) analysis of intact glycopeptides. The strategy is based on sequential incubations with NaCl, SDS for tissue decellularization, and guanidine hydrochloride for the solubilization of ECM proteins. Recent advances in LC-MS/MS include fragmentation methods, such as combinations of higher-energy collision dissociation (HCD) and electron transfer dissociation (ETD), which allow for the direct compositional analysis of glycopeptides of ECM proteins. In the present paper, we describe a method to prepare the ECM from tissue samples. The method not only allows for protein profiling but also the assessment and characterization of glycosylation by MS analysis.

This paper describes a methodology to prepare cardiovascular tissue samples for MS analysis that allows for (1) the analysis of ECM protein composition, (2) the identification of glycosylation sites, and (3) the compositional characterization of glycan forms. This methodology can be applied, with minor modifications, to the study of the ECM in other tissues.

細胞外マトリックスのグライコ：質量分析法を用いて無傷の糖ペプチドの分析のための方法

Fibrosis is a hallmark of many cardiovascular diseases and is associated with the exacerbated secretion and deposition of the extracellular matrix (ECM). ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages for identifying biologically active chemical structures that can modify complex phenotypes such as lifespan. Described here is a simple protocol for producing hundreds of 96-well culture plates with fairly consistent numbers of C. elegans in each well. Next, we specified how to use these cultures to screen thousands of chemicals for effects on the lifespan of the nematode C. elegans. This protocol makes use of temperature sensitive sterile strains, agar plate conditions, and simple animal handling to facilitate the rapid and high throughput production of synchronized animal cultures for screening.

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Here we describe a simple protocol for rapidly producing hundreds of nematode growth media agar, 96-well culture plates with consistent numbers of Caenorhhabditis elegans per well. These cultures are useful for the phenotypic screening of whole organisms. We focus here on using these cultures to screen chemicals for pro-longevity effects.

カエノラブディティス ・ エレガンスにおけるハイスループット化合物スクリーニングのための簡単な方法

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

Direct electrochemical detection of c-type cytochrome complexes embedded in the bacterial outer membrane (outer membrane c-type cytochrome complexes; OM c-Cyts) has recently emerged as a novel whole-cell analytical method to characterize the bacterial electron transport from the respiratory chain to the cell exterior, referred to as the extracellular electron transport (EET). While the pathway and kinetics of the electron flow during the EET reaction have been investigated, a whole-cell electrochemical method to examine the impact of cation transport associated with EET has not yet been established. In the present study, an example of a biochemical technique to examine the deuterium kinetic isotope effect (KIE) on EET through OM c-Cyts using a model microbe, Shewanella oneidensis MR-1, is described. The KIE on the EET process can be obtained if the EET through OM c-Cyts acts as the rate-limiting step in the microbial current production. To that end, before the addition of D2O, the supernatant solution was replaced with fresh media containing a sufficient amount of the electron donor to support the rate of upstream metabolic reactions, and to remove the planktonic cells from a uniform monolayer biofilm on the working electrode. Alternative methods to confirm the rate-limiting step in microbial current production as EET through OM c-Cyts are also described. Our technique of a whole-cell electrochemical assay for investigating proton transport kinetics can be applied to other electroactive microbial strains.

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

Here we present a protocol of whole-cell electrochemical experiments to study the contribution of proton transport to the rate of extracellular electron transport via the outer-membrane cytochromes complex in Shewanella oneidensis MR-1.

電気化学検出の重水素速度論的同位体効果シェワネラ oneidensis氏 1 の細胞外電子輸送

Direct electrochemical detection of c-type cytochrome complexes embedded in the bacterial outer membrane (outer membrane c-type cytochrome complexes; OM ...

Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this work, the pre-endosomal anthrax toxin is assembled and transitioned into the endosomal complex. First, the N-terminal domain of a cysteine mutant lethal factor (LFN) is attached to a biolayer interferometry (BLI) biosensor through disulfide coupling in an optimal orientation, allowing protective antigen (PA) prepore to bind (Kd 1 nM). The optimally oriented LFN-PAprepore complex then binds to soluble capillary morphogenic gene-2 (CMG2) cell surface receptor (Kd 170 pM), resulting in a representative anthrax pre-endosomal complex, stable at pH 7.5. This assembled complex is then subjected to acidification (pH 5.0) representative of the late endosome environment to transition the PAprepore into the membrane inserted pore state. This PApore state results in a weakened binding between the CMG2 receptor and the LFN-PApore and a substantial dissociation of CMG2 from the transition pore. The thio-attachment of LFN to the biosensor surface is easily reversed by dithiothreitol. Reduction on the BLI biosensor surface releases the LFN-PAprepore-CMG2 ternary complex or the acid transitioned LFN-PApore complexes into microliter volumes. Released complexes are then visualized and identified using electron microscopy and mass spectrometry. These experiments demonstrate how to monitor the kinetic assembly/disassembly of specific protein complexes using label-free BLI methodologies and evaluate the structure and identity of these BLI assembled complexes by electron microscopy and mass spectrometry, respectively, using easy-to-replicate sequential procedures.

Here we present a protocol to monitor the assembly and disassembly of the anthrax toxin using biolayer interferometry (BLI). Following assembly/disassembly on the biosensor surface, the large protein complexes are released from the surface for visualization and identification of components of the complexes using electron microscopy and mass spectrometry, respectively.

動的タンパク質複合体の分析の組み立てし、質量分析法と電子顕微鏡を用いた Biolayer 干渉法によるバイオ センサーから解放

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this ...

Measurement of Ion Concentration in the Unstirred Boundary Layer with Open Patch-Clamp Pipette: Implications in Control of Ion Channels by Fluid Flow

Fluid flow is an important environmental stimulus that controls many physiological and pathological processes, such as fluid flow-induced vasodilation. Although the molecular mechanisms for the biological responses to fluid flow/shear force are not fully understood, fluid flow-mediated regulation of ion channel gating may contribute critically. Therefore, fluid flow/shear force sensitivity of ion channels has been studied using the patch-clamp technique. However, depending on the experimental protocol, the outcomes and interpretation of data can be erroneous. Here, we present experimental and theoretical evidence for fluid flow-related errors and provide methods for estimating, preventing, and correcting these errors. Changes in junction potential between the Ag/AgCl reference electrode and bathing fluid were measured with an open pipette filled with 3 M KCl. Fluid flow could then shift the liquid/metal junction potential to approximately 7 mV. Conversely, by measuring the voltage shift induced by fluid flow, we estimated the ion concentration in the unstirred boundary layer. In the static condition, the real ion concentrations adjacent to the Ag/AgCl reference electrode or ion channel inlet at the cell-membrane surface can reach as low as approximately 30% of that in the flow condition. Placing an agarose 3 M KCl bridge between the bathing fluid and reference electrode may have prevented this problem of junction potential shifting. However, the unstirred layer effect adjacent to the cell membrane surface could not be fixed in this way. Here, we provide a method for measuring real ion concentrations in the unstirred boundary layer with an open patch-clamp pipette, emphasizing the importance of using an agarose salt-bridge while studying fluid flow-induced regulation of ion currents. Therefore, this novel approach, which takes into consideration the real concentrations of ions in the unstirred boundary layer, may provide useful insight on the experimental design and data interpretation related to fluid shear stress regulation of ion channels.

Mechanosensitive ion channels are often studied in terms of fluid flow/shear force sensitivity with patch-clamp recording. However, depending on the experimental protocol, the outcome on fluid flow-regulations of ion channels can be erroneous. Here, we provide methods for preventing and correcting such errors with a theoretical basis.

オープン パッチ ・ クランプのピペットで非撹拌の境界層におけるイオン濃度の測定: 流体によるイオン チャネルの制御の流れ

Fluid flow is an important environmental stimulus that controls many physiological and pathological processes, such as fluid flow-induced vasodilation. ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the structure-function relationship of these receptors in situ, we need to visualize and track them on the live cell surface with enough spatiotemporal resolution. Here we show how to use recently developed Lattice Light-Sheet Microscopy (LLSM) to image T-cell receptors (TCRs) four-dimensionally (4D, space and time) at the live cell membrane. T cells are one of the main effector cells of the adaptive immune system, and here we used T cells as an example to show that the signaling and function of these cells are driven by the dynamics and interactions of the TCRs. LLSM allows for 4D imaging with unprecedented spatiotemporal resolution. This microscopy technique therefore can be generally applied to a wide array of surface or intracellular molecules of different cells in biology.

The goal of this protocol is to show how to use Lattice Light-Sheet Microscopy to four-dimensionally visualize surface receptor dynamics in live cells. Here T cell receptors on CD4+ primary T cells are shown.

格子光シート顕微鏡による表面T細胞受容体ダイナミクスの可視化4次元的な研究

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. This method combines expression of proteins tagged with the fluorescent non-canonical amino acid ANAP, and FRET between ANAP and fluorescent (trinitrophenyl) nucleotide derivatives. We present examples of nucleotide binding to ANAP-tagged KATP ion channels measured in unroofed plasma membranes and excised, inside-out membrane patches under voltage clamp. The latter allows for simultaneous measurements of ligand binding and channel current, a direct readout of protein function. Data treatment and analysis are discussed extensively, along with potential pitfalls and artefacts. This method provides rich mechanistic insights into the ligand-dependent gating of KATP channels and can readily be adapted to the study of other nucleotide-regulated proteins or any receptor for which a suitable fluorescent ligand can be identified.

This protocol presents a method for measuring adenine nucleotide binding to receptors in real time in a cellular environment. Binding is measured as F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) between trinitrophenyl nucleotide derivatives and protein labeled with a non-canonical, fluorescent amino acid.

インタクトな機能的な膜タンパク質へのヌクレオチド結合をリアルタイムで測定

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

Transplantation of Neonatal Mouse Cardiac Macrophages into Adult Mice

In an injured neonatal myocardium, macrophages facilitate cardiomyocyte proliferation and angiogenesis and promote heart regeneration. The present study reveals that transplantation of neonatal cardiac macrophages recruited by injury promotes adult heart regeneration after myocardial infarction with improvement of cardiac function and cardiomyocyte proliferation. The results indicate that neonatal cardiac macrophage transplantation could be a promising strategy for cardiac injury treatment. Here, we provide the technical details, including the isolation of neonatal cardiac macrophages from apical resection-injured neonatal mouse hearts, the transplantation of macrophages into myocardial-infarcted adult mice, and the estimation of heart regeneration after a macrophage graft.

We provide a protocol for neonatal cardiac macrophage separation and transplantation into an adult mouse heart, which could be a promising way to promote cardiac repair.

成体マウスへの新生児マウス心臓マクロファージ移植

In an injured neonatal myocardium, macrophages facilitate cardiomyocyte proliferation and angiogenesis and promote heart regeneration. The present study ...

成体ラットから無傷の後根神経節上のパッチクランプ記録

要約

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時間分解エレクトロスプレーイオン化水素 - 重水素交換質量分析タンパク質の構造とダイナミクスを学ぶために

電圧クランプ

細胞外マトリックスのグライコ：質量分析法を用いて無傷の糖ペプチドの分析のための方法

カエノラブディティス・エレガンスにおけるハイスループット化合物スクリーニングのための簡単な方法

電気化学検出の重水素速度論的同位体効果シェワネラ oneidensis氏 1 の細胞外電子輸送

動的タンパク質複合体の分析の組み立てし、質量分析法と電子顕微鏡を用いた Biolayer 干渉法によるバイオセンサーから解放

オープンパッチ・クランプのピペットで非撹拌の境界層におけるイオン濃度の測定: 流体によるイオンチャネルの制御の流れ

格子光シート顕微鏡による表面T細胞受容体ダイナミクスの可視化4次元的な研究

インタクトな機能的な膜タンパク質へのヌクレオチド結合をリアルタイムで測定

成体マウスへの新生児マウス心臓マクロファージ移植

成体ラットから無傷の後根神経節上のパッチクランプ記録

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電圧クランプ

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カエノラブディティス ・ エレガンスにおけるハイスループット化合物スクリーニングのための簡単な方法

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動的タンパク質複合体の分析の組み立てし、質量分析法と電子顕微鏡を用いた Biolayer 干渉法によるバイオ センサーから解放

オープン パッチ ・ クランプのピペットで非撹拌の境界層におけるイオン濃度の測定: 流体によるイオン チャネルの制御の流れ

格子光シート顕微鏡による表面T細胞受容体ダイナミクスの可視化4次元的な研究

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成体マウスへの新生児マウス心臓マクロファージ移植

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