This study was supported by grants to M.A. from NCI (1RO1CA155091), NHLBI (1R21HL114074) and the Leukemia Research Foundation. M.A. is a recipient of V-Scholar award from the V- Foundation. Authors are thankful to Dr. Sara Rohrabaugh for editing.

注：このプロトコルのすべての手順は、動物の倫理的な治療とケア研究所健康のガイドラインに従って行われ、承認されたIACUC動物使用プロトコルに従って行った。 1.細胞株メンテナンス<ol><li> RPMI-1640培地中で培養BAF3細胞を、10％ウシ胎児血清およびペニシリン/ストレプトマイシン（100単位/ mlおよび100μg/ ml）およびWEHI細胞の使用済み培養培地を補充した。 10％ウシ胎児血清およびペニシリン/ストレプトマイシンを補充したDMEM中でHEK293T細胞を増殖させる（100単位/ mlおよび100μg/ ml）。 5％CO 2を含む加湿雰囲気中、37℃で細胞を維持する。 </li></ol> 2.プラスミドの構築<ol><li>マウスJAK2およびLRによるのpMSCV-puroを-GWにおけるその発癌アイソフォームJAK2-V617F標準の組換えクローニング手順を使用してクロナーゼのクローンを作成。 </li><li>ルシフェラーゼ発現ベクター（のpMSCV-リュック·チェリー-GW）の構築のために-VIで使用VOイメージング、プライマーを用いてPCRによりpLVX-はTet-ONベクターからのルシフェラーゼを増幅（LUC-SD / RP TTACAATTTGGACTTTCCGとLUC-SD / FP-CACCATGGAAGACGCCAAAAAC）が使用されているのpENTR-リュックを、生成するためのpENTR-SD-TOPO中にクローニングし、その後LRクロナーゼを使用して再結合を介したクローニングにより、レトロウイルスベクター、のpMSCV-チェリー-GW中のルシフェラーゼ遺伝子を転送する。 </li></ol>ランダム変異ライブラリの調製、突然変異をスクリーニングし、識別 3.1）ランダム突然変異誘発<ol><li> JAK2野生型および商業組換えクローニング技術を使用してのpMSCV-puroを-GWレトロウイルスベクターにV617F変異のクローンの全長。 </li><li>変換するためにJAK2-V617FプラスミドDNAの1μgのを使用し、XL-1レッド、E.従って、それらは、複製中にランダム突然変異を導入する可能DNA修復機構における欠陥がある大腸菌細胞 、。より具体的には、50ミックス - 100ngのDNAを10（DNA 100 ng以上の形質転換効率を低下させる）0あらかじめ冷却ポリプロピレンチューブ中のコンピテントセルのμL、静かに5分毎に渦巻く、30分間氷上でインキュベートした。良いライブラリカバレッジの場合は、コンピテントセルの四から六の管を使用しています。 注：DNAの100以上のngは、変換効率が低下する</li><li> 45秒間のヒートショックを42℃の水浴中でチューブを浸漬し、2分間氷上でインキュベートする。次いで、SOC培地1ml（2.0％トリプトン、0.5％酵母エキス、0.05％のNaCl、10mMのMgCl 2を、10mMの硫酸マグネシウム、および0.4％D-グルコース）を追加。 90分間の225から250 rpmで振とうしながら、37℃でチューブをインキュベートします。 </li><li> 100μg/ mlのアンピシリンを含む4 10センチメートルLB寒天プレート上に各チューブからプレートの細胞。 37℃で24時間 - 16プレートをインキュベートします。 </li><li>目に見えるコロニーに続いて、無菌のプレートスクレーパーでプレートをこすることによってそれらを収集。各プレートからのプール細胞および市販のプラスミド抽出キットを用いてプラスミドDNAを単離する。 注：通常のコロニーが小さく、なるように18〜24時間を取る目に見えるこれらは成長の遅い細菌の菌株であるため。この段階では、そのようなSau3A1またはTaq1または配列決定などの頻繁なカッターで制限消化によりライブラリ内の変異の不均一性を評価する。 </li></ol>レトロウイルス上清および形質導入の3.2）生産<ol><li>トランスフェクションの1日、プレートを10％FCS、ペニシリン/ストレプトマイシン、および2mM L-グルタミンを含むDMEM 100 10cm皿上に4×10 6個のHEK 293T細胞の前。 </li><li>次の日、培地を交換し、変異誘発のpMSCV-JAK2-V617Fライブラリで細胞をトランスフェクト。各10cmプレートの場合は、無血清DMEM培地を用いて、400μlの総体積にトランスフェ40μlのDNAを10μg（プラスミドライブラリー5μgのレトロウイルスパッケージングプラスミド5μgの、pCLEco）を混ぜる。室温で20分間、DNAおよび脂質ミックスをインキュベートする。 20分後HEK293T細胞の上に賢明なDNA-脂質複雑なドロップを追加します。 </li><li> 6時間後、トランスフェクション培地ワットを変更するi番目の新鮮な培地には、ウイルス産生のために、37℃で48時間プレートをインキュベートし。インキュベーションの48時間後に、0.45μmのアクロディスクフィルターを通して濾過し、ウイルス上清を集め。 </li></ol> インビトロでの耐性クローンの3.3）の選択<ol><li>薬剤耐性JAK2-V617F変異体の場合は、0.5〜1×10 6のウイルス力価を持つウイルス上清100mlで億BaF3細胞に形質導入する。より具体的には、10％血清を含むRPMI培地を用いて300ミリリットルの全体積のウイルス上清を100ml、及びpolybereneの24μg/ mlの（ploybereneの最終濃度を8μg/ mlである）と10 8細胞を混合する。複数で6ウェルプレート（4-5 1mlあたりをよく）これらのセルミキサを配布します。 </li><li> 25℃で90分間1250×gでプレートを遠心。遠心分離後、24時間、37℃でプレートをインキュベートする。 </li><li>次の日、一緒に細胞をプールし、Ruxolitinibと媒体が柔らかい寒天を含むと混合し、Si中のメッキxのウェルプレート。各薬物濃度について、50mlチューブ中Ruxolitinib適当量の形質導入されたBAF3細胞（10〜20万個の細胞）を10mlを混合する。 20％血清を含むRPMIを用いて40mlまでボリュームを構成する。 mixcarefullyとプレート6ウェルプレートで、細胞に1.2％寒天の10ミリリットルを追加します。 </li><li> 2週間、37℃でプレートをインキュベートする。 3-4日ごとに個別に24ウェルプレートで0.2ミリリットルのピペットチップを使用して、耐性コロニーとサブカルチャー、それらを選択します。 </li><li>室温で5分間、450×gで遠心分離することによって耐性BAF3細胞を採取する。商業ゲノムDNA単離キットを用いてゲノムDNAを単離する。 PCRはプライマー（mJAK2FP-ATGGCCTGCCTTACAATGACAGとmJAK2RP-GGTTCTGGAAGTCTGCTTGG）を使用して、100ngのゲノムDNAから完全長JAK2 cDNAを増幅し、長期テンプレートは、高忠実度PCRシステムを展開します。 </li><li>アガロースゲル電気泳動でPCR産物を分離する。 JAK2コーディングフレームを表すDNAバンドの3.4キロバイトを切除し、DNAを単離商業ゲル抽出キットを用いて。シーケンス8内部プライマー（P1 - P8）を使用して、cDNAの全長市販のソフトウェアを使用して、コード配列にまたがる、分析シーケンスを。 </li></ol>耐性変異のインビトロ検証4. 多くの細胞クローンは、耐性表現型の各突然変異の寄与を試験するテンプレートとしてのpMSCV-JAK2V-617Fのプラスミドを用いて部位特異的突然変異誘発によって選択された変異体を作製するために、二つ以上の突然変異を有する。 <ol><li>商業誘発キットおよび点突然変異を作成するために設計されたオリゴヌクレオチドを​​使用してのpMSCV-JAK2-V617Fプラスミド上の部位特異的突然変異誘発を行います。配列決定によって変異体クローンのアイデンティティを確認してください。 </li><li>レトロウイルスBAF3細胞を形質導入する変異体プラスミドを用いて作らを1μg/ mlのピ​​ューロマイシンを用いた選択を行った。 </li><li>プレート10 4 BAF3-JAK2-V617F細胞（10％FCSを含むRPMIの50μl）を96ウェルプレートの各ウェルに。独立した37℃で60時間プレートを（0、1、3、5、10、及び20μMの最終濃度）とインキュベートlyがプレート全体でウェルにruxolitinib含有培地50μlを添加する。 </li><li>よく2-4時間、37℃でのインキュベーションに続いてそれぞれにWST-1試薬を10μl添加することにより、細胞の生存率を評価する。プレートリーダーを用いてA450でのレコード吸光度。三連とプロット内のすべてのアッセイを行うINCB018424濃度に対して吸光度を平均した。非線形カーブフィッティングアルゴリズムを使用して、最高のフィットS字曲線を実行します。携帯IC50として50％の細胞生存率の結果として薬物濃度をスコア。 </li><li>次に、ruxolitinibの濃度を増加させ、37℃で4-6時間インキュベートし、10％血清を含むRPMI培地中で6ウェルプレート中のJAK2変異体を発現するプレート600万BAF3細胞。 </li><li> 4℃で5分間450×gでの遠心分離によって細胞を収集します。 PBSで細胞を一度洗浄し、そして20mMのトリス-Cl（pH7.5）中で溶解、50のNaCl、1％NP-40、0.1％SDS、5mMのEDTA、1mMのEGTA、1mMのフッ化ナトリウム、2mMのナトリウムバナジウム、および5％グリセロール、プロテアーゼ阻害剤カクテルおよびホスファターゼ阻害剤を補充した。 5×ゲルローディング緩衝液（350mMのトリス-HCl [pH6.8の]、続いて1分間の細胞懸濁液を超音波処理し、500mMのDTT、15％SDS、10mMのベンザミジン、5mMのEDTA、5mMのEGTA、5mMのナトリウムバナジン、5〜10分間70℃でプロテアーゼカクテル、50％グリセロール、および0.001％ブロモフェノールブルー）および変性。 </li><li>変性条件下で、8％SDSポリアクリルアミドゲル上のタンパク質を解決する。マウスモノクローナル抗phopsho STAT5を用いたイムノ実行します。ブロットをストリップし、ウサギポリクローナル抗SATA5抗体で再プローブした。供給業者の推奨に従って、ECL試薬を用いてバンドを可視化。 </li></ol> 生体内の検証5. <ol><li>のpMSCVリュック·シェールから作られたレトロウイルスで形質導入（ルシフェラーゼと桜を表現するBaF3細胞を形質導入JAK2-V617Fと耐性変異体を発現するウイルスとRY GW）。 JAK2とその抵抗変異体の発現のためのピューロマイシン選択後に生存している細胞を選択します。 </li><li>尾静脈注射により 6 Balb / CマウスにPBSを200μlのJAK2-V617Fとその耐性変異を運ぶ200万活発に成長BAF3リュック/桜の細胞を注入する。 </li><li>細胞移植の3日後、二週間1日2回Ruxolitinibた（100mg / kg）をマウスに注射する。 </li><li>イメージング·システムとルシフェラーゼベースの生物発光イメージングを行います。 。 <ol><li>簡潔には、滅菌脱イオン水25ml、小さな体積およびストア内のアリコートには300mgを溶解することによりルシフェリン溶液を調製。 注：-80℃で保存ルシフェリンと使用まで光から保護する。 </li><li>各マウスで125 mg / kgをを達成するためにIPによって各マウスに250μlのを注入。一緒に密封されたボックス内の吸入イソフルラン（1.5％-2.0％）を使用して、同じ群のマウスを麻酔。目の上の獣医軟膏を適用します乾燥を防ぐために、電子の目。 注：スリープ状態にしたマウスにかかる時間（10〜15分）ルシフェリン活動がピークに達することができました。変動を避けるために、グループ間の一貫性のある時間をおいてください。 </li></ol></li><li>イメージング室ステージにすぐにマウスを移し、イメージング手順の間1.5から2パーセントのイソフルランで麻酔を維持。シーケンシャル0.1、0.5、1、5、30、60、300秒の露光で画像マウス。画像を撮影し、画像取得及び分析ソフトウェアを用いて生物発光強度を定量する。イメージングは​​、そのケージに戻ってマウスを返すの後。 </li><li> 、in vivoでのキメラ現象の収穫総bonemarrow細胞について。頸椎脱臼で追跡5分間CO 2でマウスを安楽死させる。骨髄を収集するために4ミリリットルの冷PBSで骨やクラッシュを収穫する。蛍光顕微鏡下でのパーセント桜陽性細胞を分析し、FACSを用いて定量化する。各サンプルから2万イベントを収集。 </li></ol>

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No conflicts of interest declared.

臨床的再発と標的遺伝子中の薬剤耐性突然変異の出現：CMLの治療におけるイマチニブの臨床的成功は、小分子阻害剤による頬紅キナーゼを標的とする可能性が、標的療法のも明らかに限定するものではないだけを示した。耐性変異の同定は、より良い臨床管理及び次世代阻害剤の開発に役立つ。このプロトコルは、標的遺伝子に薬剤耐性変異を同定するための方法論を説明しています。この?...

プロテインキナーゼは、一見したところ、すべての細胞の機能を調節する細胞内シグナル伝達経路の重要な調節酵素である。キナーゼを介したシグナル伝達を適切に制御するには、主に、UPSによるキナーゼ、ホスファターゼ及びその分解の適切なレギュレーション（ユビキチンプロテアソーム系）に依存している恒常性と開発、非常に重要です。脱調節キナーゼは、多くの癌のセンターステージにあり、ヒト疾患1のホストに関与。ヒトゲノムは、〜400ヒト疾患2に、直接的または間接的にリンクされている500以上のタンパク質キナーゼをコードする。これらの観察は、小分子阻害剤3-5によるキナーゼの治療標的化のための概念を支 ​​持した。 慢性骨髄性白血病（CML）の治療におけるこのようなイマチニブのようなABLキナーゼ阻害剤、の実証は、このアプローチ6,7のための概念の証拠を提供した。この観察だけでなく、アリに革命をもたらしI-キナーゼ療法だけでな​​く、骨髄増殖性新生物（MPN）で真性多血症（PV）と患者からJAK2における発癌性変異の発見につながる治療標的化のための他の腫瘍性疾患、遺伝的病変を識別するためのアイデアを施行。この発見は、小分子キナーゼ阻害剤とJAK2を標的とすることによりMPNsの治療に大きな関心を生成した。今、JAK2阻害剤のほとんどダースは、臨床試験中であり、そのうちの一つは、骨髄線維症の治療のために最近承​​認された。癌における小分子阻害剤による発癌性キナーゼの特異的ターゲティングは有望な結果をもたらすが、それはまた、治療に対する耐性を発現苦しむ。実際には、これまでのところ、そのようなイマチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブおよびダサチニブのようなキナーゼ阻害剤で治療した患者は、大部分の薬物は、8-10をターゲットとするために、キナーゼドメインにおける変異を取得することにより、耐性変異を開発した。遺伝子突然変異の結果として抵抗がo制限を強調fは発癌性キナーゼに対する単剤療法を目標とし、これまで以上に成功した癌化学療法の開発の次の挑戦を表します。薬剤耐性の機構および機能的結果を選択し、薬剤開発のための無料の化合物の設計のための根拠を提供するべきである。 in vitroでの画面を使用して同定された変異は、患者に見られるものとの高度の相関を示している。したがって、臨床的再発を引き起こす可能性がある耐性パターンを識別するのに臨床的または前臨床開発を支援における所与の薬物標的のペアのための薬剤耐性を付与する変異をin vitroスクリーニング。これらの変異型を同定するだけでなく、薬物反応および再発について患者をモニタリングするのに役立つだけでなく、より強固な次世代阻害剤の設計のために必須である。たとえば、次の世代BCR / ABL阻害剤、ニロチニブとPonatinibの開発は、理由も大きいメックに可能作られたhanistic理解は、突然変異誘発、構造的、および機能的研究から得られた。 以前、我々はそのようなイマチニブ11,12、PD166326 12、及びAP24163 13と阻害剤に対する耐性を付与する変異のスペクトルを明らかにするために、BCR / ABLのランダム突然変異誘発を用いて私たちのスクリーニングの結果を報告している。結果は、臨床的な抵抗および疾患再発を付与する変異を同定し、だけでなく、薬剤耐性及びキナーゼ機能11,14を支配する原則のメカニズムの理解を提供するだけでなく。ここでは、このスクリーニング戦略のより広範な適用を可能にするために、薬物標的対としてRuxolitinibおよびJAK2を使用して、追加の方法論の詳細を提供する。

<table><tbody><tr><td>Cell and Tissue culture&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BaF3 Cells</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK293T cells</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMSCV-JAK2-V617F-puro.GW</td><td>A gift from Ross Levine</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMSCV-JAK2-V617F/Y931C.GW</td><td>Made in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMSCV-JAK2-V617F/L983F.GW</td><td>Made in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMSCV-JAK2-V617F/P58A.GW</td><td>Made in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMSCV-V617F-Cherry.GW</td><td>Made in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMSCV-JAK2-V617F/Y931C-cherry.GW</td><td>Made in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMSCV-JAK2-V617F/L983F-cherry.GW</td><td>Made in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMSCV-Luciferase-puro.GW</td><td>Made in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Cellgro (corning)</td><td>15-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro (corning)</td><td>15-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Penn/Strep</td><td>Cellgro (corning)</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta biological</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin EDTA 1X</td><td>Cellgro (corning)</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Cellgro (corning)</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Cellgro (corning)</td><td>25-005-CL</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Gibco (life technologies)</td><td>A11138-03</td><td></td></tr><tr><td>Protamine sulfate</td><td>Sigma</td><td>P3369</td><td>5 mg/ml stock in water</td></tr><tr><td>Trypan Blue solution (0.4%)</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Cellgro (corning)</td><td>25-950-CQC</td><td></td></tr><tr><td>INCB018424 (Ruxolitinib)</td><td>ChemieTeK</td><td>941678-49-5</td><td></td></tr><tr><td>WST-1</td><td>Roche</td><td>11644807001</td><td></td></tr><tr><td>0.45 micron disc filter</td><td>PALL</td><td>2016-10</td><td></td></tr><tr><td>70 micron nylon cell strainer</td><td>Becton Dickinson</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Bacterial Culture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>XL-1 red &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; cells</td><td>Agilent Tech</td><td>200129</td><td></td></tr><tr><td>SOC</td><td>New England Biolabs</td><td>B90920s</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma</td><td>A0166</td><td>100 mg/ml stock solution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Bacto agar</td><td>Difco</td><td>214050</td><td></td></tr><tr><td>Terrific broth</td><td>Becton Dickinson</td><td>243820</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Genemate</td><td>E-3119-500</td><td></td></tr><tr><td>Kits</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dneasy Blood&amp;amp; tissue kit</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td></td></tr><tr><td>Expand long template PCR system</td><td>Roche</td><td>1168134001</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Sv gel and PCR clean up system</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td></td></tr><tr><td>Pure Yield plasmid mini prep system</td><td>Promega</td><td>A1222</td><td></td></tr><tr><td>PCR Cloning System with Gateway Technology with pDONR 221 &amp;amp; OmniMAX 2 Competent Cells</td><td>Invitrogen</td><td>12535029</td><td></td></tr><tr><td>Gateway&amp;nbsp; LR Clonase Enzyme mix&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11791019</td><td></td></tr><tr><td>Mouse reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vivo-Glo Luciferin in-vivo Grade</td><td>Promega</td><td>P1043</td><td></td></tr><tr><td>1/2 cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2</td><td>Becton Dickinson</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>Mortor pestle</td><td>Coor tek&amp;nbsp;</td><td>60316 and 60317</td><td></td></tr><tr><td>Isoflorane (Isothesia TM)</td><td>Butler Schien</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NAPCO series 8000 WJ CO2 incubator</td><td>Thermo scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Swing bucket rotor centrifuge 5810R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TC-10 automated cell counter</td><td>Bio-RAD</td><td></td><td>This is not necessary, one can use standard hemocytomemetr for cell counting</td></tr></tbody></table>

a method for screening and validation of resistant mutations against kinase inhibitors

慢性骨髄性白血病（CML）におけるドライバ癌遺伝子としてBCR / ABLの発見は、実際には、効果的にCML患者の治療によって癌におけるキナーゼを標的とする可能性を示し、イマチニブの開発をもたらした。この観察は、EGFR、B-RAF、KIT及びPDGFRs、のような様々な他の悪性腫瘍に関与する発癌性キナーゼを標的とする薬剤の開発に革命をもたらした。しかしながら、抗キナーゼ療法の一つの主要な欠点​​は、薬物に対する親和性を減少または消失しているターゲットをレンダリングする薬剤耐性突然変異の出現である。耐性変異体で採用のメカニズムを理解することは、次世代の阻害剤の開発に役立つだけでなく、パーソナライズされた薬を使用する臨床管理に弾みを与えていないだけ。我々は、次の世代BCR / ABL阻害剤の開発に役立っているBCR / ABLの抵抗付与突然変異のスペクトルを識別するためのレトロウイルスベクターベースのスクリーニング戦略を報告した。 Ruxoliの使い方薬剤標的ペアとしてtinibとJAK2は、ここでは、JAK2キナーゼのランダム変異のライブラリーを発現するマウスBAF3細胞を利用vitroスクリーニング方法で説明します。

遺伝子変異の出現は、目標と抗キナーゼ療法のための大きな課題を提起する。突然変異研究は、選択次世代薬物開発の設計に尽力している機構的及び機能的洞察を提供することに加えて、より良い臨床管理を可能にし、将来的にパーソナライズされた治療のために、より有用であろう。この実験では、JAK2-V617Fキナーゼでruxolitinib耐性変異（ 図1）のスクリーニングを示した。私た...

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A Method for Screening and Validation of Resistant Mutations Against Kinase Inhibitors

キナーゼ阻害剤治療に対する遺伝的抵抗性の出現は、効果的な癌治療のための重要な課題を提起する。新たに開発された薬剤に対して耐性変異の同定および特徴は、より良い臨床管理、次世代薬剤設計に役立ちます。ここでは、in vitroスクリーニングおよび耐性変異の検証のために私たちのプロトコルを記述します。

キナーゼ阻害剤に対して耐性変異のスクリーニングおよび検証のための方法

The discovery of BCR/ABL as a driver oncogene in chronic myeloid leukemia (CML) resulted in the development of Imatinib, which, in fact, demonstrated the ...

a-method-for-screening-validation-resistant-mutations-against-kinase

Research

JoVE Journal

Biology

14.8K ビュー.  Cincinnati Children's Hospital Medical Center. キナーゼ阻害剤治療に対する遺伝的抵抗性の出現は、効果的な癌治療のための重要な課題を提起する。新たに開発された薬剤に対して耐性変異の同定および特徴は、より良い臨床管理、次世代薬剤設計に役立ちます。ここでは、in vitroスクリーニングおよび耐性変異の検証のために私たちのプロトコルを記述します。 

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Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering allosteric details of their regulation. Kinases comprise signaling networks whose defects are often hallmarks of multiple forms of cancer and related diseases, making an assay platform amenable to manipulation of upstream regulatory factors and validation of reaction requirements critical in the search for improved therapeutics. Here, we describe a basic kinase assay that can be easily adapted to suit specific experimental questions including but not limited to testing the effects of biochemical and pharmacological agents, genetic manipulations such as mutation and deletion, as well as cell culture conditions and treatments to probe cell signaling mechanisms. This assay utilizes radiolabeled [&#947;-32P] ATP, which allows for quantitative comparisons and clear visualization of results, and can be modified for use with immunoprecipitated or recombinant kinase, specific or typified substrates, all over a wide range of reaction conditions.

Protein kinases are highly evolved signaling enzymes and scaffolds that are critical for inter- and intracellular signal transduction. We present a protocol for measuring kinase activity through the use of radiolabeled adenosine triphosphate ([&#947;-32P] ATP), a reliable method to aid in elucidation of cellular signaling regulation.

放射性標識ATPによるタンパク質キナーゼ活性のアッセイ

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

生化学

Assessment of Resistance to Tyrosine Kinase Inhibitors by an Interrogation of Signal Transduction Pathways by Antibody Arrays

Cancer patients with an aberrant regulation of the protein phosphorylation networks are often treated with the tyrosine kinase inhibitors. Response rates approaching 85% are common. Unfortunately, patients often become refractory to the treatment by altering their signal transduction pathways. An implementation of the expression profiling with microarrays can identify the overall mRNA-level changes, and proteomics can identify the overall changes in protein levels or can identify the proteins involved, but the activity of the signal transduction pathways can only be established by interrogating post-translational modifications of the proteins. As a result, the ability to identify whether a drug treatment is successful or whether resistance arose, or the ability to characterize any alterations in the signaling pathways, is an important clinical challenge. Here, we provide a detailed explanation of antibody arrays as a tool which can identify system-wide alterations in various post-translational modifications (e.g., phosphorylation). One of the advantages of using antibody arrays includes their accessibility (an array does not require either an expert in proteomics or costly equipment) and speed. The availability of arrays targeting a combination of post-translational modifications is the primary limitation. In addition, unbiased approaches (phosphoproteomics) may be more suitable for the novel discovery, whereas antibody arrays are ideal for the most widely characterized targets.

Here, we present a protocol for antibody arrays to identify alterations in signaling pathways in various cellular models. These changes, caused by drugs/hypoxia/ultra-violet light/radiation, or by overexpression/downregulation/knockouts, are important for various disease models and can indicate whether a therapy will be effective or can identify mechanisms of drugs resistance.

抗体のアレイによるシグナル伝達経路の尋問でチロシンキナーゼ阻害剤に対する抵抗性の評価

Cancer patients with an aberrant regulation of the protein phosphorylation networks are often treated with the tyrosine kinase inhibitors. Response rates ...

がん研究

Methods for Evaluating the Role of c-Fos and Dusp1 in Oncogene Dependence

The demonstration of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in treating chronic myeloid leukemia (CML) has heralded a new era in cancer therapeutics. However, a small population of cells does not respond to TKI treatment, resulting in minimal residual disease (MRD); even the most potent TKIs fail to eradicate these cells. These MRD cells serve as a reservoir to develop resistance to therapy. Why TKI treatment is ineffective against MRD cells is not known. Growth factor signaling is implicated in supporting the survival of MRD cells during TKI treatment, but a mechanistic understanding is lacking. Recent studies demonstrated that an elevated c-Fos and Dusp1 expression as a result of convergent oncogenic and growth factor signaling in MRD cells mediate TKI resistance. The genetic and chemical inhibition of c-Fos and Dusp1 renders CML exquisitely sensitive to TKIs and cures CML in both genetic and humanized mouse models. We identified these target genes using multiple microarrays from TKI-sensitive and -resistant cells. Here, we provide methods for target validation using in vitro and in vivo mouse models. These methods can easily be applied to any target for genetic validation and therapeutic development.

Here, we describe protocols for the genetic and chemical validation of c-Fos and Dusp1 as a drug target in leukemia using in vitro and in vivo genetic and humanized mouse models. This method can be applied to any target for genetic validation and therapeutic development.

C-fos の役割と Dusp1 の遺伝子依存性の評価方法

The demonstration of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in treating chronic myeloid leukemia (CML) has heralded a new era in cancer therapeutics. However, ...

Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods

The rapidly accelerated fibrosarcoma (RAF) family kinases play a central role in cell biology and their dysfunction leads to cancers and developmental disorders. A characterization of disease-related RAF mutants will help us select appropriate therapeutic strategies for treating these diseases. Recent studies have shown that RAF family kinases have both catalytic and allosteric activities, which are tightly regulated by dimerization. Here, we constructed a set of practical and feasible methods to determine the catalytic and allosteric activities and the relative dimer affinity/stability of RAF family kinases and their mutants. Firstly, we amended the classical in vitro kinase assay by reducing the detergent concentration in buffers, utilizing a gentle quick wash procedure, and employing a glutathione S-transferase (GST) fusion to prevent RAF dimers from dissociating during purification. This enables us to measure the catalytic activity of constitutively active RAF mutants appropriately. Secondly, we developed a novel RAF co-activation assay to evaluate the allosteric activity of kinase-dead RAF mutants by using N-terminal truncated RAF proteins, eliminating the requirement of active Ras in current protocols and thereby achieving a higher sensitivity. Lastly, we generated a unique complementary split luciferase assay to quantitatively measure the relative dimer affinity/stability of various RAF mutants, which is more reliable and sensitive compared to the traditional co-immunoprecipitation assay. In summary, these methods have the following advantages: (1) user-friendly; (2) able to carry out effectively without advanced equipment; (3) cost-effective; (4) highly sensitive and reproducible.

In this article, we presented a set of practical and feasible methods for characterizing disease-related mutants of RAF family kinases, which include in vitro kinase assay, RAF co-activation assay, and complementary split luciferase assay.

実用的で実現可能な方法のセットを使用してRAFファミリーキナーゼの疾患関連変異体を特徴付けます

The rapidly accelerated fibrosarcoma (RAF) family kinases play a central role in cell biology and their dysfunction leads to cancers and developmental ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important roles for the cell and may unravel new cellular processes. Among proteins, kinases are major actors as they belong to cell signaling pathways and have the ability to switch on or off many processes crucial to the fate of the cell, such as cell growth, division, differentiation, motility, and death.
In this study, we focused on a new potential kinase protein, LIMK2-1. We demonstrated its existence by Western Blot using a specific antibody. We evaluated its interaction with an upstream regulating protein using coimmunoprecipitation experiments. Coimmunoprecipitation is a very powerful technique able to detect the interaction between two target proteins. It may also be used to detect new partners of a bait protein. The bait protein may be purified either via a tag engineered to its sequence or via an antibody specifically targeting it. These protein complexes may then be separated by SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel) and identified using mass spectrometry. Immunoprecipitated LIMK2-1 was also used to test its kinase activity in vitro by &#947;[32P] ATP labeling. This well-established assay may use many different substrates, and mutated versions of the bait may be used to assess the role of specific residues. The effects of pharmacological agents may also be evaluated since this technique is both highly sensitive and quantitative. Nonetheless, radioactivity handling requires particular caution. Kinase activity may also be assessed with specific antibodies targeting the phospho group of the modified amino acid. These kinds of antibodies are not commercially available for all the phospho modified residues.

We characterized a new kinase protein using robust biochemical approaches: Western Blot analysis with a dedicated specific antibody on different cell lines and tissues, interactions by coimmunoprecipitation experiments, kinase activity detected by Western Blot using a phospho-specific antibody and by &#947;[32P] ATP labeling.

新しいキナーゼタンパク質の堅牢な生化学的アプローチを用いて分子レベルでの特性解析

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with clinical implications. Several methodologies have been reported to accomplish such screening. However, each has its own limitations (e.g., the screening of only ATP analogues, restriction to using purified kinase domains, significant costs associated with testing more than a few kinases at a time, and lack of flexibility in screening protein kinases with novel mutations). Here, a new protocol that overcomes some of these limitations and can be used for the unbiased screening of kinase inhibitors is presented. A strength of this method is its ability to compare the activity of kinase inhibitors across multiple proteins, either between different kinases or different variants of the same kinase. Self-assembled protein microarrays generated through the expression of protein kinases by a human-based in vitro transcription and translation system (IVTT) are employed. The proteins displayed on the microarray are active, allowing for measurement of the effects of kinase inhibitors. The following procedure describes the protocol steps in detail, from the microarray generation and screening to the data analysis.

A detailed protocol for the generation of self-assembled human protein microarrays for the screening of kinase inhibitors is presented.

自己組み立てヒトタンパク質マイクロアレイにおけるキナーゼ阻害剤スクリーニング

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

Pre-clinical Evaluation of Tyrosine Kinase Inhibitors for Treatment of Acute Leukemia

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are attractive druggable therapeutic targets. Here we describe an efficient four-step strategy for pre-clinical evaluation of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in the treatment of acute leukemia. Initially, western blot analysis is used to confirm target inhibition in cultured leukemia cells. Functional activity is then evaluated using clonogenic assays in methylcellulose or soft agar cultures. Experimental compounds that demonstrate activity in cell culture assays are evaluated in vivo using NOD-SCID-gamma (NSG) mice transplanted orthotopically with human leukemia cell lines. Initial in vivo pharmacodynamic studies evaluate target inhibition in leukemic blasts isolated from the bone marrow. This approach is used to determine the dose and schedule of administration required for effective target inhibition. Subsequent studies evaluate the efficacy of the TKIs in vivo using luciferase expressing leukemia cells, thereby allowing for non-invasive bioluminescent monitoring of leukemia burden and assessment of therapeutic response using an in vivo bioluminescence imaging system. This strategy has been effective for evaluation of TKIs in vitro and in vivo and can be applied for identification of molecularly-targeted agents with therapeutic potential or for direct comparison and prioritization of multiple compounds.

Receptor tyrosine kinases are ectopically expressed in many cancers and have been identified as therapeutic targets in acute leukemia. This manuscript describes an efficient strategy for pre-clinical evaluation of tyrosine kinase inhibitors for the treatment of acute leukemia.

急性白血病の治療のためのチロシンキナーゼ阻害剤の前臨床評価

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are ...

医学

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical specimens, have been applied to uncover these resistance mechanisms to facilitate follow-up care. Although these approaches have led to clinically relevant discoveries, difficulties in attaining the relevant patient material or in deconvoluting the genomic data collected from these specimens have severely hampered the path towards a cure. To this end, we here describe a tool for expeditious discovery that may guide improvement in first-line therapies and alternative clinical management strategies. By coupling preclinical in vitro or in vivo drug selection with next-generation sequencing, it is possible to identify genomic structural variations and/or gene expression alterations that may serve as functional drivers of resistance. This approach facilitates the spontaneous emergence of alterations, enhancing the probability that these mechanisms may be observed in the patients. In this protocol we provide guidelines to maximize the potential for uncovering single nucleotide variants that drive resistance using adherent lines.

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Drug resistance to targeted therapeutics is widespread and the need to identify mechanisms of resistance--prior to or following clinical onset--is critical for guiding alternative clinical management strategies. Here, we present a protocol to couple derivation of drug-resistant lines in vitro with sequencing to expedite discovery of these mechanisms.

の実装<em&gt;インビトロ</em&gt;薬剤耐性アッセイ：臨床的に関連性のメカニズムを暴くための可能性を最大化

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical ...

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a GTPase domain (termed ROC, for Ras of Complex proteins) and a kinase domain1. The discovery in 2004 of mutations in LRRK2 that cause Parkinson's disease (PD) resulted in LRRK2 being the focus of a huge volume of research into its normal function and how the protein goes awry in the disease state2,3. Initial investigations into the function of LRRK2 focused on its enzymatic activities4-6. Although a clear picture has yet to emerge of a consistent alteration in these due to mutations, data from a number of groups has highlighted the importance of the kinase activity of LRRK2 in cell death linked to mutations7,8. Recent publications have reported inhibitors targeting the kinase activity of LRRK2, providing a key experimental tool9-11. In light of these data, it is likely that the enzymatic properties of LRRK2 afford us an important window into the biology of this protein, although whether they are potential drug targets for Parkinson's is open to debate.
A number of different approaches have been used to assay the kinase activity of LRRK2. Initially, assays were carried out using epitope tagged protein overexpressed in mammalian cell lines and immunoprecipitated, with the assays carried out using this protein immobilised on agarose beads4,5,7. Subsequently, purified recombinant fragments of LRRK2 in solution have also been used, for example a GST tagged fragment purified from insect cells containing residues 970 to 2527 of LRRK212. Recently, Dani&euml;ls et al. reported the isolation of full length LRRK2 in solution from human embryonic kidney cells, however this protein is not widely available13. In contrast, the GST fusion truncated form of LRRK2 is commercially available (from Invitrogen, see table 1 for details), and provides a convenient tool for demonstrating an assay for LRRK2 kinase activity. Several different outputs for LRRK2 kinase activity have been reported. Autophosphorylation of LRRK2 itself, phosphorylation of Myelin Basic Protein (MBP) as a generic kinase substrate and phosphorylation of an artificial substrate - dubbed LRRKtide, based upon phosphorylation of threonine 558 in Moesin - have all been used, as have a series of putative physiological substrates including &alpha;-synuclein, Moesin and 4-EBP14-17. The status of these proteins as substrates for LRRK2 remains unclear, and as such the protocol described below will focus on using MBP as a generic substrate, noting the utility of this system to assay LRRK2 kinase activity directed against a range of potential substrates.

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 is a large multidomain kinase, mutations in which are the most common genetic cause of Parkinson's disease. Analysis of the kinase activity of this protein has proven to be a crucial tool in understanding the biology and dysfunction of this protein. In this paper, in vitro assaying of the kinase activity of LRRK2 and a selection of its mutants is described, providing an experimental system to examine phosphorylation of putative substrates and potential dysfunction of LRRK2 in disease.

LRRK2のキナーゼ活性を測定する in vitroで</em

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a ...

生物学

Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

The T-cell receptor (TCR) signaling pathway comprises a multitude of mediators that transmit signals upon the activation of the TCR. Different strategies have been proposed and implemented for the identification of new mediators of TCR signaling, which would improve the understanding of T-cell processes, including activation and thymic selection. We describe a screening assay that enables the identification of molecules that influence TCR signaling based on the activation of developing thymocytes. Strong TCR signals cause developing thymocytes to activate apoptotic machinery in a process known as negative selection. Through the application of kinase inhibitors, those with targets that affect TCR signaling are able to override the process of negative selection. The method detailed in this paper can be used to identify inhibitors of canonical kinases with established roles in the TCR signaling pathways and also inhibitors of new kinases yet to be established in the TCR signaling pathways. The screening strategy here can be applied to screens of higher throughput for the identification of novel druggable targets in TCR signaling.

Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

This paper uses a flow-cytometry-based assay to screen libraries of chemical inhibitors for the identification of inhibitors and their targets that influence T-cell receptor signaling. The methods described here can also be expanded for high-throughput screenings.

T 細胞受容体を介してライブラリ化学阻害剤のスクリーニングのメディエーターの同定

The T-cell receptor (TCR) signaling pathway comprises a multitude of mediators that transmit signals upon the activation of the TCR. Different strategies ...