当社のハイスループットアッセイは、TCRシグナル伝達とT細胞活性化を調節する小分子とその標的の同定に利用できる方法を追加します。当社のアッセイは、有毒化合物を排除し、TCRシグナル伝達および刺激誘発アポトーシスの阻害剤を同定することによって、自己是正的な側面を有する。TCRシグナル伝達のメディエーターの同定は、免疫疾患の治療の発展に役立つ可能性がある。
TCR-ポリクローナルマウス由来の胸腺細胞に対して強い刺激を与えた。TCRトランスジェニックマウスを使用し、他のペプチドリガンドテトラマーで刺激して弱い刺激を与えます。このアッセイは、細胞の培養のための少量および小体積プレートの使用を含む。
これは、プレートとその内容の慎重な取り扱いを必要とします。キナーゼ阻害剤のライブラリーには、危険と考えられる多くの化合物があります。安全に関する考慮事項については、すべての化合物を同等に危険なものとして扱い、サプライヤーが推奨する安全上の注意に従ってください。
キナーゼ阻害剤による胸腺細胞の治療を開始するには、マルチチャネルピペットを使用して、胸腺細胞のウェルあたり40マイクロリットルを小容量プレートに加えます。プレートを氷の上に置きます。次いで、キナーゼ阻害剤の一部、DMSO、およびデキサメタゾンのピペットを、完全なRPMI培地の4つの部分を96ウェルプレートに入れる。
少量プレートの8つのウェルを未処理の対照に、5マイクロモル濃度で希釈したデキサメタゾンを加えて細胞死に対するデキサメタゾン処理陽性対照の4つの井戸、希釈されたDMSOの0.5マイクロリットルを加えることによって車両処理対照に4つの井戸を指定する。次に、阻害剤プレートの対応するウェルから、各希釈インヒビターの0.5マイクロリットルを96ウェルプレートに加える。胸腺細胞刺激を開始するには、まず抗CD-3およびCD-28ビーズが均一に再懸濁されていることを確認してください。
次に、2ミリリットルのPBSバッファーでビーズを1ミリリットル洗浄する。上清からビーズを分離し、溶液を吸引するために磁気スタンドにチューブを置きます。その後、ビーズを完全なRPMI培地の1ミリリットルで再懸濁する。
各阻害剤処理サンプル、4つのDMSO処理サンプル、および8つの未処理サンプルのうち4つ、ビーズ懸濁液のウェルあたり10マイクロリットルを加えます。残りの4つの未処理の井戸に完全なRPMIの10マイクロリットルを加えます。マイクロプレートの軌道シェーカーを使用して、プレートを軽く攪拌します。
次に、胸腺細胞を摂氏37度、5%の二酸化炭素環境で17〜20時間、または一晩インキュベートする。自動層流れプレートワッシャーをプライムし、最初に150ミリリットルのエタノールTween溶液を使用し、次に1%Tween 20で補った脱イオン水で、最後にFACS洗浄バッファーを使用します。プレートワッシャーシステムを用いたインキュベーションの終了時に、9回の洗浄サイクルを使用してFACS洗浄バッファでプレートを洗浄する。
各洗浄は、層流によって55マイクロリットルの洗浄バッファーを追加および除去し、井戸内の試薬の指数関数的な希釈をもたらす。表面抗原を染色するために、まず、FACS洗浄緩衝液の100単位体積で、抗CD-3、抗CD-4、抗CD-8、および抗CD-69抗体の1単位体積を希釈する。次いで、染色抗体混合物の25マイクロリットルで細胞を再懸濁する。
マイクロプレートの軌道シェーカーを使用してプレートを軽く攪拌し、プレートを氷の上に30分間放置します。細胞を固定するには、先に述べた9回の洗浄サイクルを使用して、FACS洗浄バッファーの55マイクロリットルでプレートを洗浄します。その後、各ウェルに固定インパーメレーションバッファーの50マイクロリットルを追加します。
よく混ぜて、30分間氷の上にプレートをインキュベートします。インキュベーション後、1-Xパーマを調製し、225ミリリットルの超純水で提供された10Xストックの25ミリリットルを希釈してバッファーを洗浄します。プレートワッシャーに1-Xバッファーをプライムし、前に述べたように9回の洗浄サイクルを使用して、1-Xバッファーの55マイクロリットルでプレートを洗浄します。
まず、抗カスパーゼ3抗体の1ミリリットルを1-Xパーマの2ミリリットルと混合し、バッファーを洗浄します。固定細胞に混合物のウェルあたり25マイクロリットルを追加します。マイクロプレートの軌道シェーカーを使用して、プレートを軽く攪拌します。
プレートを氷の上に1時間置いておきます。インキュベーションの終わりに、1-Xパーマと洗浄バッファーで9回洗浄ステップを繰り返します。次に、25マイクロリットルのFACS洗浄バッファーをプレートのすべてのウェルに加えます。
ピペットは、溶液を混合するために数回上下します。最後に、混合サンプルをマイクロテクターチューブに移します。FACS洗浄バッファーを使用してチューブを合計容量 200 マイクロリットルに上げ、フローサイトメトリー解析に進みます。
抗CD-3、CD-28刺激に続いて、カスパーゼ-3活性化およびTCRダウンレギュレーションの増加は、未処理およびDMSO模擬処理サンプルの両方で観察された。また、CD-69発現の増加は、両方の刺激されたサンプルで観察された。デキサメタゾン処理したサンプルは、独立したアポトーシス誘導効果およびTCR刺激に期待されるように、CD-69アップレギュレーションとは無関係にカスパーゼ-3活性化の増加を示した。
T細胞活性化現象の選択的障害は、カスパーゼ-3活性化とCD-69アップレギュレーションの両方を抑制するか、CD-69アップレギュレーションを阻害したが、カスパーゼ-3活性化を損なわない異なる阻害剤によって示された。また、TCRシグナル伝達経路の関連キナーゼを標的としない阻害剤も存在し、したがってCD-69アップレギュレーションおよびカスパーゼ-3活性化の両方を抑制しなかった。スタウロスポリンのスクリーン結果は、アポトーシス陽性対照であり、期待通り高レベルのカスパーゼ-3活性化を示した。
しかし、結果はまた、タンパク質キナーゼCの媒介阻害またはCD-69発現前のその誘発アポトーシスのいずれかに起因することができる低レベルのCD-69発現を示した。異なるアッセイプロトコルの比較は、陰性対照の活性カスパーゼ-3、CD-69、およびTCR染色、細胞死に対する陽性対照、車両制御、および阻害剤処理サンプルに違いは見えなかった。プレインキュベーション段階は、細胞の培養のための小体積プレートの使用を容易にすることを意味する。
標準的な遠心分離機依存の議定書も原稿に提供される。潜在的に興味深い阻害剤または標的は、異なる細胞タイプを使用して、また、パゴゲラルマウスリンパ球またはヒト一次細胞のような異なる種で検証することができる。同定された分子および標的の後の特徴付けは、T細胞生物学の理解を深め、免疫調節の可能な標的を拡大するのに役立つ。
