この方法は、疾患関連RAFキナーゼ法の効果的な特徴付けを促進する。この技術は非常に敏感で再現性が高く、費用効果が大きく、ユーザーフレンドリーで、高度な機器を必要としません。RAF変異体の触媒活性を測定するには、標準的なプロトコルに従って適切なベクターに配列全体を挿入する前に、PCRによってRAFコードシーケンスにフラグ技術変異を導入する。
RAF変異体コード配列の上流にトランスレクターゼコーディング配列としてグルタチオンを挿入し、トランスポファーゼとしてグルタチオンをコードするベクターを生成し、同様にRAF変異体を融合させた。標準プロトコルに従って、フラグタグ付きRAFキナーゼまたはその変異体をコードするベクターを持つ80%〜90%confluent 293T細胞培養をトランスベクトする。24時間培養した後、各培養液中の培地を交換する。
48時間培養後、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を添加した400マイクロリットルのリシスバッファーを氷上の各ウェルに加える。5〜10分後、細胞のライセートを1.5ミリリットルチューブに移し、遠心分離して細胞の破片を沈下させる。各サンプルの300マイクロリットルを個々の1.5ミリリットルマイクロ遠心分離管に移す。
下流卸売用のリゼート化石細胞外シグナルレギュレートキナーゼ1と2の発現と活性アミノブロット分析のために、サンプルあたり40マイクロリットルを確保します。各チューブに20マイクロリットルのアンチフラッグアフィニティービーズを加え、摂氏4度の冷たい部屋での回転で1時間インキュベーションします。インキュベーションの終わりに迅速かつ穏やかに冷たい部屋でリシスバッファーで一度、キナーゼ反応液で1回、キナーゼ反応混合物の20マイクロリットルを追加する前に、穏やかに洗浄します。
低いディマアフィニティーを持つグラフ変異体は、ディマ解離のためにインビトロで触媒活性を失う可能性があります。したがって、迅速かつ穏やかな洗浄が重要です。1分おきに反転して室温で10分後、サンプルあたり5マイクロリットルの5つのXSDSサンプルバッファーでキナーゼ反応を停止し、サンプルを摂氏90度で5分間沸騰させます。
インキュベーションの最後に、0.1%SDSの9〜12%ポリアクリルアミド電気泳動ゲルでサンプルを実行し、その後、各サンプル中のリンスマイトゲン活性化タンパク質キナーゼおよびRAF変異体のレベルを検出できるように、タンパク質をニトロセルロース膜に移し、免疫ブロットによって検出します。キナーゼデッドRAF変異体のアロステリック活性を評価するために、RAF受信機またはキナーゼデッドRAF活性化剤をコードするベクターを構築する。293 T細胞をトランスベクト293 T細胞は、RAFレシーバとキナーゼ死んだRAF活性化剤の両方をコードする2つのベクターを有する、またはデモンストレーションされるようにタンパク質の1つをコードする単一のベクターである。
48時間培養後に全細胞ライゼを収穫し、室温で5つのXSDSサンプルバッファーときれいな全細胞ライセートを素早く混合し、90°Cで5分間煮る前に。次に、沸騰した全細胞ライセートサンプルを0.1%SDSの9〜12%ポリアクリルアミド電気泳動ゲルで実行し、タンパク質をニトロセルロース膜に移して、リンホスホウ外細胞シグナル調節キナーゼ1と2のレベルを検出し、実証したように免疫ブロッティングによってタンパク質を制御します。RAF変異体の相対的なダイマー親和性およびまたは安定性を測定するために、ホタルルシメラーゼまたはC末語であるホタルルシメラーゼの末流に融合したフラグ技術ドラフト変異体をコードするベクターを構築する。
293 T細胞は、デモンストレーションのようにホタルルシファーゼRAF変異体とCターミナスの異なるとテルミナスをコードする一対のベクターを有する。トランスベクションリプレート後24時間後、20〜5回目の293 T細胞トランザクションは、色フリー媒体の結晶黒色の画像プレートに十分に。女装後48時間後、ルシフェリンを293 T細胞トランスベクテントに加え、30分間インキュベートする。
マルチ検出システム上のルシファーゼ信号を測定する前に.測定終了時にスーパーナテントを吸引し、例示したようにリサバッファーを有する293T細胞を滑らかにする。0.1%SDSの9〜12%ポリアクリルアミド電気泳動ゲル上で細胞全体のライセートサンプルを実行します。
デモに示すように、フラフライルシファーゼRAF変異体の終末端、又は、抗フラグアミノブロットによるホタルルシファーゼRAF変異体のC末端を検出する。次に、293 T細胞トランスベクタントのルシメラーゼ信号をホタルルシファーゼの終末端およびホタルルシファーゼRAF変異体のC末端の発現レベルに従って正常化する。in vitroキナーゼasaは、いくつかの構成的に活性なR-脊椎変異体の触媒活性を効果的にプローブするために使用することができるが、融合されたC背脊椎を有するキナーゼ死んだ変異体のそれではない。
しかし、弱いダイマー親和性または安定性を有する構成活性RAF突然変異体の触媒活性は、精製プロセス中にダイマーが壊れるため、このASAを使用して探査されない可能性がある。弱いダイマー親和性または安定性を有するRAF変異体の触媒活性の喪失を避けるために、これらの変異体は、変異体の触媒活性を救うためにグルトチオナストランスパーゼと融合することができる。RAFの共活性化ASAはキナーゼ死んだRAFミュータントのアロステリック活性を評価するために使用することができる。
酸性末端モチーフとC脊椎融合を有するキナーゼ死死性変異体を例示したように、アロステリック活性化剤として機能し、293T細胞で共発現した場合に非リン酸終末末モチーフを有する変異体の触媒活性を引き起こす。さらに、無料のスプリットルシファーゼSAは、RAFファミリーキナーゼおよびその変異体の相対的なダイマー親和性または安定性を測定するために使用することができる。低濃度の洗剤を用いたリサバッファーを使用し、サンプル精製時の迅速な穏やかな洗浄手順は、インビトロキナーゼSAの成功のために不可欠です。この技術は、研究者がRAF突然変異体をリレーする疾患を正確に決定し、下流経路を活性化し、疾患治療のための適切な治療戦略の選択を促進するのに役立ちます。
