We thank Victor Marquez for providing DZNep.HCl and Scotty Bolling for manufacturing the bloodfeeders. The Mopti and SUA2La strains of An. gambiae were obtained from the Malaria Research and Reference Reagent Resource Center (MR4). This work was supported by the Fralin Life Science Institute and the grant from National Institutes of Health 1R21AI094289 to Igor V. Sharakhov.

注：プロトコルの3つの部分幼虫蚊、繁殖力の効果を研究するための雌成虫に対するDZNepの血液ベース露光DZNep薬物の水性曝露を記述し、DZNepによるSAH加水分解酵素の阻害は、単純な比色法を用いて測定。これらのアッセイの概略図を図1に示されている。 1.未熟モスキート開発·サバイバーシップアッセイ注：このセクションでは、蚊の幼虫の発達と生存に影響を与える水溶性薬物の使用を説明しています。 <ol><li>ハッチA. 28℃でのハマダラカの卵蒸留水（DH 2 O）で2 回目の幼虫にリアそれらを。 </li><li> 6ウェルDNアーゼ、RNアーゼを含まない細胞培養プレートを取り、各ウェルに10ミリリットルのdH 2 Oに注ぐ。 </li><li> 2 番目の齢で蚊の幼虫を選択して、ウェル当たり15の幼虫を追加します。プレートに第 2齢幼虫を追加する前に、P過剰の水を除去するために2-3秒間ペーパータオル上にUT。 </li><li>実験をランダム化するために色分けされたテープでラベルの井戸。各プレート上の試験濃度につきラベル2のウェル（ 図2）。 </li><li>のdH 2 O 1ml中に0.3mgのDZNepを溶解して1mMのDZNep塩酸塩（MW = 298.73）ストック溶液を調製し0.5μMおよび5.0μMの最終濃度を達成するために標識ウェルにDZNep.HClの原液を追加します。 注：ストック溶液は4で保存することができる °短期間のためのC（月に1日）または-20 長期（1ヶ月より長い）のため°C。 注：上記の濃度原液の添加はかなり井戸の水の体積を変更しません。しかし、より高い濃度の場合には、化合物の任意の不必要な希釈を避けるために、幼虫の培地中で化合物を溶解することが望ましい。 </li><li>各ウェルにフレーク魚の餌を等量加える。プレートカバーsおよび28でそれらをインキュベートする インキュベーター内のC°。 </li><li> 24時間の曝露期間後のDZNep処理および未処理幼虫蚊の死亡を記録します。デッド幼虫を削除し、捨てる。すべての幼虫が死ぬか、蛹になると大人として浮上するまで、毎日この録音を繰り返します。それらは蛹化まで、幼虫のサイズ二日毎、 すなわち、0日目、2、4、6、8を記録する。 </li><li>十分な統計分析ソフトウェアを使用して幼虫の発育と死亡率のデータを分析します。 注：棒グラフは、Microsoft Excelの死亡率データを表すために使用することができる。多変量分散分析（MANOVA）は、JMPやSPSSなどのソフトウェアを用いて行っ蚊の幼虫の有意差が生存中の薬物の結果、異なる用量の場合、明らかになります。 </li></ol>メスの蚊に人工フィーダーを通して薬物を投与2.産卵検定注：このセクションでは、血液aに薬物を添加詳細ndは人工フィーダシステムを使用して、成体雌の蚊に給餌。 <ol><li>対照および試験ケージのためのオスとメスの蚊の数と同じ数を持つ大人の蚊のケージを設定します。メスまで両方のケージにコットンボールに浸し、10％の糖液を提供する（3〜5日はハマダラカのために最適です）供給するための準備ができている。 </li><li>血液供給に先立って2時間、女性は空腹であることを確認するためにコットンボールを削除します。 </li><li>反転した幅広の底ガラス漏斗（直径= 50ミリメートル、長さ= 70ミリメートル）と産業接着剤で密封し、周囲のプラスチックで構成されて2つの人工血液フィーダーを組み立てます。流入と水の流出用のコネクタを介して2つのフィーダ「アウトレット（直径= 10ミリメートル）にプラスチックチューブ（直径= 7 mm）を取り付けます。 「コントロール」と、2つのフィーダをラベル「5μMDZNep。」 </li><li>市販の発熱体を使用すると、給餌のためのプログラムを設定。 「メニュー」の「設定」に進みます。と「セットポイント」を選択します。プリロード·プログラムが表示されます。 「SP1」を選択し、37のための温度を設定する °C。 注：発熱体を投与血液が一定の温度に維持されることを保証する。追加プログラムの設定は、別の蚊や虫の種のために使用することができる。 </li><li>水でバケツを記入し、水の中に発熱体を浸す。 </li><li>パラフィルムの正方形の一枚（50ミリメートル×50 mm）をカットし、薄い膜状のフィルムを作ってそれを伸ばす。パラフィルム人工フィーダの下部をカバーしています。パラフィルム（50ミリメートル×10ミリメートル）の別の部分をカット、それを伸ばし、フィーダのエッジをシールする。 </li><li>管によってフィーダと発熱体を接続し、システムを組み立てます。完了すると、システムのスイッチを入れると、「SP1」を選択します。プレスシステムを起動するために &quot;Enter&quot;を。 注：水が37に加熱した取得します C°、その温度で維持した。 </li><li>目のモニター水バケツで温度計を用いて水の電子温度。 注：コネクタおよびチューブは、血液の温度は37のままであるように、システムを通る水の一定の循環を維持するのを助ける °C。 </li><li>すべての血液の流出を除染するために使用される10％の漂白剤溶液との平底トレイを記入してください。 </li><li>マイクロ遠心チューブに除細動羊の血液の2ミリリットルを追加します。 「コントロール」としてラベルを付けます。静かにそれを数回反転させることにより、血液や薬剤を混ぜて &quot;5μMDZNep」と記された実験的なチューブに（ステップ1.5を参照）&quot; 5μMDZNep「DZNep原液の.Add 6μLとしてラベル実験的なチューブのためのプロセスを繰り返します。 RTでチューブ10分間インキュベート。 </li><li>ピペットを用いて、それに応じてラベルフィーダの先頭に制御し、試験血液を2ミリリットルを追加します。漂白剤溶液中にピペットを捨てる。暗い袋でケージをカバーし、Fを奨励するために定期的にケージに空気を吸う供給のためemales。 </li><li>蚊が約30分間食べてみましょう。送りが完了すると、フィーダを取り出し、加熱素子のスイッチを切り、パラフィルムストリップ。約5分間漂白溶液中でフィーダーを浸し、脱イオン水で十分にすすぐ。 </li><li>フィーダを取り外し、48時間ケージに砂糖水でコットンボールを置く。産卵を促進するために一晩ケージ内で水とろ紙を含む卵料理を置きます。それぞれの試験または対照濃度の各卵料理にラベルを付けます。 </li><li>翌日卵料理を取り外し、ステレオ顕微鏡下で卵の数と構造を調べる。 Q-colors5ソフトウェアを使用して画像を得る。卵の数を数えます。試験および対照ケージから得た卵の数の差を分析します。 注：対応のないt検定は、卵の数は、（ページ≤0.05）有意に異なるかどうかを決定するために使用することができる。 </li></ol>モスキート酵素阻害3.生化学分析薬物による注：このセクションでは、成人男性と女性の蚊におけるSAH加水分解酵素阻害に対するDZNepの効果を測定するための指標としてDTNBを用いた酵素活性アッセイを説明しています。 <ol><li>のdH 2 Oを1Lにし、Na 2 HPO 4の14.19グラムを添加することによって、0.1MのNa 2 HPO 4（二塩基性リン酸ナトリウム）溶液を調製次に、のdH 2 Oを1LにのNaH 2 PO 4の13.79グラムを添加することによって、0.1MのNaH 2 PO 4（一塩基性リン酸ナトリウム）溶液を調製</li><li> pHを8.5に0.1 MのNaH 2 PO 4溶液を用いて、0.1MのNa 2 HPO 4溶液を滴定する。 注：これは、0.1MのNa 2 HPO 4（pH8.5）中のワーキングストック溶液になります。 </li><li> 0.3％トリトンX-100を添加することにより、0.1MのNa 2 HPO 4（pH8.5）中の均質溶液を調製する。 NOTE：均質化溶液は、4℃。で保存することができる。 </li><li> PRepare 0.1 MのNa 2 HPO 4（pH8.5）中の10ミリリットルでSAHの6.15ミリグラムを溶解することによって、1.6 mMのSAH（MW = 384.4）ソリューション。 </li><li> 0.1 MのNa 2 HPO 4（pH8.5）中の10ミリリットルでDTNBの6.3 mgの溶解して1.6 mMのDTNB（MW = 396.4）溶液を調製する。使用するまで氷上で新鮮なDTNBソリューションを保管してください。 </li><li> 1ミリリットルのdH 2 OにDZNepの0.3 mgの溶解して1mMのDZNep.HCl（MW = 298.73）溶液を調製次に、のdH 2 Oで0.002μM、1,000μMから一連の濃度に1mMのDZNep溶液を希釈</li><li> DZNepによってSAH加水分解酵素の阻害を測定するために、蚊の粗酵素抽出液を調製し、0.3％トリトンX-を含む、氷冷した0.1 MのNaH 2 PO 4（pH8.5）中の1mlの10非血液給電成体の蚊をホモジナイズ100、ガラス組織ホモジナイザーを使用して。 1.5ミリリットルの微量遠心チューブにホモジネートを転送します。 </li><li> 4℃で万×gで5分間ホモジネートを遠心。クリーンに上清を移し1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブ。 SAH生化学分析のための酵素源として上清を使用してください。 </li><li>空白の治療（ すなわち 、DZNep、酵素なし）の場合、50μlの1.6 mMのSAH、96ウェルの個々のウェルに50μlの1.6 mMのDTNB、および100μlの0.1 MのNa 2 HPO 4（pH8.5の）を追加、平底マイクロプレート。 </li><li>コントロール（ すなわち 、DZNep）のために、個々に50μlの1.6 mMのSAH、50μlの1.6 mMのDTNB、50μlの0.1 MのNa 2 HPO 4（pH8.5）中と50μlの酵素（粗抽出物から得SAH加水分解酵素）を追加井戸。 </li><li> DZNepトリートメントには、50μlの1.6 mMのSAH、50μlの1.6 mMのDTNB、50μlの酵素と個々のウェルにDZNep濃度選択した50μlを添加する。治療群と対照あたり4回の反復を準備します。 </li><li> 96ウェルマイクロプレートリーダーを用いて20秒間隔で5分間、405nmでSAH酵素サンプルの光学密度（OD）を読み取る。 </li><li>制御AからブランクODを引きND治療ODは各ウェルから得た。以下の式を用いてSAH加水分解酵素活性の残存率の計算：％残留活性=（処置OD /対照OD）×100。 </li></ol>

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	<li>Gatton, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+mosquito+behavioural+adaptations+to+malaria+control+in+Africa.">The importance of mosquito behavioural adaptations to malaria control in Africa.</a> Evolution; International Journal of Organic Evolution. 67, 1218-1230 (2013).</li><li>Sternberg, E. D., Thomas, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+adaptation+to+temperature+and+the+implications+for+vector-borne+diseases.">Local adaptation to temperature and the implications for vector-borne diseases.</a> Trends in Parasitology. , (2014).</li><li>Rocca, K. A., Gray, E. M., Costantini, C., Besansky, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2La+chromosomal+inversion+enhances+thermal+tolerance+of+Anopheles+gambiae+larvae.">2La chromosomal inversion enhances thermal tolerance of Anopheles gambiae larvae.</a> Malaria Journal. 8, 147 (2009).</li><li>Coluzzi, M., Sabatini, A., Petrarca, V., Di Deco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+differentiation+and+adaptation+to+human+environments+in+the+Anopheles+gambiae+complex.">Chromosomal differentiation and adaptation to human environments in the Anopheles gambiae complex.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73, 483-497 (1979).</li><li>Donepudi, S., Mattison, R. J., Kihslinger, J. E., Godley, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+Cancer+Therapeutics.">Update on Cancer Therapeutics.</a> Science Direct. 2 (4), 157-206 (2007).</li><li>Greer, E. L., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+methylation:+a+dynamic+mark+in+health,+disease+and+inheritance.">Histone methylation: a dynamic mark in health, disease and inheritance.</a> Nature Reviews. Genetics. 13, 343-357 (2012).</li><li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+modifications+and+their+function.">Chromatin modifications and their function.</a> Cell. 128, 693-705 (2007).</li><li>Dawson, M. A., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+epigenetics:+from+mechanism+to+therapy.">Cancer epigenetics: from mechanism to therapy.</a> Cell. 150, 12-27 (2012).</li><li>Clough, E., Tedeschi, T., Hazelrigg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+of+oogenesis+and+germ+stem+cell+maintenance+by+the+Drosophila+histone+methyltransferase+Eggless/dSetDB1.">Epigenetic regulation of oogenesis and germ stem cell maintenance by the Drosophila histone methyltransferase Eggless/dSetDB1.</a> Developmental Biology. 388, 181-191 (2014).</li><li>Conrad, T., Akhtar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dosage+compensation+in+Drosophila+melanogaster:+epigenetic+fine-tuning+of+chromosome-wide+transcription.">Dosage compensation in Drosophila melanogaster: epigenetic fine-tuning of chromosome-wide transcription.</a> Nature Reviews. Genetics. 13, 123-134 (2011).</li><li>Miranda, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DZNep+is+a+global+histone+methylation+inhibitor+that+reactivates+developmental+genes+not+silenced+by+DNA+methylation.">DZNep is a global histone methylation inhibitor that reactivates developmental genes not silenced by DNA methylation.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 8, 1579-1588 (2009).</li><li>Cui, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRIMA-1,+a+Mutant+p53+Reactivator,+Restores+the+Sensitivity+of+TP53+Mutant-type+Thyroid+Cancer+Cells+to+the+Histone+Methylation+Inhibitor+3-Deazaneplanocin+A+(DZNep).">PRIMA-1, a Mutant p53 Reactivator, Restores the Sensitivity of TP53 Mutant-type Thyroid Cancer Cells to the Histone Methylation Inhibitor 3-Deazaneplanocin A (DZNep).</a> J. Clin. Endocrinol. Metab. 99 (11), E962 (2014).</li><li>Fujiwara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-Deazaneplanocin+A+(DZNep),+an+inhibitor+of+S-adenosyl-methionine-dependent+methyltransferase,+promotes+erythroid+differentiation.">3-Deazaneplanocin A (DZNep), an inhibitor of S-adenosyl-methionine-dependent methyltransferase, promotes erythroid differentiation.</a> The Journal of Biological Chemistry. , (2014).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+polycomb+group+protein+EZH2+is+a+novel+therapeutic+target+in+tongue+cancer.">The polycomb group protein EZH2 is a novel therapeutic target in tongue cancer.</a> Oncotarget. 4, 2532-2549 (2013).</li><li>Nakagawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+therapy+with+the+histone+methyltransferase+EZH2+inhibitor+3-deazaneplanocin+A+inhibits+the+growth+of+cholangiocarcinoma+cells.">Epigenetic therapy with the histone methyltransferase EZH2 inhibitor 3-deazaneplanocin A inhibits the growth of cholangiocarcinoma cells.</a> Oncology Reports. 31, 983-988 (2014).</li><li>Crea, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacologic+disruption+of+Polycomb+Repressive+Complex+2+inhibits+tumorigenicity+and+tumor+progression+in+prostate+cancer.">Pharmacologic disruption of Polycomb Repressive Complex 2 inhibits tumorigenicity and tumor progression in prostate cancer.</a> Molecular Cancer. 10, 40 (2011).</li><li>Vella, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EZH2+down-regulation+exacerbates+lipid+accumulation+and+inflammation+in+in+vitro+and+in+vivo+NAFLD.">EZH2 down-regulation exacerbates lipid accumulation and inflammation in in vitro and in vivo NAFLD.</a> International Journal of Molecular Sciences. 14, 24154-24168 (2013).</li><li>Tan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacologic+disruption+of+Polycomb-repressive+complex+2-mediated+gene+repression+selectively+induces+apoptosis+in+cancer+cells.">Pharmacologic disruption of Polycomb-repressive complex 2-mediated gene repression selectively induces apoptosis in cancer cells.</a> Genes &amp; Development. 21, 1050-1063 (2007).</li><li>Chiang, P. K., Cantoni, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perturbation+of+biochemical+transmethylations+by+3-deazaadenosine+in+vivo.">Perturbation of biochemical transmethylations by 3-deazaadenosine in vivo.</a> Biochemical Pharmacology. 28, 1897-1902 (1979).</li><li>Lu, Y. X., Denlinger, D. L., Xu, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycomb+repressive+complex+2+(PRC2)+protein+ESC+regulates+insect+developmental+timing+by+mediating+H3K27me3+and+activating+prothoracicotropic+hormone+gene+expression.">Polycomb repressive complex 2 (PRC2) protein ESC regulates insect developmental timing by mediating H3K27me3 and activating prothoracicotropic hormone gene expression.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288, 23554-23564 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

このプロトコルの適用が成功に不可欠ないくつかのステップがあります。幼虫のアッセイのために、注意が正しくラベルを付け、各試験濃度を複製するために注意が必要です。試験サンプルをランダム化し、それぞれの試験ウェルに薬物の所定量を添加して設定し、この実験の重要な部分である。 96ウェルマイクロプレートに第 2齢蚊の幼虫を追加する前に、それぞれの幼虫は、過剰...

マラリアは世界で昆虫関連死亡の最大数を担当しています。推定2.19億例は、主にアフリカ1において約66万人が死亡、その結果、世界中で毎年起こる。協調した努力にもかかわらず、マラリアプログラムはいくつかの課題に直面しています。殺虫扱わ蚊帳とプログラムの屋内残留噴霧フォームキーコンポーネントが、地元住民の殺虫剤抵抗性は、これらの取り組み2を妨げる。殺虫剤抵抗性の蚊の個体数の急速な増加は、主に彼らの環境の変化に迅速に適応し、異なるニッチ3,4,5を悪用するマラリア蚊の能力に起因する。殺虫剤抵抗性の既存のメカニズムを克服するために、新規殺虫剤の目標と次の世代の化合物の探索が保証されています。マラリアmの様々なライフステージに実験的な殺虫剤の有効性を決定するための簡単​​な、ステップバイステップのプロトコルosquitoesが大幅にこれらの取り組みを強化するだろう。 細胞株および動物モデルでの薬物作用の薬理学的研究は、細胞および生物の遺伝学と生理学を調節するために有用なツールとしてのエピジェネティックな薬の使用を確立している。 DNAメチル化およびヒストン修飾は、基礎となるDNA配列6を変更することなく、多細胞生物における遺伝子発現に影響を与える2つのエピジェネティックなメカニズムである。メチル化などの翻訳後修飾は、細胞の完全性および遺伝子発現を維持する上で重要な役割を果たし、7,8,9、いくつかの基本的なプロセスに影響を与え得る。いくつかの昆虫種の研究は、卵形成を含むプロセスにおいてエピジェネティクスの重要性を強調し、細胞維持10と同様に、投与量補償11幹いる。しかし、病気のベクターにおけるそのような態様は、まだ調査されるべきである。蚊にこのシステムを調節する化合物を使用することで私たちを提供することができ新規殺虫剤のターゲット経路にスポット。 3-デアザネプラノシンA（DZNep）は、種々のタイプの癌への影響が12,13,14,15,16が研究されている既知のヒストンメチル化阻害剤である。 DZNepは間接的に、ヒストンのリジンのN -メチルトランスフェラーゼを阻害する安定な水溶性エピジェネティック薬（EZH2）、哺乳動物細胞におけるポリコーム抑制複合体2（PRC2）のコンポーネントです。 PRC2は、多細胞生物における幹細胞の増殖の調節において重要な役割を果たし、ヒストンメチル化はPRC2媒介遺伝子サイレンシングの重要な側面である。免疫不全マウスでは、DZNepで前処理した細胞は、17以下で腫瘍形成性であることが示されている。この薬剤は、EZH2が18関与する非アルコール性脂肪肝疾患などの他の疾患を研究するために使用されるようになっている。 DZNep、確立されたのS -adenosylhomocysteine（SAH）加水分解酵素阻害剤19、20である。におけるSAH加水分解酵素の阻害SAHの蓄積と、今度は、利用可能なメチル供与基を制限することにより、メチルトランスフェラーゼ活性の阻害をもたらす。 SAHは、その代謝経路において昆虫を含む多くの生物によって利用されるアミノ酸誘導体である。最近の研究では、低用量でDZNepは休眠に影響を与え、昆虫21での開発を遅らせる可能性があることを示している。 ここで、蚊の様々なライフステージ上の水溶性化合物の効果を調査するための堅牢なプロトコルが開発されている。このプロトコルの3つの部分が未熟蚊、成人の血液供給用メス、および成体雄および雌の蚊の酵素活性に対する水溶性化合物の効果を検査するための命令を含む。まず、DZNep未熟蚊の発達および生存を研究するために水に溶解する。これは、薬物曝露の10倍の増加から生じる差異を比較するためつの濃度で行われる。大人のメスの蚊に対する薬物の効果を調べるために、DZNep除細動ヒツジ血液に添加し、雌に人工的に血液が供給される。続いて、繁​​殖力に対する薬物の結果を検討する。最終的に、酵素活性アッセイは、成体雄および雌の蚊におけるSAH加水分解酵素阻害に対するDZNepの効果を決定する指標として、5,5&#39;-ジチオビス（2-ニトロ安息香酸）（DTNB）を使用して実行される。このプロトコルは、マラリア蚊、 ハマダラカで開発されているが、それは容易に蚊や他の昆虫の任意の種における目的の化合物の効果を研究に適合させることができる。このプロトコルで詳述の技術は、効率的に水または水性媒体中で限られた、または全く溶解度を有する薬剤に適用されない場合があります。

<table><tbody><tr><td>96-well microplate</td><td>Fisher Scientific</td><td>12565561</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture plate</td><td>CytoOne</td><td>CC7682-7506</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Sorvall Fresco</td><td>76003758</td><td>A different centrifuge can be used</td></tr><tr><td>Colored tape rolls</td><td>Fisher</td><td>S68134</td><td></td></tr><tr><td>Dissection microscope</td><td>Olympus</td><td>SZ</td><td></td></tr><tr><td>DTNB</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8130</td><td></td></tr><tr><td>DZNep.HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SMLO305</td><td></td></tr><tr><td>Egg dish cups</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filter papers</td><td>Fisher</td><td>09-795E</td><td></td></tr><tr><td>Glass feeders</td><td>Virginia Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass tissue homogenizer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heating element</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0520091</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Percival scientific</td><td>I36VLC8</td><td>A different incubator can be used</td></tr><tr><td>Microcentrifuge tube, 2&amp;nbsp;ml</td><td>Axygen</td><td>22-283</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge tube, 1.5&amp;nbsp;ml</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette</td><td>Eppendorf</td><td>4910 000.069</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>M-3154</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>M-8643</td><td></td></tr><tr><td>pH meter&amp;nbsp;</td><td>Mettler Toledo 7easy</td><td>S20</td><td></td></tr><tr><td>Plate reader</td><td>Spectramax</td><td>M2</td><td></td></tr><tr><td>SAH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9384</td><td>store at -20 &amp;#176;C</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr></tbody></table>

toxicological assays for testing effects of an epigenetic drug on development, fecundity and survivorship of malaria mosquitoes

殺虫剤耐性マラリア制御プログラムの主要な問題を提起する。蚊はマラリアは熱帯諸国で遍在する問題を制御すること、すぐに環境の変化の広い範囲に適応させる。殺虫剤抵抗性の集団の出現は、媒介蚊の制御のための新規薬剤標的経路及び化合物の探索を保証します。エピジェネティック薬はよくしかし多くの昆虫への影響について知られていない、がん研究に確立されている。この研究は、マラリア媒介、 ハマダラカに、3-デアザネプラノシンA（DZNep）、癌治療のための実験的なエピジェネティック薬の毒性効果を調べるための単純なプロトコルを提供します。化合物は、治療を制御するために相対的な成体の蚊の繁殖を減少に対し、死亡率およびサイズ​​の減少の濃度依存的増加が、DZNepに露出未熟蚊で観察された。また、S中の薬物依存的な減少があった-治療を制御するためDZNepの相対への曝露後に蚊におけるアデノシル（SAH）加水分解酵素活性。これらのプロトコルは、順番に、水溶性のエピジェネティック薬または化合物の毒性効果を探索するためのユニークな多面的なアプローチを実証し、実験的な薬剤に対して複数の毒性学的エンドポイントを評価するためのシンプルな、ステップバイステップの手順で研究者を提供し、媒介蚊や他の昆虫に対する関心。

図1は、アッセイの略図である。それはこの資料に記載されている手順のさまざまな手順について説明します。プロトコルは蚊の異なるライフステージに基づいているように、ここで詳細な実験のために、次にすべき特定のシーケンスはありません。ユーザは、サンプルの可用性に依存して、同時に、1つ又は複数のアッセイを実施することを選択することができる。 <p cl...

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Toxicological Assays for Testing Effects of an Epigenetic Drug on Development, Fecundity and Survivorship of Malaria Mosquitoes

A protocol is developed to examine the effects of an epigenetic drug DZNep on the development, fecundity and survivorship of mosquitoes. Here we describe procedures for the aqueous exposure of DZNep to immature mosquitoes and a blood-based exposure of DZNep to adult mosquitoes in addition to measuring SAH hydrolase inhibition.

マラリア蚊の開発、産卵および生存者にエピジェネティック薬の試験に及ぼす影響のために毒物学的アッセイ

Insecticidal resistance poses a major problem for malaria control programs. Mosquitoes adapt to a wide range of changes in the environment quickly, making ...

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Research

JoVE Journal

Biology

8.4K ビュー.  Virginia Tech. A protocol is developed to examine the effects of an epigenetic drug DZNep on the development, fecundity and survivorship of mosquitoes. Here we describe procedures for the aqueous exposure of DZNep to immature mosquitoes and a blood-based exposure of DZNep to adult mosquitoes in addition to measuring SAH hydrolase inhibition. 

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Transfection and Mutagenesis of Target Genes in Mosquito Cells by Locked Nucleic Acid-modified Oligonucleotides

Plasmodium parasites, the causative agent of malaria, are transmitted through the bites of infected Anopheles mosquitoes resulting in over 250 million new infections each year. Despite decades of research, there is still no vaccine against malaria, highlighting the need for novel control strategies. One innovative approach is the use of genetically modified mosquitoes to effectively control malaria parasite transmission. Deliberate alterations of cell signaling pathways in the mosquito, via targeted mutagenesis, have been found to regulate parasite development 1. From these studies, we can begin to identify potential gene targets for transformation. Targeted mutagenesis has traditionally relied upon the homologous recombination between a target gene and a large DNA molecule. However, the construction and use of such complex DNA molecules for generation of stably transformed cell lines is costly, time consuming and often inefficient. Therefore, a strategy using locked nucleic acid-modified oligonucleotides (LNA-ONs) provides a useful alternative for introducing artificial single nucleotide substitutions into episomal and chromosomal DNA gene targets (reviewed in 2). LNA-ON-mediated targeted mutagenesis has been used to introduce point mutations into genes of interest in cultured cells of both yeast and mice 3,4. We show here that LNA-ONs can be used to introduce a single nucleotide change in a transfected episomal target that results in a switch from blue fluorescent protein (BFP) expression to green fluorescent protein (GFP) expression in both Anopheles gambiae and Anopheles stephensi cells. This conversion demonstrates for the first time that effective mutagenesis of target genes in mosquito cells can be mediated by LNA-ONs and suggests that this technique may be applicable to mutagenesis of chromosomal targets in vitro and in vivo.

Oligonucleotides can be used to site specifically substitute a single nucleotide of transfected target genes in both Anopheles gambiae and Anopheles stephensi cells.

ロックされた核酸修飾オリゴヌクレオチドによるトランスフェクションおよび蚊細胞における標的遺伝子の変異

Plasmodium parasites, the causative agent of malaria, are transmitted through the bites of infected Anopheles mosquitoes resulting in over 250 million new ...

免疫・感染学

Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to successful identification of genes or loci underlying various traits in malaria parasites of rodents1-3 and humans4-6. The malaria parasite Plasmodium yoelii is one of many malaria species isolated from wild African rodents and has been adapted to grow in laboratories. This species reproduces many of the biologic characteristics of the human malaria parasites; genetic markers such as microsatellite and amplified fragment length polymorphism (AFLP) markers have also been developed for the parasite7-9. Thus, genetic studies in rodent malaria parasites can be performed to complement research on Plasmodium falciparum. Here, we demonstrate the techniques for producing a genetic cross in P. yoelii that were first pioneered by Drs. David Walliker, Richard Carter, and colleagues at the University of Edinburgh10.

Genetic crosses in P. yoelii and other rodent malaria parasites are conducted by infecting mice Mus musculus with an inoculum containing gametocytes of two genetically distinct clones that differ in phenotypes of interest and by allowing mosquitoes to feed on the infected mice 4 days after infection. The presence of male and female gametocytes in the mouse blood is microscopically confirmed before feeding. Within 48 hrs after feeding, in the midgut of the mosquito, the haploid gametocytes differentiate into male and female gametes, fertilize, and form a diploid zygote (Fig. 1). During development of a zygote into an ookinete, meiosis appears to occur11. If the zygote is derived through cross-fertilization between gametes of the two genetically distinct parasites, genetic exchanges (chromosomal reassortment and cross-overs between the non-sister chromatids of a pair of homologous chromosomes; Fig. 2) may occur, resulting in recombination of genetic material at homologous loci. Each zygote undergoes two successive nuclear divisions, leading to four haploid nuclei. An ookinete further develops into an oocyst. Once the oocyst matures, thousands of sporozoites (the progeny of the cross) are formed and released into mosquito hemoceal. Sporozoites are harvested from the salivary glands and injected into a new murine host, where pre-erythrocytic and erythrocytic stage development takes place. Erythrocytic forms are cloned and classified with regard to the characters distinguishing the parental lines prior to genetic linkage mapping. Control infections of individual parental clones are performed in the same way as the production of a genetic cross.

Genetic crosses of rodent malaria parasites are performed by feeding two genetically distinct parasites to mosquitoes. Recombinant progeny are cloned from mouse blood after allowing mosquitoes to bite infected mice. This video shows how to produce genetic crosses of Plasmodium yoelii and is applicable to other rodent malaria parasites.

げっ歯類のマラリア原虫の遺伝的交雑の生産のためのプロトコル

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

Building a Better Mosquito: Identifying the Genes Enabling Malaria and Dengue Fever Resistance in A. gambiae and A. aegypti Mosquitoes

In this interview, George Dimopoulos focuses on the physiological mechanisms used by mosquitoes to combat Plasmodium falciparum and dengue virus infections.   Explanation is given for how key refractory genes, those genes conferring resistance to vector pathogens, are identified in the mosquito and how this knowledge can be used to generate transgenic mosquitoes that are unable to carry the malaria parasite or dengue virus.

In this interview, George Dimopoulos focuses on the physiological mechanisms used by mosquitoes to combat Plasmodium falciparum and dengue virus infections. Explanation is given for how key refractory genes, those genes conferring resistance to vector pathogens, are identified in the mosquito and how this knowledge can be used to generate transgenic mosquitoes that are unable to carry the malaria parasite or dengue virus.

より良い蚊の構築：A. gambiaeとA.ネッタイシマカ蚊のマラリアとデング熱の抵抗を使用可能にする遺伝子を特定

In this interview, George Dimopoulos focuses on the physiological mechanisms used by mosquitoes to combat Plasmodium falciparum and dengue virus ...

生物学

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical regions, is caused by infection with Plasmodium parasites. The development of more effective drugs to combat malaria can be accelerated by improving our understanding of the biology of this complex parasite. Genetic manipulation of these parasites is key to understanding their biology; however, historically the genome of P. falciparum has been difficult to manipulate. Recently, CRISPR/Cas9 genome editing has been utilized in malaria parasites, allowing for easier protein tagging, generation of conditional protein knockdowns, and deletion of genes. CRISPR/Cas9 genome editing has proven to be a powerful tool for advancing the field of malaria research. Here, we describe a CRISPR/Cas9 method for generating glmS-based conditional knockdown mutants in P. falciparum. This method is highly adaptable to other types of genetic manipulations, including protein tagging and gene knockouts.

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

We describe a method for generating glmS-based conditional knockdown mutants in Plasmodium falciparum using CRISPR/Cas9 genome editing.

作る条件付き変異体の人間のマラリア原虫マラリアに CRISPR/Cas9 遺伝子の編集

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

遺伝学

Phenotypic Analysis of Rodent Malaria Parasite Asexual and Sexual Blood Stages and Mosquito Stages

Recent advances in genetics and systems biology technologies have promoted our understanding of the biology of malaria parasites on the molecular level. However, effective malaria parasite targets for vaccine and chemotherapy development are still limited. This is largely due to the unavailability of relevant and practical in vivo infection models for human Plasmodium species, most notably for P.&#160;falciparum and P. vivax. Therefore, rodent malaria species have been extensively used as practical alternative in vivo models for malaria vaccine, drug targeting, immune response, and functional characterization studies of conserved Plasmodiumspp. genes. Indeed, rodent malaria models have proven to be invaluable, especially for exploring mosquito transmission and liver stage biology, and were indispensable for immunological studies. However, there are discrepancies in the methods used to evaluate the phenotypes of transgenic and wild-type asexual and sexual blood-stage parasites.&#160;Examples of these discrepancies are the choice of an intravenous vs. intraperitoneal infection of rodents with blood-stage parasites and the evaluation of male gamete exflagellation. Herein, we detail standardized experimental methods to evaluate the phenotypes of asexual and sexual blood stages in transgenic parasites expressing reporter-gene or wild-type rodent malaria parasite species. We also detail the methods to evaluate the phenotypes of malaria parasite mosquito stages (gametes, ookinetes, oocysts, and sporozoites) inside Anopheles mosquito vectors. These methods are detailed and simplified here for the lethal and non-lethal strains of P. berghei and P. yoelii but can also be applied with some adjustments to P. chabaudi and P. vinckei rodent malaria species.

Due to the striking similarities of the life cycle and biology of rodent malaria parasites to human malaria parasites, rodent malaria models have become indispensable for malaria research. Herein, we standardized some of the most important techniques used in the phenotypic analysis of wild-type and transgenic rodent malaria species.

げっ歯類マラリア寄生虫の現象分析無性および性的血液段階と蚊の段階

Recent advances in genetics and systems biology technologies have promoted our understanding of the biology of malaria parasites on the molecular level. ...

Standard Membrane Feeding Assay for the Detection of Plasmodium falciparum Infection in Anopheles Mosquito Vectors

Malaria remains one of the most devastating diseases worldwide and, to date, the African region is still responsible for 94% of all cases worldwide. This parasitic disease requires a protozoan parasite, an Anopheles mosquito vector, and a vertebrate host. The Anopheles genus comprises more than 500 species, of which 60 are known as vectors of the parasite. The Plasmodium parasite genus consists of 250 species, and 48 of these are involved in disease transmission. Furthermore, the Plasmodium falciparum parasite has contributed toward an estimated 99.7% of malaria cases in sub-Saharan Africa in recent years. 
Gametocytes form part of the sexual stage of the parasite and are ingested by the female mosquito upon feeding on an infected human host. Further development of the parasite within the mosquito is enhanced by favorable environmental conditions in the midgut of the mosquito. Here, the fusion of the female and male gametes takes place, and the motile ookinetes originate. The ookinetes enter the midgut epithelium of the mosquito, and mature ookinetes form oocysts, which, in turn, produce motile sporozoites. These sporozoites migrate to the mosquito's salivary glands and are injected as a mosquito takes a blood meal. 
For drug discovery purposes, mosquitoes were artificially infected with gametocyte-infected blood in the standard membrane feeding assay (SMFA). To detect infection within the mosquito and/or to assess the efficacy of antimalarial compounds, the midguts of the female mosquitoes were removed post infection and were stained with mercurochrome. This method was used to enhance the visual detection of oocysts under the microscope for the accurate determination of oocyst prevalence and intensity.

Standard Membrane Feeding Assay for the Detection of Plasmodium falciparum Infection in Anopheles Mosquito Vectors

The standard membrane feeding assay (SMFA) is regarded as the gold standard for the assessment and identification of potential antimalarial compounds. This artificial feeding system is used to infect mosquitoes to further evaluate the effects of such compounds on the intensity and prevalence of the Plasmodium falciparum parasite.

ハマダラカ媒介動物における熱帯熱マラリア原虫感染の検出のための標準的な膜摂食アッセイ

Malaria remains one of the most devastating diseases worldwide and, to date, the African region is still responsible for 94% of all cases worldwide. This ...

蚊の精子形成を研究するための蛍光 In Situ ハイブリダイゼーション

Whole-Mount Fluorescence In Situ Hybridization to Study Spermatogenesis in the Anopheles Mosquito

Spermatogenesis is a complex biological process during which diploid cells undergo successive mitotic and meiotic division followed by large structural changes to form haploid spermatozoa. Besides the biological aspect, studying spermatogenesis is of paramount importance for understanding and developing genetic technologies such as gene drive and synthetic sex ratio distorters, which, by altering Mendelian inheritance and the sperm sex ratio, respectively, could be used to control pest insect populations. These technologies have proven to be very promising in lab settings and could potentially be used to control wild populations of Anopheles mosquitoes, which are vectors of malaria. Due to the simplicity of the testis anatomy and their medical importance, Anopheles gambiae, a major malaria vector in sub-Saharan Africa, represents a good cytological model for studying spermatogenesis. This protocol describes how whole-mount fluorescence in situ hybridization (WFISH) can be used to study the dramatic changes in cell nuclear structure through spermatogenesis using fluorescent probes that specifically stain the X and Y chromosomes. FISH usually requires the disruption of the reproductive organs to expose mitotic or meiotic chromosomes and allow the staining of specific genomic regions with fluorescent probes. WFISH enables the preservation of the native cytological structure of the testis, coupled with a good level of signal detection from fluorescent probes targeting repetitive DNA sequences. This allows researchers to follow changes in the chromosomal behavior of cells undergoing meiosis along the structure of the organ, where each phase of the process can clearly be distinguished. This technique could be particularly useful for studying chromosome meiotic pairing and investigating the cytological phenotypes associated with, for example, synthetic sex ratio distorters, hybrid male sterility, and the knock-out of genes involved in spermatogenesis.

著者スポットライト:ハマダラカの精子形成を研究するためのWhole-Mount Fluorescence In Situ Hybridization  

Given their simple anatomy, Anopheles testes offer a good cytological model for studying spermatogenesis. This protocol describes whole-mount fluorescence in situ hybridization, a technique used to investigate this biological process, as well as the phenotype of transgenic strains harboring mutations in the genes involved in sperm production.

ハマダラカの精子形成を研究するためのホールマウント蛍光In Situハイブリダイゼーション

Spermatogenesis is a complex biological process during which diploid cells undergo successive mitotic and meiotic division followed by large structural ...

Protocols for Testing the Toxicity of Novel Insecticidal Chemistries to Mosquitoes

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such as Zika, dengue and malaria. Assays for rapid, high-throughput analyses of unformulated novel chemistries against mosquito larvae and adults are presented. We describe protocols for single point-dose and dose response assays to evaluate the toxicity of small molecule chemistries to the Aedes aegypti vector of Zika, dengue and yellow fever,&#160;the malaria vector, Anopheles gambiae and the northern house mosquito, Culex quinquefasciatus, on contact and via ingestion. As an example, we evaluated the toxicity of amitriptyline, a small molecule antagonist of G protein-coupled receptors, via larval, adult topical and adult blood-feeding assay. The protocols provide a starting point to investigate insecticide potential. Results are discussed in the context of additional experiments to explore product applications and mechanisms for delivery.

Protocols are described for assessing the toxicity of chemistries to immature and adult mosquitoes for development as new classes of larvicides, adulticides and endectocides. The protocols enable high-throughput testing of multiple chemistries at single-point dose and subsequent evaluation via dose response assay to determine toxicity on contact or via ingestion.

蚊を殺虫化合物小説の毒性試験のプロトコル

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such ...

マラリア蚊の開発、産卵および生存者にエピジェネティック薬の試験に及ぼす影響のために毒物学的アッセイ

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ロックされた核酸修飾オリゴヌクレオチドによるトランスフェクションおよび蚊細胞における標的遺伝子の変異

げっ歯類のマラリア原虫の遺伝的交雑の生産のためのプロトコル

より良い蚊の構築：A. gambiaeとA.ネッタイシマカ蚊のマラリアとデング熱の抵抗を使用可能にする遺伝子を特定

作る条件付き変異体の人間のマラリア原虫マラリアに CRISPR/Cas9 遺伝子の編集

げっ歯類マラリア寄生虫の現象分析無性および性的血液段階と蚊の段階

ハマダラカ媒介動物における熱帯熱マラリア原虫感染の検出のための標準的な膜摂食アッセイ

ハマダラカの精子形成を研究するためのホールマウント蛍光In Situハイブリダイゼーション

ハマダラカの精子形成を研究するためのホールマウント蛍光In Situハイブリダイゼーション

ハマダラカの精子形成を研究するためのホールマウント蛍光In Situハイブリダイゼーション

蚊を殺虫化合物小説の毒性試験のプロトコル