この方法は、条件付きノックダウンを通じてタンパク質機能を明らかにすることによって、ヒトマラリア寄生虫P.Falciparumの生物学における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、以前の方法と比較して、比較的簡単に条件付き変異体を生成できることです。まず、チョップチョップに行き、Fasta Target'Under Targetを選択し、遺伝子の3つのプライム読み取りフレームの3つのプライムエンドから200塩基対をペーストし、遺伝子の3つのプライムUTRの開始から200塩基対をペーストします。
[P.Falciparum'] で[CRISPR/Cas9'Using'Next]を選択し、[ターゲットサイトを検索]をクリックし、提示されたオプションからgRNAシーケンスを選択し、変更部位に最も近く、ターゲット外サイトが最も少ない最も効率的なgRNAを優先します。gRNA配列とその逆補体をポリアクリルアミドゲル電気泳動精製オリゴとして購入します。PfH-sp70xを標的とするgRNA配列は、テキストプロトコルで見つけることができます。
pMK-U6、pUF1-Cas9、およびpHA-glmS DNAをそれぞれ40マイクログラムを無菌1.5ミリメートル遠心分離管に加えます。水中の酢酸大臼歯ナトリウム3モルのDNAの体積の10分の1をチューブに加え、渦を使用してよく混ぜます。その後、チューブに100パーセントのエタノールの2.5倍の体積を加え、少なくとも30秒間渦を使用してよく混ぜます。
チューブを氷の上に置くか、マイナス20度で30分間置きます。次いで、チューブを摂氏4度で30分間18、300倍Gで遠心する。遠心分離後、ペレットを邪魔することなくチューブから上清を慎重に取り除きます。
70%のエタノールの3倍の体積をチューブに加え、渦を使用して簡単に混ぜます。チューブを摂氏4度で30分間18、300倍Gで遠心する。再度、ペレットを邪魔することなくチューブから上清を慎重に取り除きます。
チューブを開けたままにして、ペレットを15分間空気乾燥させます。沈殿したDNAは、トランスフェクションに必要になるまでマイナス20度で保管してください。Rbcsをトランスフェクトするには、テキストプロトコルに記載されているように、1Xサイトミックスバッファと不完全で完全なRPMIを準備します。
フィルターは0.22ミクロンフィルターを使用してバッファーを殺菌する。DNAと渦に380マイクロリットルの1Xサイトミックスを加え、溶解する。DNAを1Xサイトミックス中に10分間溶解させ、3分ごとに10秒間渦を起こさせる。
滅菌、15ミリリットルの円錐管では、不完全なRPMI内の300マイクロリットルの孤立したヒトRBCを、1Xサイトミックスの4ミリリットルと組み合わせます。RbCsを870倍Gで3分間遠心する。その後、RBCペレットから上清を除去します。
DNA-サイトミックス混合物でRBCペレットを再懸濁し、0.2センチメートルのエレクトロポレーションキュベットに移します。テキストプロトコルにリストされている条件を使用して、RBCをポレートします。エレクトロポレーションの後、キュヴェットから完全なRPMIの5ミリリットルを含む15ミリリットルの円錐管に内容物を移す。
チューブを摂氏20度で3分間870倍Gで遠心分離する。その後、上清をデカントします。さて、完全なRPMIの4ミリリットルでペレットを再中断し、6ウェル組織培養プレートの1つの井戸に移す。
移されたRBCsに高いシゾント培養物の400マイクロリットルを加え、すべての培養物を3%の酸素、3%のCO2、94%の窒素の下で摂氏37度に維持します。翌日、完全なRPMIの4ミリリットルで培養を洗います。
培養物を870倍Gで3分間遠心する。上清を吸引する。完全なRPMIの4ミリリットルで培養を再中断する。
48時間後、完全なRPMIの4ミリリットルで培養物を洗う。次いで、1つのマイクロモルDSM1を含む完全なRPMIで培養を再中断し、Cas9プラスミドを選択する。この時点の後、培養培地を、48時間ごとに新鮮な完全RPMIと1マイクロモルDSM1に交換します。
血の塗り傷によって寄生虫が見えなくなるまで、完全なRPMIで毎日培養物を洗浄し続けます。血液スミアを作るために、ピペット150マイクロリットルの培養物を0.6ミリリットル遠心分離管に入る。1で遠心分離により細胞をペレット化した後、Gを700回30秒間、上清を吸引した。
ピペットを使用してペレット化した細胞をガラススライドに移します。第1のスライドに45度の角度で保持された第2のガラススライドを使用して、血滴を塗りつぶす。メーカーのプロトコルに従って市販の染色キットを使用してスライドを染色します。
100倍の油浸しの目的を使用して寄生虫を表示します。トランスフェクション後5日間から、培養培地中で再懸濁したRBCで2ミリリットルの培養液を除去する。2%のヘマトクリットで新鮮な培地と血液の2ミリリットルを追加します。
薄い血液塗抹標本によって決定されるように、寄生虫が再び現れるまで、週に一度この方法で新鮮な血液を追加します。200マイクロリットル当たり0.5寄生虫の最終濃度を達成するために、寄生虫培養の連続希釈を行う。96ウェル組織培養プレートのウェルに希釈培養液200マイクロリットルを加えます。
寄生虫が井戸内で検出されるまでクローニングプレートを維持します。48時間ごとに、96ウェルプレートの培地を新鮮な培地に交換します。週に1回、クローニングプレートを開始してから5日後に開始し、各ウェルから100マイクロリットルを取り除き、新鮮な媒体と血液の100マイクロリットルを追加します。
寄生虫を含むウェルを特定するには、96ウェルプレートを約20分間45度の角度で配置し、血液がプレート内の角度で沈着するようにします。その後、ライトボックスの上に96ウェルプレートを置きます。寄生虫を含むウェルには、寄生虫による培地の酸性化により、寄生虫を含まないウェルのピンク色の培地と比較して黄色の培地が含まれていることに注意してください。
血清ピペットを使用して、寄生虫含有井戸の内容物を24ウェル組織培養プレートに移動させて、寄生虫の増殖を可能にする。PCR 分析を使用して、これらのクローンの寄生虫ラインを確認して、正しい統合を確認します。免疫蛍光アッセイの結果をここに示し、PfH-sp70xの正常なHAタグ付けを示す。
PfH-sp70x glmS寄生虫を固定し、核マーカーとしてDAPIと、ならびにHAに対する抗体を染色した。膜関連ヒスチジンリッチタンパク質1は、宿主RBCにエクスポートするタンパク質のマーカーである。グルコサミン処理後のPfH-sp70xタンパク質レベルのウェスタンブロット分析をここに示す。予想通り、タンパク質レベルは治療期間中に減少する。
この技術は、寄生虫学の分野の研究者がマラリア原虫の生物学における根本的な疑問を調査する道を開きます。P.Falciparumは血液媒介病原体であり、この手順を実行している間は適切な個人用保護具を着用する必要があることを覚えておくことが重要です。
