Name: isolation, cryopreservation and culture of human amnion epithelial cells for clinical applications
Uploaded: 2014-12-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 31 s
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注：胎盤用語選択科目帝王切開の設定に合わせて、シングルトン健康妊娠から収集する必要があります。書かれ、インフォームドコンセントは、胎盤の収集のために与えられるべきである。あなたの関連する人間の研究倫理委員会の承認のヒト組織のすべての収集と利用をする必要があります。 羊膜上皮細胞の単離<ol style="margin-left: 40px;"><li>クラスII生物学的安全キャビネット内で無菌の表面に胎盤を置きます。 </li><li>無菌ハンクスの平衡塩類溶液（HBSS）を用いて、胎盤の表面及び膜からできるだけ多くの血液を洗浄する。 </li><li>臍帯を上にして置かれ、胎盤では、機械的に羊膜と絨毛膜の膜の外縁を分離する。 </li><li>分離後は、手動で臍帯に向けて、膜のエッジの周りの作業、胎盤の絨毛膜膜から羊膜を取り除く。 注：carefこと羊膜から絨毛膜を汚染する任意の部分を削除するには、UL。 </li><li>無菌のハサミを使用して、250ミリリットルHBSSを含有する容器を密封された500ミリリットル中に臍帯と場所のベースから約2cmの羊膜をカット。 </li><li>羊膜膜を含む密閉ボトルを振ることにより徹底的に洗ってください。 </li><li>滅菌ピンセットを使用して収集容器から羊膜膜を外し、15センチメートルペトリ皿に置く。 </li><li>流血や破れの部分を破棄し、（ピンセットで垂直に保持時）約5cm、長片に羊膜をカット。 </li><li> 500ミリリットル内の場所は、コンテナを密封し、250ミリリットルHBSS約3〜5倍または羊膜膜が無汚染血液と半透明になるまで洗浄した。 注：任意に存在する血液の酵素消化溶液の効率を低下させることができる。 </li><li>に注意しながら、溶液を消化する酵素を50 mlを入れた容器に羊膜のすべての部分を転送するHBSSのキャリーオーバーを最小限に抑える。 </li><li>残りの血液を除去するために穏やかに攪拌しながら15分間37℃の水浴または暖かい部屋でソリューションを消化酵素の中で羊膜断片をインキュベートする。 </li><li>新しい滅菌容器内の溶液と場所を消化酵素のから羊膜片を除去します。 </li><li>羊膜膜へのソリューションを消化し、水浴または穏やかに振盪（最初の消化）と暖かい部屋で60分間37℃でインキュベート新鮮な酵素の100ミリリットルを追加します。 </li><li>羊膜膜片を取り出し、酵素による、膜の各部分から排水するソリューションを消化できるように、新しいコンテナ世話に入れる。 注：これは、容器の内側縁に沿って羊膜片をドラッグすることによって達成することができる。 </li><li>羊膜膜片に対する解決策を消化し、穏やかに振盪（第二の消化）を用いて37℃の水浴または暖かい部屋で60分間インキュベートする新鮮な酵素の100ミリリットルを追加します。 </li><li>セルを渡しsuspensiステップ1.14から10分間千×gで70μmのフィルターと遠心分離機を経て上に。 </li><li>削除し、上清を捨て、および1mg / mlの大豆ベースの酵素阻害剤を含む4ミリリットルHBSSで細胞ペレットを再懸濁します。穏やかに単一細胞懸濁液を得た1mlピペットで繰り返しピペット。 注：第消化物からの細胞は、同様の処理段階になるまで、この段階で、細胞を氷上に放置することができる。 </li><li>羊膜膜片を取り出し、酵素による、膜の各部分から排水するソリューションを消化できるように、新しいコンテナ世話に入れる。 注：これは、容器の内側縁に沿って羊膜片をドラッグすることによって達成することができる。 </li><li> 10分間の千×gで70μmのフィルターと遠心分離機を通してステップ1.18から細胞懸濁液を渡します。 </li><li>削除し、上清を捨て、および1mg / mlの大豆ベースの酵素阻害剤を含む4ミリリットルHBSSで細胞ペレットを再懸濁します。静かに1ミリリットルpで繰り返しピペット単一細胞懸濁液を得るipette。 </li><li> 2つのダイジェストまたは代わりのプール細胞は、細胞数の後まで分離した細胞ダイジェストを保つ。 注：これは高い生存細胞と、潜在的に低い生存性細胞の混合を防ぐことができます。 </li><li> 10〜20ミリリットルの最終容量にHBSSを追加し、生存能力を測定するためにトリパンブルーを用いて細胞数を行う。 </li><li>フローサイトメトリーによる上皮細胞表現型を確認してください。抗EpCAM-PEを用いて適切な抗体カクテルを作る（1：2希釈）抗CD90-PeCy5（1：250）および抗CD105-APC（1：100）HBSS中。 </li><li> 25×10 6細胞/ mlの濃度で一つまたは抗体カクテルの両方の消化物からの細胞のサブセットを再懸濁する。 </li><li>フローサイトメトリー、ステインアイソタイプコントロールを含む抗体カクテルと1×10 6細胞（例えば。のIgG 1アイソタイプコントロール-PE +抗CD90-PeCy5 +抗CD105-APC）。セットアップフローサイトメーター用の染色されていない〜1×10 6細胞を保管してください。 </li><li>抗体で細胞をインキュベート60分間4℃でカクテルをお楽しみいただけます。 </li><li>洗浄細胞は、フローサイトメトリーのために、1ml当たり5から10000000個の細胞でHBSS再懸濁で3倍。 </li><li>フローサイトメトリーとノート結果を実行します。細胞分離株（のEpCAM陽性およびCD90 / CD105陰性細胞の割合）の純度は、それぞれ90〜95％と&lt;1％であることが期待される。 </li><li>最終的なアプリケーションによって決定されるよう、適切な品質管理やリリース基準のテストのために取って細胞の適切な数を設定します。 注：これは、疾患/ウイルスのスクリーニング、または他の安全性又は生物学的基準を含むことができる。 </li><li>残りの細胞では、低温保存プロトコールに従うか、あるいは（培養工程3.6への直接）文化に直接配置します。 </li></ol> HAECを2.凍結保存<ol style="margin-left: 40px;"><li>トリパンブルー排除を使用してデータまたは手動カウント、フローサイトメトリーを用いて細胞数および生存率を決定します。 </li><li> 5分間700×gで遠心分離する。 </li><li>再懸濁細胞動物性製品の無凍結保存培地1ml当たり1から10000000細胞間の秒。 </li><li> O-環状凍結保存バイアルに細胞の適切な量をピペット冷却℃/分まで-80°C〜が達成され、およそ1を発生する装置を凍結し、制御された速度に入れる。 </li><li>長期保存のために液体窒素中にバイアルを移す。 </li></ol>凍結保存HAECを3.解凍と文化<ol style="margin-left: 40px;"><li>液体窒素から凍結保存バイアルを取り出し、氷上に置きます。 注：転送の場合のみ - 次のステップに急速に進んでください。 </li><li>氷が残る唯一の小片（〜5mm角）になるまで37℃で急速に凍結バイアルを解凍する。 注：細胞溶液は、凍結保存培地中のDMSOの毒性効果を減少させるために加温しないことが重要である。 </li><li>冷（1~4℃）で無血清培地に凍結保存培地を10倍に希釈し、適当な大きさに滴下D管やコンテナ。 </li><li> RTで5分間700×gで遠心分離する。 </li><li> 1mlあたり100万個の細胞のおよその濃度を、無血清培地中で再懸濁し、。トリパンブルー排除で自動化または手動の計数を用いて細胞数および生存率を決定します。予想される生存解凍後は、事前に凍結保存の生存率よりも5〜10％減となります。 </li><li>代わりにプレート標準的な細胞培養処理プラスチックウェア上の細胞、または、私はコート培養表面に型コラーゲンを使用しています。 </li><li> I型コラーゲンコーティングについては、以下のプロトコルに従う<ol><li>ヒト胎盤（25ミリリットル脱イオン水と50μlの氷酢酸と15 mgのコラーゲン）から酸可溶性I型コラーゲンを準備します。 </li><li>パラフィルムでビーカーを覆い、コラーゲン鎖が溶解するまで37℃で適度に撹拌した。 </li><li> 0.22μmのフィルターを用いて無菌濾過コラーゲン溶液。 </li><li>脱イオン水でろ過したコラーゲン株式1:10に希釈する。この希釈された株式は、作業conceですプラスチックと膜表面をコーティングするためのntrationソリューション。 </li><li> 2〜8℃、37℃、またはO / NでのコラーゲンRTで2時間コートプラスチック、ガラス、膜の表面を。 </li><li>コー​​ティングされた表面から余分な流体を除去し、それがO / Nを乾燥させます。 </li><li>細胞および培地を導入する前に無菌の組織培養グレードの水またはHBSSで洗い流してください。 </li></ol></li><li>プレート無血清培地中で25000細胞/ cm 2の密度でHAECを、そして、添付ファイルが72〜96時間起こさせる。 </li><li>添付ファイルの後、慎重に吸引し、無血清培地の適切な音量2〜3日ごとに交換することによってメディアを変更。 </li><li>以下のプロトコルを使用して継代細胞<ol><li>吸引し、細胞培養培地および滅菌HBSSの1倍容量で洗浄</li><li>細胞は、細胞培養表面から離脱観察されるまで、酵素の1倍体積を加える溶液を消化し、5〜15分間インキュベートし、または。 </li><li> CEのを確実にする、細胞を含む酵素消化液の収集LLSを繰り返し、細胞培養表面に対する酵素消化物溶液をピペッティングすることにより細胞培養表面から剥がれた</li><li> 5分間700×gで遠心分離する。 </li><li> 1mg / mlの大豆ベースの酵素阻害剤を含有するHBSSの適切な体積で細胞ペレットを再懸濁する。穏やかに単一細胞懸濁液を得るために、1ミリリットルピペットで繰り返しピペット。 </li><li> 100万個の細胞/ mlのおおよその濃度になるように無血清培地を加える。トリパンブルー排除で自動化または手動の計数を用いて細胞数および生存率を決定します。 </li><li>プレート無血清培地中で25000細胞/ cm 2の密度でHAECを、そして、標準的な培養方法を続行。 </li></ol></li></ol>

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この方法の成功に重要な影響を与えることができるいくつかの重要なパラメータがある。 HAECを単離する前に、最大3時間胎盤または羊膜の貯蔵はロジスティックまたはスケジューリングの目的のために望ましいことがある、しかしそれは、組織ができるだけ早く処理されることをお勧めします。組織を保存する場合は、ストレージが羊膜膜の解剖と洗浄後に実施することをお勧めします。羊?...

そのような胎盤などの周産期の供給源に由来する細胞は、胎盤膜、臍帯および羊水は再生医療1,2のための細胞の潜在的な供給源として研究者や臨床医から注目を集めている。この関心の理由は、これらの細胞型すべてが可塑性および免疫調節機能3、彼らの潜在的な治療への応用の基礎となる性質をある程度持っていることである。 HAECを回生細胞物質の豊富な潜在的な源を提供する、用語または早産羊膜4に由来することができる不均一な上皮細胞集団である。細胞療法として魅力HAECをを作る特性は、それらの多能、低い免疫原性、および抗炎症性を含む。 HAECをはcardiom（中胚葉系統に分化する能力、in vitroおよびin vivoの両方で非常に多能性であることが判明しているyocytes、筋細胞、骨細胞、脂肪細胞）、内胚葉系統（膵臓細胞、肝細胞、肺細胞）および外胚葉系統（毛髪、皮膚、神経細胞とアストロサイト）5-10。 安心させる、彼らの多分化のHAECをもかかわらず、腫瘍を形成またはin vivoで腫瘍の発達を促進するためのいずれか表示されません。さらに、HAECを、クラスIIヒト白血球抗原（HLAは）8の低いレベルで発現する、特権免疫がある。このプロパティは、おそらく免疫適格サル、ウサギ、モルモット、ラット、およびブタ11-13を用いた研究において実証されるように、同種および異種移植後の免疫拒絶を回避する能力の基礎となる。 HAECを、強力な免疫調節および免疫抑制のプロパティを表示し、したがって、自己免疫疾患の治療における潜在的な臨床応用のための重要な実用的な利点を提供する。 HAECをは、先天性および適応免疫システムの両方に免疫調節機能を発揮すると考えられている。上のメカニズムのeは、免疫調節因子の14の分泌を介して行われ、提案した。 前臨床動物疾患モデルでHAECを、現在のアプリケーションは、脳卒中、多発性硬化症、肝疾患、糖尿病、慢性及び急性の肺疾患の治療が含まれる。研究者は、彼らの独特の特性に起因する脳卒中後の脳の炎症を処置するためにHAECをを使用することに関心を示している。 HAECを、彼らは、生着までの60日間生存、ニューロンへの分化、炎症を減少させ、神経疾患15の動物モデルにおいて、損傷した中枢神経系組織の再生を促進することができ、血液脳関門を通過することができるという証拠がある。 HAECを、多発性硬化症の発症および進行に寄与する複数の病理学的経路を標的とし、逆転する機能を提供します。例えば、前臨床動物試験からの結果は、HAECを強く免疫抑制性であることを示唆していると潜在的に末梢免疫寛容を誘導し、継続的な炎症反応を逆にすることができます。 HAECをまた、インビボで神経細胞に分化し、神経栄養因子16の広大な配列の分泌を介して内因性の神経再生を増強する能力を有することが示されている。 ヒト及びげっ歯類羊膜上皮細胞は、既に、動物モデルにおける肝疾患の治療のためのそれらの治療有効性を実証している。縮小肝細胞アポトーシスに伴う肝臓中の生存HAECを生着に肝疾患、HAEC移植リードの四塩化炭素による損傷誘発モデルにおいて、肝線維症、炎症および17を減少させた。 HAECを、インスリンとグルコーストランスポーターなどの表現膵臓の要因に刺激することができる。いくつかの研究は、糖尿病マウス18で血中グルコースレベルを復元するHAECをする可能性を検討した。投与したマウスでは、HAECをは、両方の動物の体重および血中グルコースレベルは、細胞の注射後に正常レベルに低下した。これらの研究は、糖尿病の治療のためのHAECを使用するための強力なケースを提示する。 HAECを、成人および新生児モデル19の両方で実験的な急性および慢性の肺損傷の防止と修復において実績のある役割を担っている。これらの研究は、HAECをが嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンスレギュレータ（CFTR）、嚢胞性線維症を有する患者20に変異しているイオンチャネルを含む複数の肺癌関連タンパク質を発現する機能的な肺上皮細胞にin vitroで分化することがわかった。 HAECを負傷が成人および新生児の肺に送達された場合も、それらは、好中球、マクロファージおよびリンパ球21-23を含む肺白血球補充を、還元、宿主免疫細胞の調節を介して、それらの修復効果を発揮する。 彼らの豊富を考えると、安全記録、および複数の疾患のための実証済みの臨床応用、HAECをを使用した臨床試験は避けられない。臨床治験にHAEC療法の翻訳を加速させることを目標に、私たちは現在の適正製造基準（cGMPの）ガイドラインに従って動物製品の無試薬を用いて、臨床試験のための適当な方法で培養HAECをし、分離し凍結保存とする方法を開発。 私たちは、このプロトコルを私たちは動物由来の試薬​​6を使用してHAECをを分離することに成功し使用していた以前に公開されたプロトコルをベース。我々は、動物製品を含まない試薬で動物由来の製品を置き換えるために、元のプロトコルを変更し、その後の最適化は、細胞収量、生存率および純度を最適化するために行った。私たちの目標は、ヒト臨床試験用電池製造のための規制基準に準拠したいプロトコルを開発することであった。

<table><tbody><tr><td>Collection Kit</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stripping tray</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-361B</td><td></td></tr><tr><td>Liberty Dressing Forcep, pointed 13 cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>S17329&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Scissors - Sharp/Blunt Straight</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0562592&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sterile latex gloves&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-014-643&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Protective Apparel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Protective Apparel (Gown)</td><td>U-line</td><td>S-15374-M</td><td></td></tr><tr><td>Isolation gowns</td><td>U-line</td><td>S-15374-M</td><td></td></tr><tr><td>Sterile latex gloves&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-014-643&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>General purpose face mask</td><td>Cardinal Health</td><td>AT7511</td><td></td></tr><tr><td>Bonnets</td><td>Medline</td><td>CRI1001</td><td></td></tr><tr><td>Shoe covers</td><td>U-line</td><td>S-7873W</td><td></td></tr><tr><td>Media and Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hanks&amp;rsquo; Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Life Technologies</td><td>14175095</td><td>without calcium or magnesium</td></tr><tr><td>TrypZean (animal product&amp;ndash;free recombinant trypsin)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3449</td><td></td></tr><tr><td>Soybean Trypsin Inhibitor&amp;nbsp; 1g/50mL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6522</td><td></td></tr><tr><td>Cryostor CS5</td><td>BioLife Solutions</td><td>205102</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue reagent</td><td>Life Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Anti-EpCam-PE</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130 - 091-253</td><td></td></tr><tr><td>PE-isotype control</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-845</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD90-PeCy5</td><td>BD Pharmingen</td><td>555597</td><td></td></tr><tr><td>PeCy5-isotype control</td><td>BD Pharmingen</td><td>557224</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD105-APC</td><td>BD Pharmingen</td><td>562408</td><td></td></tr><tr><td>APC-isotype control</td><td>BD Pharmingen</td><td>340754</td><td></td></tr><tr><td>Collagen Type VI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7521</td><td></td></tr><tr><td>Consumables</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml graduated pipette</td><td>BD/Falcon</td><td>356550</td><td></td></tr><tr><td>10 ml graduated pipette</td><td>BD/Falcon</td><td>356551</td><td></td></tr><tr><td>5 ml graduated pipette</td><td>BD/Falcon</td><td>356543</td><td></td></tr><tr><td>50 ml falcon tubes</td><td>BD/Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>15 ml falcon tubes</td><td>BD/Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>15 cm Petri dishes</td><td>Corning</td><td>351058</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m filters</td><td>BD/Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &amp;mu;m filters</td><td>Millipore</td><td>SLGV033RS</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Pipette tips</td><td>Fisherbrand</td><td>02-707-401</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;mu;l Pipette tips</td><td>Fisherbrand</td><td>02-707-409</td><td></td></tr><tr><td>20 ml Syringe</td><td>BD/Medical</td><td>309661</td><td></td></tr><tr><td>Plastic spatula</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-245-97&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Plastic weighing boat</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-202-102&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cryo vials</td><td>Nunc</td><td>377267</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mr Frosty</td><td>Fisher Scientific</td><td>A451-4&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Biohazard Cabinet</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolation, cryopreservation and culture of human amnion epithelial cells for clinical applications

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a potential source of cells for regenerative medicine. The reason for this interest is evidence that these cells have highly multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory functions. These properties have prompted researchers to investigate the potential of hAECs to be used to treat a variety of diseases and disorders in pre-clinical animal studies with much success.
hAECs have found widespread application for the treatment of a range of diseases and disorders. Potential clinical applications of hAECs include the treatment of stroke, multiple sclerosis, liver disease, diabetes and chronic and acute lung diseases. Progressing from pre-clinical animal studies into clinical trials requires a higher standard of quality control and safety for cell therapy products. For safety and quality control considerations, it is preferred that cell isolation protocols use animal product-free reagents. 
We have developed protocols to allow researchers to isolate, cryopreserve and culture hAECs using animal product-free reagents. The advantage of this method is that these cells can be isolated, characterized, cryopreserved and cultured without the risk of delivering potentially harmful animal pathogens to humans, while maintaining suitable cell yields, viabilities and growth potential. For researchers moving from pre-clinical animal studies to clinical trials, these methodologies will greatly accelerate regulatory approval, decrease risks and improve the quality of their therapeutic cell population.

この手順が正しく実行されると、1.2億HAECを、平均収量は80から160000000セルの典型的な範囲で、期待されるべき。これらの収率で、83±4％の平均生存率が期待できる。臨床的方法で増加し、平均収率およびわずかに低い生存率に起因血清タンパク質の欠如のために、おそらく、動物由来の製品よりも高いトリプシン活性に起因する、とすることができる。単離されたHAECをは&lt;1％CD90、CD105間葉?...

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Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines.

臨床応用のためのヒト羊膜上皮細胞の単離、凍結保存と文化

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

13.8K ビュー.  Wake Forest University Health Sciences. We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines. 

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Isolation of Human Mesenchymal Stem Cells and their Cultivation on the Porous Bone Matrix

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific biomaterials. This work presents a novel option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) that employs bovine bone matrix Nukbone (NKB) as a scaffold. Thus, the application of MSCs in repair and tissue regeneration processes depends principally on the efficient implementation of the techniques for placing these cells in a host tissue. For this reason, the design of biomaterials and cellular scaffolds has gained importance in recent years because the topographical characteristics of the selected scaffold must ensure adhesion, proliferation and differentiation into the desired cell lineage in the microenvironment of the injured tissue. This option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) employs bovine bone matrix as a cellular scaffold and is an efficient culture technique because the cells respond to the topographic characteristics of the bovine bone matrix Nukbone (NKB), i.e., spreading on the surface, macroporous covering and colonizing the depth of the biomaterial, after the cell isolation process. We present the procedure for isolating and culturing MSCs on a bovine matrix.

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific biomaterials. This work presents a novel option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) that employs the bovine bone matrix Nukbone (NKB) as a scaffold.

ヒト間葉系幹細胞の単離および多孔質骨基質上での栽培

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific ...

発生生物学

A Novel Culture Model for Human Pluripotent Stem Cell Propagation on Gelatin in Placenta-conditioned Media

The propagation of human pluripotent stem cells (hPSCs) in conditioned medium derived from human cells in feeder-free culture conditions has been of interest. Nevertheless, an ideal humanized ex vivo feeder-free propagation method for hPSCs has not been developed; currently, additional exogenous substrates including basic fibroblast growth factor (bFGF), a master hPSC-sustaining factor, is added to all of culture media and synthetic substrata such as Matrigel or laminin are used in all feeder-free cultures. Recently, our group developed a simple and efficient protocol for the propagation of hPSCs using only conditioned media derived from the human placenta on a gelatin-coated dish without additional exogenous supplementation or synthetic substrata specific to hPSCs. This protocol has not been reported previously and might enable researchers to propagate hPSCs efficiently in humanized culture conditions. Additionally, this model obviates hPSC contamination risks by animal products such as viruses or unknown proteins. Furthermore, this system facilitates easy mass production of hPSCs using the gelatin coating, which is simple to handle, dramatically decreases the overall costs of ex vivo hPSC maintenance.

This protocol provides a simple and efficient way to propagate human pluripotent stem cells (hPSCs) using only conditioned media derived from the human placenta in a gelatin-coated dish without additional exogenous supplementation or hPSC-specific synthetic substrata.

ヒト多能性のための新しい文化モデルは、プラセンタ馴化培地中のゼラチンの細胞増殖幹

The propagation of human pluripotent stem cells (hPSCs) in conditioned medium derived from human cells in feeder-free culture conditions has been of ...

Reprogramming Primary Amniotic Fluid and Membrane Cells to Pluripotency in Xeno-free Conditions

Autologous cell-based therapies got a step closer to reality with the introduction of induced pluripotent stem cells. Fetal stem cells, such as amniotic fluid and membrane mesenchymal stem cells, represent a unique type of undifferentiated cells with promise in tissue engineering and for reprogramming into iPSC for future pediatric interventions and stem cell banking. The protocol presented here describes an optimized procedure for extracting and culturing primary amniotic fluid and membrane mesenchymal stem cells and generating episomal induced pluripotent stem cells from these cells in fully chemically defined culture conditions utilizing human recombinant vitronectin and the E8 medium. Characterization of the new lines by applying stringent methods &#8211; flow cytometry, confocal imaging, teratoma formation and transcriptional profiling &#8211; is also described. The newly generated lines express markers of embryonic stem cells &#8211; Oct3/4A, Nanog, Sox2, TRA-1-60, TRA-1-81, SSEA-4 &#8211; while being negative for the SSEA-1 marker. The stem cell lines form teratomas in scid-beige mice in 6-8 weeks and the teratomas contain tissues representative of all three germ layers. Transcriptional profiling of the lines by submitting global expression microarray data to a bioinformatic pluripotency assessment algorithm deemed all lines pluripotent and therefore, this approach is an attractive alternative to animal testing. The new iPSC lines can readily be used in downstream experiments involving the optimization of differentiation and tissue engineering.

This protocol describes the reprogramming of primary amniotic fluid and membrane mesenchymal stem cells into induced pluripotent stem cells using a non-integrating episomal approach in fully chemically defined conditions. Procedures of extraction, culture, reprogramming, and characterization of the resulting induced pluripotent stem cells by stringent methods are detailed.

主な羊水および膜 Xeno 無料条件で多能性細胞をリプログラミング

Autologous cell-based therapies got a step closer to reality with the introduction of induced pluripotent stem cells. Fetal stem cells, such as amniotic ...

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

The differentiation of human endometrial stromal cells (HESC) from fibroblast-like appearance into secretory decidua is a transformation required for embryo implantation into the uterine lining of the maternal womb. Improper decidualization has been established as a root cause for implantation failure and subsequent early embryo miscarriage. Therefore, understanding the molecular mechanisms underlying decidualization is advantageous to improving the rate of successful births. In vivo based studies of artificial decidualization are often limiting due to ethical dilemmas associated with human research, as well as translational complications within animal models. As a result, in vitro assays through primary cell culture are often utilized to explore the modulation of decidualization via hormones. This study provides a detailed protocol for the isolation of HESC and subsequent artificial decidualization via the supplementation of hormones to the culturing medium. Further, this study provides a well-designed method to knockdown any gene of interest by utilizing lipid-based siRNA transfections. This protocol permits the optimization of culture purity as well as product yield, thereby maximizing the ability to utilize this model as a reliable method to understand the molecular mechanisms underlying decidualization, and the subsequent quantification of secreted agents by decidualized endometrial stromal cells.

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

This study presents a validated and optimized procedure for the isolation and culture of human endometrial stromal cells to conduct in vitro decidualization assay. Further, this study provides a detailed method to efficiently knockdown a specific gene using siRNAs in human endometrial stromal cells.

エストロージェン体外用ひと子宮内膜間質細胞の分離

The differentiation of human endometrial stromal cells (HESC) from fibroblast-like appearance into secretory decidua is a transformation required for ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

ヒト胚性幹細胞を凍結融解

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

生物学

In Vitro Culture of Epithelial Cells from Different Anatomical Regions of the Human Amniotic Membrane

Several protocols have been reported in the literature for the isolation and culture of human amniotic epithelial cells (HAEC). However, these assume that the amniotic epithelium is a homogeneous layer. The human amnion can be divided into three anatomical regions: reflected, placental, and umbilical. Each region has different physiological roles, such as in pathological conditions. Here, we describe a protocol to dissect human amnion tissue in three sections and maintain it in vitro. In culture, cells derived from the reflected amnion displayed a cuboidal morphology, while cells from both placental and umbilical regions were squamous. Nonetheless, all the cells obtained have an epithelial phenotype, demonstrated by the immunodetection of E-cadherin. Thus, because the placental and reflected regions in situ differ in cellular components and molecular functions, it may be necessary for in vitro studies to consider these differences, because they could have physiological implications for the use of HAEC in biomedical research and the promising application of these cells in regenerative medicine.

This protocol describes the isolation of epithelial cells from different anatomical regions of the human amniotic membrane to determine their heterogeneity and functional properties for possible application in clinical and physiopathological models.

ヒト羊膜の異なる解剖学的領域からの上皮細胞のインビトロ培養

Several protocols have been reported in the literature for the isolation and culture of human amniotic epithelial cells (HAEC). However, these assume that ...

Human Pluripotent Stem Cell Culture on Polyvinyl Alcohol-Co-Itaconic Acid Hydrogels with Varying Stiffness Under Xeno-Free Conditions

The effect of physical cues, such as the stiffness of biomaterials on the proliferation and differentiation of stem cells, has been investigated by several researchers. However, most of these investigators have used polyacrylamide hydrogels for stem cell culture in their studies. Therefore, their results are controversial because those results might originate from the specific characteristics of the polyacrylamide and not from the physical cue (stiffness) of the biomaterials. Here, we describe a protocol for preparing hydrogels, which are not based on polyacrylamide, where various stem, cells including human embryonic stem (ES) cells and human induced pluripotent stem (iPS) cells, can be cultured. Hydrogels with varying stiffness were prepared from bioinert polyvinyl alcohol-co-itaconic acid (P-IA), with stiffness controlled by crosslinking degree by changing crosslinking time. The P-IA hydrogels grafted with and without oligopeptides derived from extracellular matrix were investigated as a future platform for stem cell culture and differentiation. The culture and passage of amniotic fluid stem cells, adipose-derived stem cells, human ES cells, and human iPS cells is described in detail here. The oligopeptide P-IA hydrogels showed superior performances, which were induced by their stiffness properties. This protocol reports the synthesis of the biomaterial, their surface manipulation, along with controlling the stiffness properties and finally, their impact on stem cell fate using xeno-free culture conditions. Based on recent studies, such modified substrates can act as future platforms to support and direct the fate of various stem cells line to different linkages; and further, regenerate and restore the functions of the lost organ or tissue.

A protocol is presented to prepare polyvinyl alcohol-co-itaconic acid hydrogels with varying stiffness, which were grafted with and without oligopeptides, to investigate the effect of the stiffness of biomaterials on the differentiation and proliferation of stem cells. The stiffness of the hydrogels was controlled by the crosslinking time.

Xeno 無料条件下におけるさまざまな剛性とポリビニル アルコール Co イタコン酸ゲルのひと多能性幹細胞文化

The effect of physical cues, such as the stiffness of biomaterials on the proliferation and differentiation of stem cells, has been investigated by ...

生物工学

ヒト幹細胞由来網膜色素上皮細胞の凍結保存の進歩

Cryopreservation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells at the Optimal Stage

Retinal pigment epithelial&#160;(RPE) cells derived from human embryonic stem cells (hESCs) are superior cell sources for cell replacement therapy in individuals with retinal degenerative diseases; however, studies on the stable and secure banking of these therapeutic cells are scarce. Highly variable cell viability and functional recovery of&#160;RPE cells after cryopreservation are the most commonly encountered issues. In the present protocol, we aimed to achieve the best cell recovery rate after thawing by selecting the optimal cell phase for freezing based on the original experimental conditions. Cells were frozen in the exponential phase determined by using the 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine labeling assay, which improved cell viability and recovery rate after thawing. Stable and functional cells were obtained shortly after thawing, independent of a long differentiation process. The methods described here allow the simple, efficient, and inexpensive preservation and thawing of hESC-derived RPE cells. Although this protocol focuses on RPE cells, this freezing strategy may be applied to many other types of differentiated cells.

著者スポットライト:網膜色素上皮細胞凍結の効率的で実現可能な方法の開発

This study provides a detailed protocol for the efficient cryopreservation of human stem cell-derived retinal pigment epithelial cells.

ヒト胚性幹細胞由来網膜色素上皮細胞の最適段階での凍結保存

Retinal pigment epithelial&#160;(RPE) cells derived from human embryonic stem cells (hESCs) are superior cell sources for cell replacement therapy in ...

臨床応用のためのヒト羊膜上皮細胞の単離、凍結保存と文化

要約

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この動画の章

ヒト間葉系幹細胞の単離および多孔質骨基質上での栽培

ヒト多能性のための新しい文化モデルは、プラセンタ馴化培地中のゼラチンの細胞増殖幹

主な羊水および膜 Xeno 無料条件で多能性細胞をリプログラミング

エストロージェン体外用ひと子宮内膜間質細胞の分離

ヒト胚性幹細胞を凍結融解

ヒト羊膜の異なる解剖学的領域からの上皮細胞のインビトロ培養

Xeno 無料条件下におけるさまざまな剛性とポリビニルアルコール Co イタコン酸ゲルのひと多能性幹細胞文化

ヒト胚性幹細胞由来網膜色素上皮細胞の最適段階での凍結保存

ヒト胚性幹細胞由来網膜色素上皮細胞の最適段階での凍結保存

ヒト胚性幹細胞由来網膜色素上皮細胞の最適段階での凍結保存

臨床応用のためのヒト羊膜上皮細胞の単離、凍結保存と文化

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ヒト間葉系幹細胞の単離および多孔質骨基質上での栽培

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主な羊水および膜 Xeno 無料条件で多能性細胞をリプログラミング

エストロージェン体外用ひと子宮内膜間質細胞の分離

ヒト胚性幹細胞を凍結融解

ヒト羊膜の異なる解剖学的領域からの上皮細胞のインビトロ培養

Xeno 無料条件下におけるさまざまな剛性とポリビニル アルコール Co イタコン酸ゲルのひと多能性幹細胞文化

ヒト胚性幹細胞由来網膜色素上皮細胞の最適段階での凍結保存

ヒト胚性幹細胞由来網膜色素上皮細胞の最適段階での凍結保存

ヒト胚性幹細胞由来網膜色素上皮細胞の最適段階での凍結保存

Xeno 無料条件下におけるさまざまな剛性とポリビニルアルコール Co イタコン酸ゲルのひと多能性幹細胞文化