このプロトコルは、羊膜から分離されたヒト羊膜上皮細胞の異質性および機能的特性に関する重要な質問に答える助けとなる。以前のプロトコルは、領域間を識別することなく共羊膜から細胞を単離したが、我々のプロトコルは、3つの異なる解剖学的領域から分離された細胞集団の培養を可能にする。羊膜を領域別に分離するには、無菌条件下でバイオセーフティキャビネットにおいて、臍帯を包む臍羊膜、デシドゥア基底を覆う胎盤羊膜、および胎盤に付着していない残りの羊膜と考えられる反射領域を特定する。
臍帯の領域を解剖するには、解剖鉗子を使用して胎盤と臍帯の接合部を覆う羊膜の部分を保持し、カメスを使用してコードを取り囲む領域を解剖し、延伸しながら領域をコリオンから分離する。次いで、100ミリリットルの生理食塩水を標識ビーカーに分離した組織を沈着させる。胎盤羊膜領域を解剖するには、無菌綿ガーゼを使用して、胎盤を覆う絨毛/羊膜の表面から血栓を取り除きます。
そして、解剖鉗子を使用して、胎盤と反射領域の境界上の膜を把握する。メスを使って胎盤の周囲を切り取り、胎盤から血管を切らないで、胎盤の羊膜を切り離します。分離した組織を、300ミリリットルの生理食塩水を用いて別の標識ビーカーに入れる。
そして、胎盤に付着していない羊膜の残りの部分を絨毛膜から分離する。次に、300ミリリットルの生理食塩水を用いて、別の標識ビーカーに反射領域を入れる。膜を洗浄するには、ピンセットを使用して滅菌表面に置き、組織の各容器から生理液を廃棄できるようにします。
容器に戻して膜を置き、100ミリリットルの新鮮な生理食塩水を臍帯領域に加え、300ミリリットルの新鮮な生理食塩水を胎盤および反射領域に加えます。解剖鉗子を使用して膜をかき混ぜて血液残留物を除去し、生理液を廃棄できるように無菌表面に膜を置きます。次に、組織が半透明になるまで、少なくとも2回、実証したように、膜を洗浄します。
異なる羊膜領域の酵素消化のために、反射および胎盤領域を2つまたは3つの断片に切断する。そして、断片と臍帯領域を個々の50ミリリットル遠心管に入れる。0.5%トリプシン-EDTAの20ミリリットルを、反射および胎盤領域組織断片の各チューブに加え、0.5%トリプシン-EDTAの5ミリリットルを臍領域組織を含むチューブに加える。
チューブを30秒間軽く振ります。その後、滅菌表面に膜を置き、トリプシン-EDTA溶液を廃棄し、反射および胎盤領域組織断片の新鮮な0.5%トリプシン-EDTAの30ミリリットルと臍帯組織の新鮮な0.5%トリプシン-EDTAの15ミリリットルに置き換えます。その後、チューブをインキュベーター内のローテーターに入れ、摂氏37度で毎分20回転で40分回転します。
インキュベーションの終わりに、細胞溶液の全容を新しい円錐形の管に移す。そして、氷上の各チューブに37°CのヒトAE細胞培地の2倍の体積を加えます。ちょうど実証したように、新鮮な0.5%トリプシン-EDTAで元のチューブ内の残りの組織断片を消化します。
2回目の消化の終わりに、切除鉗子のペアを使用して羊膜部分の一端を保持し、2番目の1組の解剖鉗子を残りの組織に沿って絞り、前のインキュベーション期間中に完全に剥がれなかった上皮細胞の行を除去する。次いで、第2の消化液を遠心分離管の第2のセットに移すことができるように膜を取り除く。そして、氷の上の新鮮な37°CのヒトAE細胞培地の2倍の体積で消化酵素を不活性化する。
ヒトAE細胞単離のために、遠心分離によって細胞を沈下する。そして、新鮮な37°CのヒトAE細胞培地の10ミリリットルで各チューブのペレットを再懸濁する。消化の各ペアを1つのチューブに引き込み、100マイクロメートルのストレーナーを通して懸濁液を濾過し、細胞外マトリックスの破片を取り除きます。
計数後、3つの領域のヒトAE細胞を個々の100ミリメートルプレートに3倍の100ミリメートルプレートに播種し、37°CのヒトAE細胞培地で4センチメートル平方濃度に、ヒト表皮成長因子の1ミリリットル当たり10ナノグラムを添加する。次に、目的の下流分析まで加湿インキュベーターでノルモキシ条件下で37°Cで培養をインキュベートする。48時間培養後、上皮表現型を有するヒトAE細胞はプレートの表面に付着し、上清には培地が変化した後に除去できる細胞デブリおよび浮遊細胞が含まれる。
細菌汚染の存在を特定する際に培養を廃棄し、別の膜を処理し、膜の洗浄が不十分なために赤血球を過剰に、欠乏または非接着性細胞、または線維芽細胞形態を有する細胞を同定することが推奨される。ヒトAE細胞形態は細胞の起源に依存し、反射領域からの細胞は立方体形態を示し、石畳の単層で成長し、胎盤および臍帯からの細胞は平坦で扁平上皮である。Eカドヘリンに対する免疫蛍光は、主要な培養およびサブ培養物が上皮表現型を維持していることを明らかにし、別の細胞型の汚染がないことを示唆している。
さらに、細胞は、Ki-67増殖マーカーの発現によって証明されるように、生存可能である。羊膜からの亜集団は形態や機能が異なるが、多能性因子のコアの発現および存在は、胎盤および反射領域に由来するヒトAE細胞では変化しない。ヒト羊膜上皮細胞は多能性幹細胞の供給源として考えられるため、各領域の細胞が異なる可能性を持っているかどうかを解明するために、特定の定義プロトコルのラインを通じてそれらに挑戦することができます。
開始されたプロトコルの前に、組織が感染の微生物学的特性を示さないことを確認するために患者の病歴を見直す。
