これは、酵母MoCloキットを用いて多遺伝子プラスミドを組み立てるための詳細なプロトコルです。この方法により、さまざまな多遺伝子級のクローン作成が可能になります。関連部品の大きなライブラリを生成するのに理想的です。
ゴールデンゲート反応ミックスを設定することで始めます。各PCR産物とエントリーベクターのフェムトモレを20個加え、10X T4リガーゼバッファーの1マイクロリットル、Esp3Iの0.5マイクロリットル、およびT4リガーゼの0.5マイクロリットルを加える。二重蒸留水を加え、総体積を10マイクロリットルにします。
次に、クローニング反応を実行します。熱ショックにより、反応ミックス全体をDH5アルファ株または同等のエシェリヒア・コリ化学的に有能な細胞に変換します。1ミリリットルクロラムフェニコールあたり35マイクログラムのlbプレートに細胞を広げます。
その後、一晩摂氏37度でプレートをインキュベートします。16~18時間後、プレートをインキュベーターから取り出し、約5時間摂氏4度にして、スーパーフォルダグリーン蛍光タンパク質またはsfGFPがより強い緑色に発達させます。プレートをスクリーニングするには、紫外線または青色光のトランスイルミエータに置きます。
コロニーを含むsfGFPは、UV光の下で蛍光を発する。緑色のコロニーは、ノーカット部分プラスミドが含まれているため、負です。白いコロニーは陽性である可能性が高い。
クローニングは、30〜100%白色のコロニーがある場合に成功します。中間ベクターを、左コネクタ、sfGFPドロップアウト、右コネクタ、酵母選択マーカー、複製酵母起源、mRFP1、大腸菌起源、アンピシリン耐性遺伝子を有するプラスミドの一部を組み立てます。テキスト原稿に記載されているとおりにクローニング反応を行います。
DH5アルファ株に全体の反応ミックスを変換し、ミリリットルカルベニシリンまたはアンピシリンあたり50マイクログラムでlbプレート上の細胞を広げます。一晩摂氏37度でインキュベートします。16~18時間後、インキュベーターからプレートを取り出します。
プレートには淡い赤と淡い緑のコロニーの両方が含まれます。mRFP1とsfGFPを成熟させるために約5時間摂氏4度に保ちます。UV またはブルー ライト のトランスイルミネーターを使用して、正しい中間ベクターを含む緑のコロニーを特定します。
lbカルベニシリンプレートに緑色のコロニーを取り出し、一晩で摂氏37度でインキュベートします。翌日、クロラムフェニコールプレートに再びストリークアウトし、一晩で摂氏37度でインキュベートします。クロラムフェニコールプレート上に成長するコロニーには、誤って組み立てられたプラスミドが含まれています。
中間ベクターが正常に組み立てられたら、転写ユニットの組み立てに進みます。この4ピースアセンブリには、中間ベクター、プロモーター、CDS、および決定要因が含まれています。プラスミドを精製し、その濃度を記録し、各プラスミドをマイクロリットル当たり20フェムトモレに希釈します。
クローニング反応を行った後、クローニング反応ミックス全体をDH5アルファまたは同等の大腸菌のコンピテントセルに変換し、LBNカルベニシリンにプレートします。その後、一晩摂氏37度でプレートをインキュベートします。16~18時間後、プレートをインキュベーターから取り出し、約5時間摂氏4度に保ち、sfGFPを成熟させます。
UV または青色光のトランスイルミネーターを使用して、正しい転写ユニットを含む非蛍光白色コロニーを特定します。テキスト原稿に記載されているように、多遺伝子プラスミドの中間ベクターを組み立てる。その後、全体のクローニング反応ミックスをDH5アルファ細胞に変換し、ミリリットルカナマイシンあたり50マイクログラムでlbにそれらをプレートします。
一晩摂氏37度でプレートをインキュベートします。赤と緑の色ベースのスクリーニングを実行し、前に示したように誤ったアセンブリをスクリーニングするためにlbカナマイシンプレート上の緑のコロニーをストリークし、成長させます。次に、テキスト原稿に記載されているようにクローニング反応を設定して多遺伝子プラスミドを組み立てる。
全体のクローニング反応ミックスをDH5アルファ細胞に変換し、lbカナマイシンにそれらをプレートします。一晩摂氏37度でプレートをインキュベートします。次に、先に説明したとおりにグリーンとホワイトのスクリーニングを行います。
このプロトコルは、ADE2遺伝子座を破壊するための1つの統合的な多遺伝子プラスミドを構築するために使用された。4つの複製性および1つの統合的な多遺伝子プラスミドを組み立てた。中間ベクタークローニングに対する潜在的に正しいコロニーの比率は、中間プラスミドをクローニングすると1.83%であったが、中間体からのマルチ遺伝子プラスミドの組み立て成功率は93.77%であった陽性白色コロニーの無視できる数は、多遺伝子プラスミドの最適以下の集合を示す。
酵母に変えた後、β-カロテンとリコピンを産生するコロニーは3日目に成長した。各プレートから4つのコロニーを新鮮なプレートにストリークアウトし、さらに2日間成長させた。カロテノイドを抽出し、UV-Vis分光光度法によって定量した。
BTS1/ERG20は、ERG20単独の株に比べてβ-カロテンの35倍高い生産につながります。同様に、リコピンの生産は、ERG20単独と比較して、BTS1/ERG20の株で約16.5倍高い。多遺伝子統合プラスミドは、gRNAとヘルパーDNAを持たないか、gRNAとヘルパーDNAとして多遺伝子統合プラスミドのいずれかで、ADE2遺伝子座の破壊のために使用されました。
3~4日後、YPDプレートにNourseothricinを用いて赤色コロニーが観察され、ADE2が正常に破壊されたことを示す。この方法を試みている間に覚えておかねばなることが最も重要なことは、この反応ミックスを設定しながらDNA濃度を正確に測定し、ピペットを注意深く測定することです。この技術により、酵母代謝工学の分野の研究者は、製品収量を最大化するために多数の遺伝子およびプロモーターを調査することができます。
