The present study was funded in part by a Research Initiation Grant (RIG) from the University of North Texas to Dr. McFarlin. The authors did not receive direct funding for the completion of this study and report no conflict of interest.

注：このメソッドに記述されているすべての血液採取手順はヘルシンキ宣言に従って行われ、被験者のためのUNT治験審査委員会（IRB）により承認された。すべての被験者は正常な体重、彼らは明らかに健康であることを確実にするために、本発明の方法で使用された血液採取のための書面による同意を与えた、と無病。 1.試薬ソース＆準備<ol><li>使用CD66b-APC（クローン＃のG10F5、DF = 1：50）とCD45-APCeFluor780（クローン＃2D1; = 1 DF：50）このアッセイのために。 注：前に研究するために、CD45とCD66b抗体は、他の白血球から最適希釈はっきり解決顆粒球（CD45 + / 66B +）を決定するために、力価測定した（CD45 + / 66b-）11。染色するための希釈した抗体を添加すると、チューブの最終希釈は875だった。 </li><li>株式Sを購入し、解凍pHrodo赤い色素で標識された黄色ブドウ球菌生体粒子。 1mの濃度でサスペンド滅菌PBSで1ml当たり生体粒子のグラム。アリコートをアッセイに使用するまで-20℃で凍結生体粒子及びストアを希釈する。 </li><li>ジヒドロエチジウム（DHE）を溶解し、10グラム/ mlの最終濃度までDMSOに、酸素フリーラジカル（ すなわち、酸化的バースト）の存在下で蛍光エチジウムブロマイドに変換される。 </li><li>それぞれが200mg / mlおよび17.5ミリグラム/ミリリットルの2段階希釈液の無菌PBSと混合（指定されたアッセイのインキュベーション期間は、次の追加の食作用を防止するために使用される）、N-エチルマレイミド。アッセイでは、15 mMの最終濃度を使用する。 N-エチルマレイミドを解凍する際のN-エチルマレイミドを溶液中に残存しないように、37℃のヒートブロックを使用する。 </li><li>最後の固定工程の後、核DNAを染色するために7AADを使用しています。添加の前に、滅菌PBSで株式7AAD 1:10に希釈する。 </li></ol> 2.血液サンプル採取<ol><li> O / N速い（&gt;炉冷し）とabstenti以下の研究室に到着する科目を掲載身体活動（&gt; 12時間）から上に。 </li><li>アルコール準備パッドで皮膚を洗浄後、末梢腕静脈に無菌の採血針を挿入します。 </li><li>市販のヘパリンナトリウムで満たされている避難チューブに血液を収集します。 </li><li>収集後、被験者の腕に接着剤包帯を適用します。 </li><li> 10回を混合するために、血液チューブを反転してから分析までロッカーに置きます。 </li></ol> 3.食作用アッセイ法<ol><li>解凍黄色ブドウ球菌の生体粒子（RT）、DHE（RT）、及びN-エチルマレイミド（37°C）。 </li><li>無菌フードでの作業中に4個々の1.2ミリリットルチューブに黄色ブドウ球菌の生体粒子の20 Lを追加します。 </li><li>生体粒子を含む各チューブにDHEの40 Lを追加します。 </li><li>静かにチューブの底に試薬を収集するためにベンチ表面にチューブをタップします。 </li><li>生体粒子とDHEで充填されている各チューブに混合の全血100 Lを追加します。 </li><li>すべての汚染血液を除去するために綿先端アプリケーターで、チューブの内側の端を拭きます。 </li><li>血液添加後3サイクルのための血液と試薬を混合するために設定された電子ピペットを用いて血液と試薬を混ぜる。 </li><li>アイスバケットでアッセイチューブを配置し、光から保護するためにカバーしています。 </li><li> 10、20、および40分間のアッセイチューブをインキュベートする。すべてのアッセイチューブが同時に完了を保証するために40分間の管で始まる。 </li><li> 37°Cビード浴中で解凍N-エチルマレイミド。 </li><li>ピペットで各アッセイチューブに（1.4で上述）N-エチルマレイミドの15リットル、30分インキュベートする。 </li><li>ピペットCD66b-APCの10 LおよびCD45-APCeFluor780（1.1において上述）で希釈した抗体の10 Lは、60分間インキュベートする。 </li><li>ピペットで各アッセイチューブにWBC修正/ RBCの溶解液を750 Lは、60分間インキュベートする。 </li><li>遠心分離機細胞ペレットを収集するためのアッセイチューブ（400×gで10分）。 </li><li>真空が残留FLを残して、WBC溶解/ RBCの定着液を吸引細胞ペレットを上記のuid体積（100L）。 </li><li>ピペット（1.5において上述した）希釈7AAD溶液10 Lと50 LのPBSを各アッセイチューブに。 </li><li>冷蔵庫で1箔でアッセイチューブ、ラップチューブ上のキャリブレーションビーズ（〜25 L）各アッセイチューブに、場所キャップの低下、および場所を追加します。 </li><li>サイトメーター画像ベースのフローにサンプルチューブをロードし、事前定義されたパラメータを使用して3000顆粒球イベントの最小収集：オートサンプラー、青（488 nmの、60ミリワット）、赤（640 nmの; 100 NW）、SSC（785 nmのを。 8.5 mW）とレーザー（ 図1）。 </li></ol><img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52201/52201fig1highres.jpg" /> 図1.取得方法＆テンプレート。サンプルは、画像ベースのフローサイトメーター（A）で得た。買収時には、CD66b-APC対明視野アスペクト比のドットプロットを使う、スパイク、キャリブレーションビーズから分離顆粒球に生成されたG INSPIRE V。100.2.292.0ソフトウェア（B）。赤、（640ナノメートル; 100 NW）、SSC（785ナノメートル、8.5ミリワット）レーザ、5000顆粒球の最小値は青オートサンプラー、（60 mWの488 nm）を使用して、各サンプルについて、取得した。ヒストグラムの数は、レーザーの設定とデータの他の側面収集を監視するために取得中に存在していることに注意してください。これらのヒストグラムはすべてオプションと実験室の標準的な操作手順は、品質管理として、それらを必要とする場合にのみ必要である。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52201/52201fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 4.サンプル収集と分析<ol><li>生の画像ファイル（RIF）に補償行列を適用し、画像化されたファイル（CIF）を補う作成するIDEASソフトウェアの自動ソフトウェア補償ウィザードを使用してください。 </li><li> IDEASソフトウェアで個々のCIFファイルをロードし、顆粒球サブセットを識別するために、次のプロットを生成します。 </LI&gt; <li>明視野勾配RMS（ 図2A）のヒストグラムを用いて、焦点にあるとみなされた細胞を同定するための最初のゲートを確立する。参照標準として非刺激対照を使用して、各患者試料について、この決定を行う。 </li><li>明視野のアスペクト比（幅対セルの高さの比）対明視野領域（ 図2B）のドットプロットを使用して、破片およびダブレットから独立した一細胞に二次プロットを使用する。参照標準として非刺激対照を使用して、各患者試料について、この決定を行う。 </li><li>細胞のきれいな集団が同定されたら、積極的に顆粒球（CD45 + / 66bが+）を識別するCD66b対CD45（ 図2C）のドットプロットを確立する。 S.のための明るいディテール強度の娘プロット（ 図3）を作成します活性化顆粒球のサブセットを識別するために、対酸化的バースト（DHE、y軸）のために明るい詳細強度球菌 （x軸）。 BRを収集チャンネル1と9のIGHTフィールド画像、チャンネル2で生体粒子、DHEチャンネル4で、7AADチャンネル5で、CD66bチャンネル11、およびCD45で12チャンネルで。 </li></ol><img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52201/52201fig2highres.jpg" /> 図2.分析テンプレート。この図は、焦点（A）であった細胞を同定するために生成された一連のプロット、単一細胞（B）、顆粒球（C）。追加のプロットは活性化顆粒球対非アクティブな顆粒球の3つのサブセットを同定するために使用した。取得した画像ファイルはすべて分析はアイデアV.6ソフトウェアを使用して完成させた。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52201/52201fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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The authors have nothing to disclose.

本発明の方法は、1,3,4,12-14フローサイトメトリーを用いて顆粒球機能の評価のための既存の方法の改良を表す。このアッセイの重要なステップは、生体粒子およびDHEと血液試料の適切な混合に関連する傾向がある。不完全な混合は不正確な結果になります。完全な混合が重要である一方、混合方法は、自然の中で穏やかにする必要があります。これは、混合は、混合機能を備えた電子ピペットはなく、ボルテックスミキサーを使用して達成することが示唆された。アッセイにおけるもう一つの重要なステップは、常にアッセイチューブの上半分を汚染全く血がないことを確認することです。この残留血液を、滅菌綿棒を用いて除去することができる。そうする障害は、未溶解した赤血球と最終アッセイ調製物を汚染する可能性があるため、完全に除去することが重要である。 適切な補償制御が種をコントロールするために添加されるべきで、この方法を使用する前に顆粒球機能の様々な態様を特定するために使用される試薬の間でectral重複。この方法では、補償制御は、40分間のアッセイインキュベーションを示唆し、1つのマーカー（ すなわち、大腸菌 、DHE、など）で標識化された血液サンプルを採取することを含む。標識後、単一の正のイベントが収集され、補償行列は、IDEAS解析ソフトウェアで自動化されたウィザードを使用して生成される。これは、このアッセイが使用される場合、適切な補償制御が適切なアッセイ性能を確保するために完了していることが重要である。 分析は、明るいディテール強度が集団を分離するための最良の変数であることを特定し、また多くの重複が酸化的バーストおよび食作用信号の間に存在しているかを識別するための機能ファインダーと共局在のウィザードを使用して達成される。具体的には、画像ベースのフローサイトメトリーの使用は、3つのサブセットに活性化顆粒球を分離する能力を提供した。 T彼のサブセット破壊は酸化的バースト対食作用の明るい細部の強度を用いて決定した。これらの特異な細胞機能を調べることに加えて、同じ解剖学的位置（共局在）で同時に両方のイベントを示した細胞が同定された。 「高活性な」サブセットに落ちた顆粒球は食作用および酸化的バーストの間で一貫性の共局在を示した唯一の表現型であった。活性化した顆粒球サブセットのこの識別は、トラブルシューティングが必要とされる最大の領域です。新しいユーザがIDEASのサンプルプロセスワークフローを理解するために時間がかかるし、撮像コンポーネントを使用して細胞集団をゲーティングの仕組みを理解することが非常に重要である。ユーザーが作るために求めることができる他の修飾には、代替または追加のアッセイインキュベーション時間の選択を含む。現在の方法は、10〜40分の持続時間の使用を示唆している。しかしながら、この方法は、実験モデルに応じて使用するには、より長い検定期間を選択することが必要であり得る。このような改変は、個別に評価する必要があろう。 さらに、それは、アッセイのインキュベーション期間は3活性化サブセットの外観に大きな影響を与えることが判明した。この報告書に記載されたアプローチは、以前顆粒球機能3,4,13,15に関して得ることができるどのような情報の拡張を表します。他の研究室は、免疫および疾患15-17の包括的評価の一部として、顆粒球機能の変化を評価することの重要性を実証した。このアッセイの可能性にもかかわらず、それには限界がないわけではない。主な制限の一つは、高いサンプルスループット処理に伴うコストと時間の需要である。研究デザインは、特定の日に多数のサンプルを必要とするとき、これらは加工が困難であることができる。処理は、電子ピペットとディスペンサーを使用することによって合理化され、これらは高価になる傾向があり、あらゆる実験室で必ずしも利用できない。 研究の私たちの地域は、運動と食生活は免疫系の健康と機能6,8-10,18-20にどのように影響するかの研究に焦点を当てています。このような目的は、人間の健康の様々な分野のための重要な実用的な意味を持っている。貪食機能のモニタリングが治療成績に重要となる運動と栄養効果の研究を超えて、この原稿で実証食作用方法は、臨床免疫学の他の分野で有用である可能性があります。本発明のアッセイは、潜在的に免疫学的アッセイは、イメージベースのフローサイトメーターからCANことができますユニークな撮影情報の利点を取ることによって、再発明されていることを多くのの最初のものです。

顆粒球は抗原の侵入に対する防御の第一線を提供し、体の自然免疫系の一つの成分を表している。顆粒球機能を評価するための従来の方法は、それが困難な顆粒1-4を変更したかをまとめて把握すること、別個の方法を使用して、食作用能力または酸化的バーストに焦点を当てた。流れの分野における進歩は、フローサイトメトリーのハイスループット様式5のセルの高解像度、マルチカラー撮像が可能な卓上型機器の生産をもたらした。従来のフローサイトメトリーでイメージングを組み合わせる能力は、既存のフローサイトメトリー法内革新および免疫系に関する新しい情報を抽出するために必要な技術的プラットフォームを提供進歩を表す。 過去10年間で、私たちの研究室では、特に、鋭く、様々な栄養と運動療法パットの効果が注目されている先天性の免疫機能6-9でRNS。この原稿で実証方法は、臨床免疫学の分野内で実用的な意味を持っている。本発明の方法は、同時に細菌粒子と酸化的バーストの食作用を測定するための画像ベースのフローサイトメトリーのパワーを活用しています。このアプローチを用いて、分析の画像ベースの部分で提供さ変数を使用して活性化顆粒球を分離することができる。これらのサブセットは、個々の顆粒球上の細胞の画像を評価するた後だけに識別可能であった。さらに、アッセイのインキュベーション時間は3活性化サブセット10との間の遷移に影響を与えた。これにより、複数のインキュベーション時間の使用は、特定の実験的治療後の顆粒球機能の変化を試験するための方法を可能にすることができることはもっともらしい。本稿の目的は、同時にoxidatで食作用を測定するために画像ベースのフローサイトメトリーを用いて顆粒球機能を評価する方法を実証することであったIVEはバースト。

<table><tbody><tr><td>Vacutainers</td><td>BD Life Sciences</td><td></td><td>used for blood collection</td></tr><tr><td>WBC Fixative / RBC Lysis solution</td><td>eBioscience</td><td>00-5333-57</td><td></td></tr><tr><td>CD66b-APC</td><td>eBioscience</td><td>clone G10F5</td><td></td></tr><tr><td>CD45-APCeFluor780</td><td>eBioscience</td><td>clone 2D1</td><td></td></tr><tr><td>&lt;i&gt;S. aureus&lt;/i&gt; bioparticles</td><td>Life Technologies</td><td>A10010</td><td></td></tr><tr><td>dihydroethidium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7008</td><td></td></tr><tr><td>N-ethylmalemide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4259</td><td></td></tr><tr><td>7AAD</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hematology Analyzer</td><td>Mindray</td><td>BC-3200</td><td></td></tr><tr><td>96-channel pipet</td><td>Integra Biosciences</td><td>ViaFlo</td><td></td></tr><tr><td>Bead Bath Incubator</td><td>LabArmour</td><td>BeadBath</td><td></td></tr><tr><td>Imaging Flow Cytometer</td><td>EMD Millipore</td><td>Amnis FlowSight</td><td></td></tr><tr><td>INSPIRE Software</td><td>EMD Millipore</td><td>Amnis INSPIRE</td><td></td></tr><tr><td>IDEAS Software</td><td>EMD Millipore</td><td>Amnis IDEAS</td><td></td></tr><tr><td>X-Pierce Piercable Plate Sealer</td><td>Excel Scientific, Inc.</td><td>X-Pierce</td><td></td></tr><tr><td>Dell Precision Workstation</td><td>Dell Computers</td><td>Various</td><td>Used for IDEAS analysis</td></tr></tbody></table>

image-based flow cytometry technique to evaluate changes in granulocyte function in vitro

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte function, in general these are limited in terms of the information they can provide. For example, most existing assays merely provide a percentage of how many granulocytes are activated following a single, fixed length incubation. Complicating matters, most assays focus on only one aspect of function due to limitations in detection technology. This report demonstrates a technique for simultaneous measurement of granulocyte phagocytosis of bacteria and oxidative burst. By measuring both of these functions at the same time, three unique phenotypes of activated granulocytes were identified: 1) Low Activation (minimal phagocytosis, no oxidative burst), 2) Moderate Activation (moderate phagocytosis, some oxidative burst, but no co-localization of the two functional events), and 3) High Activation (high phagocytosis, high oxidative burst, co-localization of phagocytosis and oxidative burst). A fourth population that consisted of inactivated granulocytes was also identified. Using assay incubations of 10, 20, and 40-min the effect of assay incubation duration on the redistribution of activated granulocyte phenotypes was assessed. A fourth incubation was completed on ice as a control. By using serial time incubations, the assay may be able to able to detect how a treatment spatially affects granulocyte function. All samples were measured using an image-based flow cytometer equipped with a quantitative imaging (QI) option, autosampler, and multiple lasers (488, 642, and 785 nm).

画像ベースのフローサイトメトリーを使用すると、我々は、3つの異なる活性化サブセット（ 図3）への活性化顆粒球の均一な集団を分離させた。この方法では、最も効果的な方法は、3活性化サブセットを酸化的バースト対（ 黄色ブドウ球菌 ）（DHE）（;図4図3）食作用のために明るいディテール強度をプロットしている解決します。また、IDEASソフトウェアの共局在ウィザードを使用することは非常に活性化顆粒球の特徴的な兆候である、同時食作用および酸化的バーストの存在の定量化を可能にする。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52201/52201fig3highres.jpg" /> 活性化顆粒球サブセットの図3の同定は、細胞表面マーカー（CD45 + / 66bが+）を用いて顆粒球の同定後、娘プロットは明るい細部INTENで生成された酸化的バーストのための明るいディテール強度対食作用のためにsity。このアプローチは、中程度のアクティブ、非アクティブ（紫）、ローアクティブ（赤、A）、（青、B）の割合は、高活性な（黄色、C）顆粒を使用することを決定した。このゲーティング技術は、種々の活性化顆粒球サブセットの相対的な存在量に関するアッセイインキュベーション時間の効果を評価するために使用した。 「ハイアクティブ」顆粒球の割合が最も高いが、40分間インキュベーション後に存在していた。取得した画像ファイルはすべて分析はアイデアV.6ソフトウェアを使用して完成させた。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52201/52201fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 活性化顆粒球の三つの異なるサブセットの存在を示すことに加えて、それは、アッセイインキュベーション時間は、各活性化顆粒球サブセットの相対量に影響を与えたことが実証された。具体的には、40分株式会社ubationは「高アクティブ」顆粒球の最大の割合をもたらした。少なくとも三つのアッセイインキュベーション期間を含めることによって、所与の臨床治療が、顆粒球の一時的な活性化状態を変化させる方法を決定することも可能である。これは、食作用および酸化的バーストの同時測定の関数として、異なる活性化顆粒球のサブセットを識別するために画像ベースのフローサイトメトリーを使用して最初の公表された方法である。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/52201/52201fig4highres.jpg" /> 細胞マーカーの図4の代表的な画像は 、ハイアクティブ（A）として分類された細胞の画像ギャラリー、適度な活性（B）、及び、ローアクティブ（C）は、この図に示されている。 黄色ブドウ球菌の生体粒子はCH03である、酸化的バーストは、CD66bはである、側方散乱がCH06である、核のための7AADがCh05である、CH04であるCH11、およびCD45はのCh12である。また、酸化的バースト（CH04）対食作用（CH03）の共局在マージ画像が表示される。マージ画像で黄色のエリアその食作用および酸化的バーストを示すが同時に同じ解剖学的空間で発生している。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52201/52201fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

This method demonstrates a technique for assessing granulocyte function by simultaneously measuring phagocytosis of bacteria and oxidative burst. Image-based flow cytometry allowed for the identification of three distinct subsets of activated granulocytes that all differed in their relative functional capacity.

顆粒球機能の変化を評価するために、イメージベースのフローサイトメトリー技術<em&gt;インビトロ</em

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

12.4K ビュー.  University of North Texas. This method demonstrates a technique for assessing granulocyte function by simultaneously measuring phagocytosis of bacteria and oxidative burst. Image-based flow cytometry allowed for the identification of three distinct subsets of activated granulocytes that all differed in their relative functional capacity.

ビデオ: Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable method of analysis by flow cytometry to study nanoparticle interaction with immune cells. Primary immune cells can be easily purified from human or mouse tissues by antibody-mediated magnetic isolation. In the first instance, the different cell populations running in a flow cytometer can be distinguished by the forward-scattered light (FSC), which is proportional to cell size, and the side-scattered light (SSC), related to cell internal complexity. Furthermore, fluorescently labeled antibodies against specific cell surface receptors permit the identification of several subpopulations within the same sample. Often, all these features vary when cells are boosted by external stimuli that change their physiological and morphological state. Here, 50 nm FITC-SiO2 nanoparticles are used as a model to identify the internalization of nanostructured materials in human blood immune cells. The cell fluorescence and side-scattered light increase after incubation with nanoparticles allowed us to define time and concentration dependence of nanoparticle-cell interaction. Moreover, such protocol can be extended to investigate Rhodamine-SiO2 nanoparticle interaction with primary microglia, the central nervous system resident immune cells, isolated from mutant mice that specifically express the Green Fluorescent Protein (GFP) in the monocyte/macrophage lineage. Finally, flow cytometry data related to nanoparticle internalization into the cells have been confirmed by confocal microscopy.

Analysis of nanoparticle interaction with defined subpopulations of immune cells by flow cytometry.

フローサイトメトリーによる一次免疫細胞亜集団との蛍光ナノ粒子の相互作用を検出

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

免疫・感染学

A Simple Flow Cytometric Method to Measure Glucose Uptake and Glucose Transporter Expression for Monocyte Subpopulations in Whole Blood

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of monocytes induces effector functions and a concomitant shift from oxidative to glycolytic metabolism that is accompanied by increased glucose transporter expression. This increased glycolytic metabolism is also observed for trained immunity of monocytes, a form of innate immunological memory. Although in vitro protocols examining glucose transporter expression and glucose uptake by monocytes have been described, none have been examined by multi-parametric flow cytometry in whole blood. We describe a multi-parametric flow cytometric protocol for the measurement of fluorescent glucose analog 2-NBDG uptake in whole blood by total monocytes and the classical (CD14++CD16-), intermediate (CD14++CD16+) and non-classical (CD14+CD16++) monocyte subpopulations. This method can be used to examine glucose transporter expression and glucose uptake for total monocytes and monocyte subpopulations during homeostasis and inflammatory disease, and can be easily modified to examine glucose uptake for other leukocytes and leukocyte subpopulations within blood.

Monocytes are integral components of the human innate immune system that rely on glycolytic metabolism when activated. We describe a flow cytometry protocol to measure glucose transporter expression and glucose uptake by total monocytes and monocyte subpopulations in fresh whole blood.

シンプルなフローサイトメトリー法は、全血における単球亜集団のためのグルコース取り込みおよびグルコーストランスポーターの発現を測定するために

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of ...

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides the necessary methodology to add this assay to an exercise immunology arsenal. The first step in this assay is to prepare two aliquots ("H" and "F") of whole blood (heparin). Then, dihydroethidium is added to the H aliquot, and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Next, Staphylococcus aureus (S. aureus) is added to the H aliquot and fluorescein isothiocyanate-labeled S. aureus is added to the F aliquot (bacteria:phagocyte = 8:1), and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Then, trypan blue is added to each aliquot to quench extracellular fluorescence, and the cells are washed with phosphate-buffered saline. Next, the red blood cells are lysed, and the white blood cells are fixed. Finally, a flow cytometer and appropriate analysis software are used to measure granulocyte and monocyte phagocytosis and OB activity. This assay has been used for over 20 years. After heavy and prolonged exertion, athletes experience a significant but transient increase in phagocytosis and an extended decrease in OB activity. The post-exercise increase in phagocytosis is correlated with inflammation. In contrast to normal weight individuals, granulocyte and monocyte phagocytosis is chronically elevated in overweight and obese participants, and is modestly correlated with C-reactive protein. In summary, this flow cytometry-based assay measures the phagocytosis and OB activity of phagocytes and can be used as an additional measure of exercise- and obesity-induced inflammation.

The purpose of this manuscript is to present a method for measuring monocyte and granulocyte phagocytosis and oxidative burst activity in human blood samples.

ヒト血液中の測定顆粒球と単球食作用および酸化バースト活動

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and virus-infected or malignantly transformed cells due to a set of germline encoded inhibitory and activating receptors. Upon virus or tumor cell recognition a variety of different NK cell functions are initiated including cytotoxicity against the target cell as well as cytokine and chemokine production leading to the activation of other immune cells. It has been demonstrated that accurate NK cell functions are crucial for the treatment outcome of different virus infections and malignant diseases. Here a simple and reliable method is described to analyze different NK cell functions using a flow cytometry-based assay. NK cell functions can be evaluated not only for the whole NK cell population, but also for different NK cell subsets. This technique enables scientists to easily study NK cell functions in healthy donors or patients in order to reveal their impact on different malignancies and to further discover new therapeutic strategies.

A simple and reliable method is described here to analyze a set of NK cell functions such as degranulation, cytokine and chemokine production within different NK cell subsets.

NK細胞の機能を監視するためのサイトメトリーに基づくアッセイを流します

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer's and age-related macular degeneration, where amyloid-&#946; plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglial phagocytosis is critical for the maintenance of tissue homeostasis and inadequate phagocytic function has been implicated in pathology. However, assessing microglia function in vivo is technically challenging. We have developed a simple but robust technique for precisely monitoring and quantifying the phagocytic potential of microglia in a physiological setting.

網膜ミクログリアの貪食機能を評価します<em&gt;インビボ</em&gt;フローサイトメトリーベースのアッセイを使用しました

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Flow Cytometric Characterization of Murine B Cell Development

Extensive studies have characterized the development and differentiation of murine B cells in secondary lymphoid organs. Antibodies secreted by B cells have been isolated and developed into well-established therapeutics. Validation of murine B cell development, in the context of autoimmune prone mice, or in mice with modified immune systems, is a crucial component of developing or testing therapeutic agents in mice and is an appropriate use of flow cytometry. Well established B cell flow cytometric parameters can be used to evaluate B cell development in the murine peritoneum, bone marrow, and spleen, but a number of best practices must be adhered to. In addition, flow cytometric analysis of B cell compartments should also complement additional readouts of B cell development. Data generated using this technique can further our understanding of wild type, autoimmune prone mouse models as well as humanized mice that can be used to generate antibody or antibody-like molecules as therapeutics.

We describe herein a simple analysis of the heterogeneity of the murine immune B cell compartment in the peritoneum, spleen, and bone marrow tissues by flow cytometry. The protocol can be adapted and extended to other mouse tissues.

マウスB細胞の発達におけるフロー細胞量測定

Extensive studies have characterized the development and differentiation of murine B cells in secondary lymphoid organs. Antibodies secreted by B cells ...

Flow Cytometry Approach to Characterize Phagocytic Properties of Acutely-Isolated Adult Microglia and Brain Macrophages In Vitro

Microglia and central nervous system (CNS)-infiltrating macrophages, collectively called CNS mononuclear phagocytes (CNS-MPs), play central roles in neurological diseases including neurodegeneration and stroke. CNS-MPs are involved in phagocytic clearance of pathological proteins, debris and neuronal synapses, each with distinct underlying molecular pathways. Characterizing these phagocytic properties can provide a functional readout that compliments molecular profiling of microglia using traditional flow cytometry, transcriptomics and proteomics approaches. Phagocytic profiling of microglia has relied on microscopic visualization and in vitro cultures of mouse neonatal microglia. The former approach suffers from limited sampling while the latter approach is inherently poorly reflective of the true in vivo state of adult CNS-MPs. This paper describes optimized protocols to phenotype phagocytic properties of acutely-isolated mouse CNS-MPs by flow cytometry. CNS-MPs are acutely isolated from adult mouse brain using mechanical dissociation followed by density gradient centrifugation, incubated with fluorescent microspheres or fluorescent A&#946; fibrils, washed, and then labeled with panels of antibodies against surface markers (CD11b, CD45). Using this approach, it is possible to compare phagocytic properties of brain-resident microglia with CNS-infiltrating macrophages and then assess the effect of aging and disease pathology on these phagocytic phenotypes. This rapid method also holds potential to functionally phenotype acutely-isolated human CNS-MPs from post-mortem or surgical brain specimens. Additionally, specific mechanisms of phagocytosis by CNS-MP subsets can be investigated by inhibiting select phagocytic pathways.

Assessment of phagocytic properties of microglia and brain macrophages can provide a valuable functional dimension to molecular profiling studies. We describe a validated protocol that uses flow cytometry to rapidly and reliably quantify phagocytosis of fluorescent microspheres and amyloid beta fibrils by acutely-isolated microglia and brain macrophages from mouse models.

Microglia and central nervous system (CNS)-infiltrating macrophages, collectively called CNS mononuclear phagocytes (CNS-MPs), play central roles in ...

神経科学

A Flow Cytometry-based Assay to Identify Compounds That Disrupt Binding of Fluorescently-labeled CXC Chemokine Ligand 12 to CXC Chemokine Receptor 4

Pharmacological targeting of G protein-coupled receptors (GPCRs) is of great importance to human health, as dysfunctional GPCR-mediated signaling contributes to the progression of many diseases. The ligand/receptor pair CXC chemokine ligand 12 (CXCL12)/CXC chemokine receptor 4 (CXCR4) has raised significant clinical interest, for instance as a potential target for the treatment of cancer and inflammatory diseases. Small molecules as well as therapeutic antibodies that specifically target CXCR4 and inhibit the receptor&#39;s function are therefore considered to be valuable pharmacological tools. Here, a flow cytometry-based cellular assay that allows identification of compounds (e.g., small molecules) that abrogate CXCL12 binding to CXCR4, is described. Essentially, the assay relies on the competition for receptor binding between a fixed amount of fluorescently labeled CXCL12, the natural chemokine agonist for CXCR4, and unlabeled compounds. Hence, the undesirable use of radioactively labeled probes is avoided in this assay. In addition, living cells are used as the source of receptor (CXCR4) instead of cell membrane preparations. This allows easy adaptation of the assay to a plate format, which increases the throughput. This assay has been shown to be a valuable generic drug discovery assay to identify CXCR4-targeting compounds. The protocol can likely be adapted to other GPCRs, at least if fluorescently labeled ligands are available or can be generated. Prior knowledge concerning the intracellular signaling pathways that are induced upon activation of these GPCRs, is not required.

A flow cytometry-based cellular binding assay is described that is primarily used as a screening tool to identify compounds that inhibit the binding of a fluorescently labeled CXC chemokine ligand 12 (CXCL12) to the CXC chemokine receptor 4 (CXCR4).

蛍光標識した CXC ケモカイン Ligand 12 CXC ケモカイン受容体 4 を混乱させる化合物を識別するためにフロー フローサイトメトリーを用いた測定

Pharmacological targeting of G protein-coupled receptors (GPCRs) is of great importance to human health, as dysfunctional GPCR-mediated signaling ...

生物学

Analyzing Basophil Activation in the Presence of a Test Allergen using Flow Cytometry

Source: Do&#241;a, I. et al., <a href="https://app.jove.com/v/62600">Basophil Activation Test for Allergy Diagnosis.</a> J. Vis. Exp. (2021)
In this video, we demonstrate the test to evaluate basophil activation in the presence of a test allergen using flow cytometry.

フローサイトメトリーを用いた試験アレルゲン存在下での好塩基球活性化の解析

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Sample preparation

	Collect ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

免疫学

免疫診断

細胞免疫診断

Measuring Microglial Uptake of Intravitreally-Delivered Fluorescent Particles Using Flow Cytometry

Source: Murinello, S. et al., <a href="https://app.jove.com/v/54677">Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay.</a> J. Vis. Exp.&#160;(2016)
This video demonstrates flow cytometry for measuring microglial uptake of fluorescent bioparticles after intravitreal delivery in a mouse eye. Flow cytometry detects live cells expressing CD11b and distinguishes phagocytic microglia cells exhibiting green fluorescence from other myeloid cells, including Ly6C-expressing monocytes and Ly6G-expressing neutrophils.

フローサイトメトリーを用いた硝子体内送達蛍光粒子のミクログリア取り込みの測定

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...

顆粒球機能の変化を評価するために、イメージベースのフローサイトメトリー技術

要約

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この動画の章

フローサイトメトリーによる一次免疫細胞亜集団との蛍光ナノ粒子の相互作用を検出

シンプルなフローサイトメトリー法は、全血における単球亜集団のためのグルコース取り込みおよびグルコーストランスポーターの発現を測定するために

ヒト血液中の測定顆粒球と単球食作用および酸化バースト活動

NK細胞の機能を監視するためのサイトメトリーに基づくアッセイを流します

網膜ミクログリアの貪食機能を評価します

マウスB細胞の発達におけるフロー細胞量測定

Flow Cytometry Approach to Characterize Phagocytic Properties of Acutely-Isolated Adult Microglia and Brain Macrophages In Vitro

蛍光標識した CXC ケモカイン Ligand 12 CXC ケモカイン受容体 4 を混乱させる化合物を識別するためにフローフローサイトメトリーを用いた測定

フローサイトメトリーを用いた試験アレルゲン存在下での好塩基球活性化の解析

フローサイトメトリーを用いた硝子体内送達蛍光粒子のミクログリア取り込みの測定

顆粒球機能の変化を評価するために、イメージベースのフローサイトメトリー技術

要約

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フローサイトメトリーによる一次免疫細胞亜集団との蛍光ナノ粒子の相互作用を検出

シンプルなフローサイトメトリー法は、全血における単球亜集団のためのグルコース取り込みおよびグルコーストランスポーターの発現を測定するために

ヒト血液中の測定顆粒球と単球食作用および酸化バースト活動

NK細胞の機能を監視するためのサイトメトリーに基づくアッセイを流します

網膜ミクログリアの貪食機能を評価します

マウスB細胞の発達におけるフロー細胞量測定

Flow Cytometry Approach to Characterize Phagocytic Properties of Acutely-Isolated Adult Microglia and Brain Macrophages In Vitro

蛍光標識した CXC ケモカイン Ligand 12 CXC ケモカイン受容体 4 を混乱させる化合物を識別するためにフロー フローサイトメトリーを用いた測定

フローサイトメトリーを用いた試験アレルゲン存在下での好塩基球活性化の解析

フローサイトメトリーを用いた硝子体内送達蛍光粒子のミクログリア取り込みの測定

蛍光標識した CXC ケモカイン Ligand 12 CXC ケモカイン受容体 4 を混乱させる化合物を識別するためにフローフローサイトメトリーを用いた測定