The authors are grateful for the support from the Center for Predicative Medicine Animal Models (Carol Vanover, Ashley Biller and Jennifer Kraenzle) and Microbiology (Daniel Cramer and Julie Sotsky) Core Facilities. This work was supported by funding from the NIH (HHSN272201000033I to M.B.L and J.M.W.).

注：ここで説明する手順のすべてが見直され、大学、ルイビルの制度バイオセーフティ委員会（プロトコル＃13から056）と、施設内動物管理使用委員会（プロトコル＃13から064）によって承認された。 染料の調製<ol><li> 0.45μMのシリンジフィルターを用いて滅菌PBSクマシーブリリアントブルー及びフィルタ（w / v）の0.1％に希釈する。 </li></ol> 緑膿菌文化の調製<ol><li> 15時間点滴の前に、単一の細菌コロニーをブロス培養の3ミリリットルを接種する。 </li><li>シェーカー（200 rpm）の上で37℃で培養する15時間を育てる。 </li><li>遠心分離機30秒1.5mlマイクロチューブ12000×gの中の文化の1ミリリットル。 </li><li>培地を除去し、PBS 1ml中ペレットを再懸濁。 </li><li> PBS中の細菌ストック懸濁液1:10アリコートを希釈し、決定するために、希釈した細菌懸濁液のOD 600を測定する細菌濃度。 </li><li> IMIT接種のために50μlの配信ボリュームを使用して、細菌接種の所望の濃度にPBS中の細菌ストック懸濁液を希釈する。 </li></ol> 3. IMIT点眼<ol><li>イソフルラン麻酔導入チャンバーにマウスの群を配置し、2を用いた麻酔 - 3％イソフルラン/酸素混合物を。 </li><li>鎮静の初期開始時に、直立マウスを保持し、マウスを首筋、そして喉の奥まで強制経口投与針によって2％リドカイン溶液10μlを投与し、その溶液がダウン喉頭蓋へ排出させる。麻酔室にマウスを返します。 <ol><li>局所麻酔薬としての完全な効果を取るためにリドカインを可能にするために、5分間の最小値を許可します。 </li></ol></li><li>マウスは鎮静の所望のレベル（〜60 BPMの呼吸数）を達成したら、鎮静を維持するために、2％イソフルランを減らす。 </li><li> 250μlの気密に染料または細菌接種をプリロード22 Gの長い鈍針付き精密シリンジフィット。 <ol><li>第1のシリンジのテフロンプランジャによって測定された空気を150μlを、策定。次に、注射器本体に200μlのマークに150μlのマークからテフロンプランジャーを前進させることによって、接種物50μlのを策定。 注：サンプルは挿管マウスに排出されると、50μlの懸濁液は、肺全体に接種物を配布します150μlのエアクッションが続き、最初に配信されます。 </li></ol></li><li>誘導室から一匹のマウスを取り外し、挿管プラットフォーム上で仰臥横たわっていた。マジックテープに付着したOリングとの切歯をフックし、プラットフォームにベルクロを固定することによって、プラットフォームにマウスを固定します。 45°傾斜にマウスを持ち上げます。 </li><li>マイクロ綿棒を使用して、利き手を使用して、ローリング運動と舌を引っ込める。 </li><li>非優位手で両方のMAへ挿管検鏡で動作耳鏡フィットを使用舌後退intainと声門を視覚化。 </li><li>利き手で、マウスの気管（カテーテルが露出し、カテーテルの10ミリメートルのシリコンスリーブ付きフィット）に10ミリメートルの深さまでカテーテル、シーティングマウスを挿管する20のGカテーテルに通し、ガイドワイヤーを使用しています。耳鏡/検鏡を削除します。 </li><li>マウスが正しく簡単に着色された染料を含む1/16「クリアチューブのルアー接続長さを装着しながら、非優位手でカテーテルを固定することにより、挿管されたことを確認します。 NOTE：染料が急速に呼吸に応じて前後に移動する。 </li><li>挿管の確認はこの時点で確立されていない場合、その後のステップに進まないでください。挿管が失敗した実行し​​ようとした場合、挿管一つの追加の試みのためのカテーテル、ガイドワイヤをリセットします。 注：マウスの​​外傷を引き起こすことなく、1つのセッションでのマウス二つ以上の挿管を試みるunadvisableある。 </li><li>に進みます液体懸濁液/エアクッションを含む精密シリンジ/ブラント針を挿入しながら、非優位手でカテーテルを固定します。 </li><li>単一の流体運動で直接肺への液体/空気を分配し、すぐにマウスから針/カテーテルを取り除く。 </li><li>ケージにマウスを返し、麻酔からの回復を可能にする。 </li></ol> IMT配信の4キャラクタリゼーション<ol><li> IMIT点滴注入した後、適切な時間、接種後のCO 2窒息によりマウスを安楽死させる。 </li><li>解剖ボードに安楽死させたマウスを保護し、噴出ボトルを使用し、70％EtOHで胸と腹部を浸す。 </li><li>肺全体の造影剤の分布を評価する場合は、無菌技術を用いて動物から肺を除去し、画像化に適するように肺を表示する。 注：肺は、適切な固定または凍結保存を通じて追加的な組織学的染色技術のために調製することができる&lt;。/ LI&gt; <li>感染した肺組織の細菌負荷を評価する場合は、無菌技術を用いた動物から肺を取り出します。無菌に肺を置き、1オンスサンプルバッグを予め秤量。計量し、サンプルバッグ+肺の重量を記録します。 <ol><li>各サンプルバッグ+組織への滅菌1×PBSの1ミリリットルを追加します。サンプルバッグを再シール。 </li><li>サンプルバッグ+組織上の25ミリリットルの血清学的ピペットを圧延することにより穏やかな組織を均質化する。 </li><li>シリアル寒天プレート上の滅菌PBSおよびプレート内の肺ホモジネートの希釈液（LB、または検討されて細菌種への適切な）を生成します： <ol><li>その後、寒天プレート上でマルチチャンネルによる三連のサンプルをプレートマルチチャンネルピペッターによるU底96ウェルプレート中で6倍連続希釈を行っています。 </li></ol></li><li> 37℃にて一晩寒天プレートをインキュベートし、翌日のコロニー形成単位を列挙。 </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Reznik, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+anatomy,+physiology,+and+function+of+the+upper+respiratory+tract.">Comparative anatomy, physiology, and function of the upper respiratory tract.</a> Environ Health Perspect. 85, 171-176 (1990).</li><li>Hoyt, R. F. J., Hawkins, J. V., St. Clair, M. B., Kennet, M. B., Fox, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+2.">Chapter 2.</a> The Mouse in Biomedical Research, Volume 2, Second Edition: Diseases (American College of Laboratory Animal Medicine). 2, 23-90 (2007).</li><li>Visweswaraiah, A., Novotny, L. A., Hjemdahl-Monsen, E. J., Bakaletz, L. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+Klebsiella+pneumoniae+comparative+genetic+analyses+with+virulence+profiles+in+a+murine+respiratory+disease+model.">Correlation of Klebsiella pneumoniae comparative genetic analyses with virulence profiles in a murine respiratory disease model.</a> PLoS ONE. In revision, (2014).</li><li>Soto-Montenegro, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+airway+distribution+of+transnasal+solutions+in+mice+by+PET/CT+imaging.">Assessment of airway distribution of transnasal solutions in mice by PET/CT imaging.</a> Mol Imaging Biol. 11, 263-268 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

IMIT点滴を再現肺に直接試薬を植え付ける能力の既存の呼吸器疾患モデルに主な改善を提供しています。それはIMIT技法を行い、誰が麻酔およびケージングの物流を管理しそのうちの一つ、理想的には2人の研究者のチームのために位置している急速なアプローチであり、もう。マウス当たり3分 - 大規模研究では2の平均時間のコミットメントとIMITを使用して行うことができる。アプローチは、麻酔薬としてのイソフルランを使用するので、マウスが回復を通して動物を監視する畜産時間を短縮すること、麻酔から急速に回復する。 IMIT方法の中で最も技術的に困難な側面は、マウスを挿管の初期段階である。 IMITを実行することを学ぶ個人はカテーテル留置のこの第一段階に集中することであり、挿管が染料移動の視覚的確認によって達成されたことを保証する。アプローチの利点は、肺スペックですIFIC点滴注入は、新しい研究者の双方の信頼だけでなく、困難な動物を挿管しようとする専門家を増加挿管の確認、の使用によって保証されています。成功した挿管の可能性を最適化する重要な要素は次のとおりです。深い鎮静を達成i）は、ⅱ）口の中で検鏡の正しい配置は第III）は、良好な深さの配置、喉頭蓋の良い可視化を可能にするのに十分な作業時間を可能にするために検鏡舌は手順全体を通して後退したまま、そして手順はリラックスして安定したアプローチを用いて実施されるように、ⅳ）傾斜プラットフォームの使用が研究者の手を支援するようにします。 IMIT手順の制限の一つは、IMIT点滴注入事象の頻度に関連している。逃した挿管に関連する潜在的な外傷が原因で、それは以上の2挿管の試みが（最大2ミスまで）単一のセッションで行われることが推奨されていません。 IMITマウス肺に治療薬を送達するために使用させる能力に優れた潜在能力を有するが、肺への試薬の非常に頻繁な送達を利用する治療法はIMITには適していない。これは、挿管に伴う外傷の大部分が失わ挿管イベントに関連すると考えられているように、IMITが有意な外傷を引き起こすことなく、マウスの肺内に試薬を送達するために日常的に使用され得ることが、高度に熟練した研究者が行った場合にのみ可能である。このような高周波IMITは、地元の獣医師や動物実験委員会で議論されるべきである。 IMITのさらなる潜在的な制限は挿管されているマウスのサイズです。 20 Gカテーテルは、このサイズ範囲内のマウスの気管に適したサイズであることが見出された22gの、 - 上述のIMIT手順は、約17匹のマウスを使用して開発された。大きなカテーテルが正常老齢マウスで使用されてきた。 IMIT mの初期開発&gt; 20グラムであるBALB / cマウスにおける18 GカテーテルのADEの使用。代替のカテーテルサイズが使用される場合、重要なことに、鈍い針はカテーテルの内腔に適合し、カテーテル先端を越えてちょうど1ミリメートルを拡張長さにトリミングされた供給されるべきである。 17グラム未満のマウスの挿管が可能かもしれないが、必要な専門知識のために推奨されていません、と小さくカテーテルおよび上記に記載されているよりも検鏡の使用を必要とするであろう。 我々は、P。に加えて、いくつかの呼吸器病原体の送達にIMITを使用してきたB.含む緑膿菌 、 疽菌 9および肺炎桿菌 10。 IMITモデルは、Bの我々の研究にとって重要な進歩を遂げています疽菌呼吸器疾患は、鼻腔内接種ではなく、ヒトの疾患9で観察された全身性疾患のエンドポイントよりもマウスの初期の、URT関連の病的状態を引き起こすことを識別した。B.疽菌は、ティア1セレクです生体防御衝撃tの薬剤、ならびに、呼吸器疾患モデルは、エアロゾル曝露のために開発されているように、そのモデル兵器病原体のエントリが潜在的生体防御関連経路。現在のエアロゾルのモデルは、我々はBの鼻腔モデルに特定した同電位の早期罹患表現型、URTおよびLRTの両方の感染につながるため、 疽菌呼吸器疾患は、エアロゾルモデルに適用される場合があります。 IMITモデルの将来の適応はマウスのみ肺へのターゲットエアロゾル送達のために挿管されている挿管媒介エアロゾル送達（IMAD）、である可能性があります。人工呼吸器は、エアロゾル化し、液体ベースではなく、病原体チャレンジを送達するように適合することができたイソフルラン麻酔を維持するために現在利用可能である。 IMITは、肺への細菌の送達を最適化するためのアプローチとして最初に開発されたが、また、マウスの肺への他の試薬を送達するための用途を有した。 DISとして上記cussed、低効率でマウスの結果への化合物の鼻腔内送達、肺の標的臓器への試薬の非常に可変配達。我々はIMITが&gt; 98％配信の有効性および多葉分布に近づく他の肺送達に対する優れた代替手段を提供することが実証されているのに対し、マウス肺へのポジトロン放出断層撮影（PET）画像化試薬の鼻腔内送達は、40％の送達効率11が得られた。肺への標的送達のこの改善は、肺疾患の治療のための治療的送達の再現性を高める可能性がある。 ⅰ）環境肺刺激物の影響は、ⅱ）肺がん表現型の研究は、ⅲ）肺特異的siRNAがノックダウン：IMITは、同様の研究をに利益を提供することができます。

マウスは、呼吸器疾患の無数を含む多数のヒトの疾患の症状をモデル化するために使用されている。サロゲート疾患モデルは、一般的に、多くの場合、重要な生理学的または2つのホストモデルでの免疫の違いによるモデル化された疾患のすべての側面を再現することはできません。このように、モデルシステムの改善の目的は、元のホストシステムで観察されるような代用物は、より密接に、疾患プロセス又は宿主応答をミラーリングを可能にするアプローチを開発することである。彼らは空気を鼓舞するためのメカニズムでマウスとヒトの間でいくつかの重要な生理的な違いがあります。 URTとLRTの間のサイズの大幅なレシオメトリックな違いは、これらの違いに含まれる。それは、マウスは&gt; 100総肺容量1,2に対して正規のヒトへURT表面積を相対的に、折る有することが推定されている。このように、マウスの鼻甲介はbreathiのはるかに大きな割合を容易にするためのインスピレーションの空気のより広範なフィルタリングを可能に鼻腔の感染が疾患の進行に重要な役割を果たしている場合ngが、肺炎の研究に大きな影響を有していてもよい。 いくつかの異なるアプローチが人間のような呼吸器疾患を研究するためにマウスの肺に細菌を植え付けるために使用されてきた。これらのアプローチの最も一般的なものは、液体懸濁液をマウスの一方または両方の鼻孔に適用される鼻腔内接種である。比較的単純ながら、そのような鼻腔内接種3-5を経由して、LRTに点滴の効率に影響を与える可能性が使用される全身麻酔の点眼量や種類などの注意点。具体的にはMiller ら 50未満μlをLRT 6内に細菌の点滴には至らなかったボリュームで野兎病菌の鼻腔内点滴注入を示している。吸入イソフルランを使用する際に麻酔用注射さケタミン/キシラジンとは対照的に、彼らは、さらに優れたLRTの点滴を観察した。しかし、私たちの経験豊富ペスト菌の鼻腔内接種された電子は、イソフルラン（MBL、未発表データ）と比較して、より一貫した接種はケタミン/キシラジンを用いて達成することができることを示します。これらの違いは、使用される病原体や実験手順のばらつきに起因しますが、重要なのは、この技術の潜在的な変動性を強調することができた。さらに、初期の細菌接種の比較的低い割合が肺に達したことを鼻腔内点滴注入のショーの後まもなく収穫肺の細菌が多数いることを示唆している、（ ペスト菌の場合は、わずか10％が点眼7の1時間後に回収した） URTに保持（または胃腸管に飲み込ま）することができた。生物は、ヒト疾患と矛盾した方法でマウスの鼻腔コロニー形成することができる場合、特定の疾患モデルでは、URT粘膜上の細菌のこの重要な堆積は、疾患進行の理解を混乱させることができる。例えば、 生体内で使用して&lt;/全角&gt;をイメージングは、それが鼻腔内点滴注入法8により送達された場合に、人間のURTにコロニーを形成しない疽菌は 、マウスの鼻腔の圧倒的な日和見感染を引き起こすことが観察されている。 マウスの肺に細菌を浸透させるための他の方法はまた、感染症の研究に用いられてきた。経口的[消化管とLRT];しかし、鼻腔内点滴注入に比べ、これらの方法は、複数の部位（ 例えば 、エアゾール[URTおよびLRT]で感染開始の可能性を排除することなく、より多くの技術的な専門知識および/ ​​または高価な装置を必要とする傾向があり、外科的気管内[LRTと血流]）。感染のセカンダリサイトに関連付けることができた潜在的な合併症を考えると、我々はURTをバイパスし、直接麻酔したマウスの肺に病原体を提供し、気管内アプローチを開発しようとしただけでなく、不注意inoculatを制限血流または胃腸管へイオンを打ち込む。この終わりに向かって、挿管媒介気管内（IMIT）点滴前点滴に適切なカテーテル留置を確認するために中間ステップを含めることによって、接種材料のLRT点滴を保証非外科的手順として開発されました。この方法は、視覚的に、肺全体に接種物の広い分布を実証し、P.、染料点滴を用いて説明する肺へのこの方法の非常に有効配信を実証する緑膿菌点滴（接種材料の&gt; 98％）。他の呼吸器疾患モデルの研究のための様々な分子のⅰ）点滴、ⅱ）肺特異的治療的送達、およびターゲットを含むⅲ）基本的な肺機能の研究、：もともと細菌送達のために開発しながら、重要なこと、IMITものための効果的なツールを提供しています肺へのsiRNA送達。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1035">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:160px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:447px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Rodent, Tilting WorkStand</td>
			<td style="width:160px;">Hallowell EMC</td>
			<td style="width:119px;">000A3467</td>
			<td>Base should be detached when working in a BSC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Operating Otoscope Head</td>
			<td style="width:160px;">Welch Allyn</td>
			<td style="width:119px;">21700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Otoscope 3.5 V Li Battery</td>
			<td style="width:160px;">Welch Allyn</td>
			<td style="width:119px;">71900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:311px;">Mouse Intubation Specula short, Autoclaveable</td>
			<td style="width:160px;">Hallowell EMC</td>
			<td style="width:119px;">200A3589S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Incisor Loops</td>
			<td style="width:160px;">Hallowell EMC</td>
			<td style="width:119px;">210A3490A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Cotton fine tip applicator</td>
			<td style="width:160px;">Puritan</td>
			<td style="width:119px;">871-PC DBL&#160;</td>
			<td>Used for tongue retraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">I.V. Catheter, 20G</td>
			<td style="width:160px;">Exel Int</td>
			<td style="width:119px;">26741</td>
			<td>Optional: fit a silicon sleeve with 10mm exposed catheter surface</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Gas tight syringe, 250ul</td>
			<td style="width:160px;">Hamilton</td>
			<td style="width:119px;">81120</td>
			<td>Used for delivery of liquid inoculum by IMIT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Blunt Needle, 22G</td>
			<td style="width:160px;">Hamilton</td>
			<td style="width:119px;">91022</td>
			<td>Trim to length to protrude 1mm from 20G catheter</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Guide wire (Fiber optic wire, 0.5mm)</td>
			<td style="width:160px;">TheFiberOpticStore.com</td>
			<td style="width:119px;">FOF .50</td>
			<td>Cut to 6&#34; length: used as guide wire for intubation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Tuberculin syringe, 1ml</td>
			<td style="width:160px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">309659</td>
			<td>Assemble with fiber optic wire as guide wire</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Brilliant Blue R (Coomassie)</td>
			<td style="width:160px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">B0149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Tygon tubing, 1/16&#34;</td>
			<td style="width:160px;">Saint Gobain</td>
			<td style="width:119px;">ALC00002&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Male luer 1/16&#34; barb</td>
			<td style="width:160px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">45503-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Female luer 1/16&#34; barb</td>
			<td style="width:160px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">45500-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Lidocaine, USP</td>
			<td style="width:160px;">Spectrum</td>
			<td style="width:119px;">LI102</td>
			<td>pH lidocaine into solution at 2%(w/v) pH7.0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Sample bag, 1oz</td>
			<td style="width:160px;">Whirl-Pak</td>
			<td style="width:119px;">B01067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">U-bottom 96 well plate, sterile</td>
			<td style="width:160px;">Greiner</td>
			<td style="width:119px;">650161</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intubation-mediated intratracheal (imit) instillation: a noninvasive, lung-specific delivery system

呼吸器疾患の研究は、典型的には、サロゲートシステムなどのマウスモデルの使用を含む。しかし、マウスおよびヒトの呼吸器系との間に有意な生理学的な相違は、特にその上部気道（URT）である。鼻腔内点滴注入法を使用する場合にいくつかのモデルでは、マウスの鼻腔内でこれらの差異は、潜在的にこれらの疾患を研究するためにマウスモデルの有用性を制限し、下気道（LRT）の疾患進行とプレゼンテーションに大きな影響を持つことができる。これらの理由から、URTの関与が存在しない場合にLRT疾患を研究するためにマウスの肺に直接細菌を植え付けるための技術を開発することが有利であろう。我々は、この肺特異的送達技術挿管媒介気管内（IMIT）点滴と呼ばれている。この非侵襲的手法は、より侵襲traditi中に発生する可能性が血流の中に点滴注入の可能性を最小限に抑える角項外科気管内感染のアプローチ、および付随的消化管の配信の可能性を制限します。 IMIT最初に肺に細菌の直接送達を媒介するためにカテーテルに鈍針を挿入した気管内に適切なカテーテル配置を確保するために中間段階で、挿管されたマウスでは、二段階プロセスである。このアプローチは、肺全体に試薬の優れた分布と、肺に配達の&gt; 98％の有効性を容易にします。したがって、IMITは、人間の呼吸器疾患を研究するためのサロゲートとしてマウスを使用する能力に改善し、肺に直接LRT疾患や治療的送達を研究するための新規なアプローチを表しています。さらに、この送達システムの精度および再現性は、また、安全性試験実施基準（GLPS）の影響を受けやすいだけでなく、肺への高効率送達を必要とする試薬の広い範囲の配達になる。

IMIT法による点滴注入材料の分布を可視化するために、0.1％クマシーブリリアントブルー染料50μlを、麻酔したマウスの肺に注入した。マウスを直ちに安楽死させ、肺を無菌剖検により除去した。 図1は、色素が肺のすべて葉に送達されたことを示している。 IMIT方法を介して肺に送達する細菌の量を、マウスの3つのグループ（n = 3）のP.三つの異なる濃度で注入したかを決定するために緑膿菌 （1.21×10 8、1.21x10 7、および1.21×10 6コロニー形成単位[CFU]を50μlあたり）。直ちにIMIT点滴注入後、マウスは、肺を除去し、安楽死させ、細菌数は、接種材料（ 図2）に列挙して比較した。接種物の送達は、点滴の肺から回収された接種物の&gt; 98％が、このメソッドを介して非常に効率的である動物。さらに、IMIT点滴にかかわらず、接種物（R 2 = 0.9951）の濃度の非常に再現性があった。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52261/52261fig1highres.jpg" /> 図1：IMIT点滴注入は、肺全体に接種物を配布し 、すべての葉に分布して0.1％のクマシーブリリアントブルーショー青色色素50μlの点滴注入したマウスからの肺。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52261/52261fig2highres.jpg" /> 図2：肺マウスへの細菌のIMIT点滴注入は Pで注入した。 緑膿菌や肺に注入する細菌の数は（10 CFUをログ-回復）の推定接種材料と比較した（10 CFUをログ-配信）。各円は個々のマウス（のCFU /肺それぞれについてはn = 3を表す。細菌の用量）。

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Intubation-mediated Intratracheal IMIT Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

試薬の挿管媒介気管内（IMIT）点滴は、呼吸器疾患を研究するための優れた、非侵襲的な方法だけでな​​く、肺に直接治療薬を浸透させるための方法である。これは前臨床試験のために適して迅速かつ高度に再現可能な方法である。

挿管媒介気管内（IMIT）点眼：非侵襲的、肺特異的送達システム

Respiratory disease studies typically involve the use of murine models as surrogate systems. However, there are significant physiologic differences ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

Intubation-mediated Intratracheal (IMIT) Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

24.0K ビュー.  University of Louisville Medical School. 試薬の挿管媒介気管内（IMIT）点滴は、呼吸器疾患を研究するための優れた、非侵襲的な方法だけでな​​く、肺に直接治療薬を浸透させるための方法である。これは前臨床試験のために適して迅速かつ高度に再現可能な方法である。 

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A Novel Surgical Approach for Intratracheal Administration of Bioactive Agents in a Fetal Mouse Model

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and acquired diseases. Apart from congenital or inherited abnormalities with the requirement for long-term expression of the delivered gene, several non-inherited perinatal conditions, where short-term gene expression or pharmacological intervention is sufficient to achieve therapeutic effects, are considered as potential future indications for this kind of approach. Candidate diseases for the application of short-term prenatal therapy could be the transient neonatal deficiency of surfactant protein B causing neonatal respiratory distress syndrome1,2 or hyperoxic injuries of the neonatal lung3. Candidate diseases for permanent therapeutic correction are Cystic Fibrosis (CF)4, genetic variants of surfactant deficiencies5 and &alpha;1-antitrypsin deficiency6.
Generally, an important advantage of prenatal gene therapy is the ability to start therapeutic intervention early in development, at or even prior to clinical manifestations in the patient, thus preventing irreparable damage to the individual. In addition, fetal organs have an increased cell proliferation rate as compared to adult organs, which could allow a more efficient gene or stem cell transfer into the fetus. Furthermore, in utero gene delivery is performed when the individual's immune system is not completely mature. Therefore, transplantation of heterologous cells or supplementation of a non-functional or absent protein with a correct version should not cause immune sensitization to the cell, vector or transgene product, which has recently been proven to be the case with both cellular and genetic therapies7.
In the present study, we investigated the potential to directly target the fetal trachea in a mouse model. This procedure is in use in larger animal models such as rabbits and sheep8, and even in a clinical setting9, but has to date not been performed before in a mouse model. When studying the potential of fetal gene therapy for genetic diseases such as CF, the mouse model is very useful as a first proof-of-concept because of the wide availability of different transgenic mouse strains, the well documented embryogenesis and fetal development, less stringent ethical regulations, short gestation and the large litter size.
Different access routes have been described to target the fetal rodent lung, including intra-amniotic injection10-12, (ultrasound-guided) intrapulmonary injection13,14 and intravenous administration into the yolk sac vessels15,16 or umbilical vein17. Our novel surgical procedure enables researchers to inject the agent of choice directly into the fetal mouse trachea which allows for a more efficient delivery to the airways than existing techniques18.

We developed a novel surgical approach for intratracheal administration of bioactive agents into the mouse fetus. The delivery route is more efficient in targeting the fetal mouse lungs than the commonly used intra-amniotic injection. This procedure has to date not been described in a mouse model.

胎児のマウスモデルにおける生物活性剤の気管内投与のための新しい手術アプローチ

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and ...

医学

Intraoperative Detection of Subtle Endometriosis: A Novel Paradigm for Detection and Treatment of Pelvic Pain Associated with the Loss of Peritoneal Integrity

Endometriosis is a common disease affecting 40 to 70% of reproductive-aged women with chronic pelvic pain (CPP) and/or infertility. The purpose of this study was to demonstrate the use of a blue dye (methylene blue) to stain peritoneal surfaces during laparoscopy (L/S) to detect the loss of peritoneal integrity in patients with pelvic pain and suspected endometriosis. Forty women with CPP and 5 women without pain were evaluated in this pilot study. During L/S, concentrated dye was sprayed onto peritoneal surfaces, then aspirated and rinsed with Lactated Ringers solution. Areas of localized dye uptake were evaluated for the presence of visible endometriotic lesions. Areas of intense peritoneal staining were resected and some fixed in 2.5% buffered gluteraldehyde and examined by scanning (SEM) electron microscopy. Blue dye uptake was more common in women with endometriosis and chronic pelvic pain than controls (85% vs. 40%). Resection of the blue stained areas revealed endometriosis by SEM and loss of peritoneal cell-cell contact compared to normal, non-staining peritoneum. Affected peritoneum was associated with visible endometriotic implants in most but not all patients. Subjective pain relief was reported in 80% of subjects. Based on scanning electron microscopy, we conclude that endometrial cells extend well beyond visible implants of endometriosis and appear to disrupt the underlying mesothelium. Subtle lesions of endometriosis could therefore cause pelvic pain by disruption of peritoneal integrity, allowing menstrual or ovulatory blood and associated pain factors access to underlying sensory nerves. Complete resection of affected peritoneum may provide a better long-term treatment for endometriosis and CPP. This simple technique appears to improve detection of subtle or near invisible endometriosis in women with CPP and minimal visual findings at L/S and may serve to elevate diagnostic accuracy for endometriosis at laparoscopy.

Loss of peritoneal integrity provides a new paradigm to understand and treat chronic pelvic pain in women with mild forms of endometriosis and can be easily detected using intraoperative instillation of dye at the time of laparoscopy.

微妙な子宮内膜症の術中検出：腹膜整合性の喪失に伴う骨盤痛の検出および治療のための新たなパラダイム

Endometriosis is a  common disease affecting 40 to 70% of reproductive-aged women with chronic  pelvic pain (CPP) and/or infertility. The purpose of this ...

Noninvasive Intratracheal Intubation to Study the Pathology and Physiology of Mouse Lung

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular disease and for developing therapeutic intervention. With the increasing availability of knockout and transgenic derivatives, together with a vast amount of genetic information, mice provide one of the best models to study the molecular mechanisms underlying the pathology and physiology of lung diseases. Inhalation, intranasal instillation, intratracheal instillation, and intratracheal intubation are the most widely used techniques by a number of investigators to administer materials of interest to mouse lungs. There are pros and cons for each technique depending on the goals of a study. Here a noninvasive intratracheal intubation method that can directly deliver exogenous materials to mouse lungs is presented. This technique was applied to administer bleomycin to mouse lungs as a model to study pulmonary fibrosis.

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular disease and for developing therapeutic intervention. Here a noninvasive intratracheal intubation method that can directly deliver exogenous materials to mouse lungs is presented.

マウス肺の病理生理学を研究するための非侵襲的気管内挿管

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular ...

Implantation of Fibrin Gel on Mouse Lung to Study Lung-specific Angiogenesis

Recent significant advances in stem cell research and bioengineering techniques have made great progress in utilizing biomaterials to regenerate and repair damage in simple tissues in the orthopedic and periodontal fields. However, attempts to regenerate the structures and functions of more complex three-dimensional (3D) organs such as lungs have not been very successful because the biological processes of organ regeneration have not been well explored. It is becoming clear that angiogenesis, the formation of new blood vessels, plays key roles in organ regeneration. Newly formed vasculatures not only deliver oxygen, nutrients and various cell components that are required for organ regeneration but also provide instructive signals to the regenerating local tissues. Therefore, to successfully regenerate lungs in an adult, it is necessary to recapitulate the lung-specific microenvironments in which angiogenesis drives regeneration of local lung tissues. Although conventional in vivo angiogenesis assays, such as subcutaneous implantation of extracellular matrix (ECM)-rich hydrogels (e.g., fibrin or collagen gels or Matrigel - ECM protein mixture secreted by Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma cells), are extensively utilized to explore the general mechanisms of angiogenesis, lung-specific angiogenesis has not been well characterized because methods for orthotopic implantation of biomaterials in the lung have not been well established. The goal of this protocol is to introduce a unique method to implant fibrin gel on the lung surface of living adult mouse, allowing for the successful recapitulation of host lung-derived angiogenesis inside the gel. This approach enables researchers to explore the mechanisms by which the lung-specific microenvironment controls angiogenesis and alveolar regeneration in both normal and pathological conditions. Since implanted biomaterials release and supply physical and chemical signals to adjacent lung tissues, implantation of these biomaterials on diseased lung can potentially normalize the adjacent diseased tissues, enabling researchers to develop new therapeutic approaches for various types of lung diseases.

Recapitulation of the organ-specific microenvironment, which stimulates local angiogenesis, is indispensable for successful regeneration of damaged tissues. This report demonstrates a novel method to implant fibrin gels on the lung surface of living mouse in order to explore how the lung-specific microenvironment modulates angiogenesis and alveolar regeneration in adult mouse.

肺特異的血管形成を研究するためにマウスの肺にフィブリンゲルの移植

Recent significant advances in stem cell research and bioengineering techniques have made great progress in utilizing biomaterials to regenerate and ...

Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research

The ability to instill live agents, cells, or chemicals directly into the lung without injuring or killing the mice is an important tool in lung cancer research. Although there are a number of methods that have been published showing how to intubate mice for pulmonary function measurements, none are without potential problems for rapid tracheal instillation in large cohorts of mice. In the present paper, a simple and quick method is described that enables an investigator to carry out such instillations in an efficient manner. The method does not require any special tools or lighting and can be learned with very little practice. It involves anesthetizing a mouse, making a small incision in the neck to visualize the trachea, and then inserting an intravenous catheter directly. The small incision is quickly closed with tissue adhesive, and the mice are allowed to recover. A skilled student or technician can do instillations at an average rate of 2 min/mouse. Once the cancer is established, there is frequently a need for quantitative histologic analysis of the lungs. Traditionally pathologists usually do not bother to standardize lung inflation during fixation, and analyses are often based on a scoring system that can be quite subjective. While this may sometime be sufficiently adequate for gross estimates of the size of a lung tumor, any proper stereological quantification of lung structure or cells requires a reproducible fixation procedure and subsequent lung volume measurement. Here we describe simple reliable procedures for both fixing the lungs under pressure and then accurately measuring the fixed lung volume. The only requirement is a laboratory balance that is accurate over a range of 1 mg&#8211;300 g. The procedures presented here thus could greatly improve the ability to create, treat, and analyze lung cancers in mice.

The goal of this paper is to describe simple methods that will greatly aid in the setup and analysis of mouse lungs with lung cancer or other pathologies. We present 3 protocols to simply and reliably carry out lung instillations, fixation, and lung volume measurements.

マウス肺癌研究における有用な点滴や固定方法

The ability to instill live agents, cells, or chemicals directly into the lung without injuring or killing the mice is an important tool in lung cancer ...

A Multimodal Imaging- and Stimulation-based Method of Evaluating Connectivity-related Brain Excitability in Patients with Epilepsy

Resting-state functional connectivity MRI (rs-fcMRI) is a technique that identifies connectivity between different brain regions based on correlations over time in the blood-oxygenation level dependent signal. rs-fcMRI has been applied extensively to identify abnormalities in brain connectivity in different neurologic and psychiatric diseases. However, the relationship among rs-fcMRI connectivity abnormalities, brain electrophysiology and disease state is unknown, in part because the causal significance of alterations in functional connectivity in disease pathophysiology has not been established. Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) is a technique that uses electromagnetic induction to noninvasively produce focal changes in cortical activity. When combined with electroencephalography (EEG), TMS can be used to assess the brain's response to external perturbations. Here we provide a protocol for combining rs-fcMRI, TMS and EEG to assess the physiologic significance of alterations in functional connectivity in patients with neuropsychiatric disease. We provide representative results from a previously published study in which rs-fcMRI was used to identify regions with abnormal connectivity in patients with epilepsy due to a malformation of cortical development, periventricular nodular heterotopia (PNH). Stimulation in patients with epilepsy resulted in abnormal TMS-evoked EEG activity relative to stimulation of the same sites in matched healthy control patients, with an abnormal increase in the late component of the TMS-evoked potential, consistent with cortical hyperexcitability. This abnormality was specific to regions with abnormal resting-state functional connectivity. Electrical source analysis in a subject with previously recorded seizures demonstrated that the origin of the abnormal TMS-evoked activity co-localized with the seizure-onset zone, suggesting the presence of an epileptogenic circuit. These results demonstrate how rs-fcMRI, TMS and EEG can be utilized together to identify and understand the physiological significance of abnormal brain connectivity in human diseases.

Resting-state functional-connectivity MRI has identified abnormalities in patients with a wide range of neuropsychiatric disorders, including epilepsy due to malformations of cortical development. Transcranial Magnetic Stimulation in combination with EEG can demonstrate that patients with epilepsy have cortical hyperexcitability in regions with abnormal connectivity.

マルチモーダルImaging-とてんかんの患者で接続関連の脳の興奮性を評価するの刺激に基づく方法

Resting-state functional connectivity MRI (rs-fcMRI) is a technique that identifies connectivity between different brain regions based on correlations ...

Retroductal Submandibular Gland Instillation and Localized Fractionated Irradiation in a Rat Model of Salivary Hypofunction

Normal tissues that lie within the portals of radiation are inadvertently damaged. Salivary glands are often injured during head and neck radiotherapy. Irreparable cell damage results in a chronic loss of salivary function that impairs basic oral activities, and increases the risk of oral infections and dental caries. Salivary hypofunction and its complications gravely impact a patient's comfort. Current symptomatic management of the condition is ineffective, and newer therapies to assuage the condition are needed. 
Salivary glands are exocrine glands, which expel their secretions into the mouth via excretory ducts. Cannulation of these ducts provides direct access to the glands. Retroductal delivery of a contrast agent to major salivary glands is a routine out-patient procedure for diagnostic imaging. Using a similar procedure, localized treatment of the glands is feasible. However, performing this technique in preclinical studies with small animals poses unique challenges. In this study we describe the technique of retroductal administration in rat submandibular glands, a procedure that was refined in Dr. Bruce Baum's laboratory (NIH)1, and lay out a procedure for local gland irradiation.

Salivary gland hypofunction, a major adverse effect of head and neck radiotherapy diminishes a patient's quality of life. The demonstration of efficacy of new therapies in animal models is a prerequisite before clinical transition. This protocol describes retroductal administration and local irradiation of rat submandibular glands.

唾液機能低下のラットモデルにおけるRetroductal顎下腺点滴とローカライズされた分割照射

Normal tissues that lie within the portals of radiation are inadvertently damaged. Salivary glands are often injured during head and neck radiotherapy. ...

A Pleural Effusion Model in Rats by Intratracheal Instillation of Polyacrylate/Nanosilica

Pleural effusion is a prevalent clinical finding of many pulmonary diseases. Having a useful animal pleural effusion model is very important to study these pulmonary diseases. Previous pleural effusion models paid more attention to biological factors rather than nanoparticles in the environment. Here, we introduce a model to make pleural effusion in rats by intratracheal instillation of polyacrylate/nanosilica, and a method of nanoparticle isolation in the pleural effusion. By intratracheal instillation of polyacrylate/nanosilica with concentrations of 3.125, 6.25 and 12.5 mg/kg&#8729;mL, the pleural effusion in rats presented on day 3, peaked at days 7-10 in 6.25 and 12.5 mg/kg&#8729;mL groups, then slowly decreased and disappeared on day 14. When the concentration of polyacrylate/nanosilica increased, the pleural effusion is produced more and faster. This pleural fluid was detected by ultrasound examination or CT chest scanning and confirmed by dissection of rats. Silica nanoparticles were observed in the rats' pleural effusion by transmission electron microscope. These results showed that the exposure to polyacrylate/nanosilica leads to the induction of pleural effusion, which was consistent with our previous report in humans. Additionally, this model is beneficial for the further study of nanotoxicology and the pleural effusion diseases.

Here, we present a protocol to construct a pleural effusion model in rats by intratracheal instillation of polyacrylate/nanosilica.

ポリアクリル酸/ナノシリカの気管内投与によるラットの胸水貯留モデル

Pleural effusion is a prevalent clinical finding of many pulmonary diseases. Having a useful animal pleural effusion model is very important to study ...

Inducing Acute Lung Injury in Mice by Direct Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation

Airway administration of lipopolysaccharide (LPS) is a common way to study pulmonary inflammation and acute lung injury (ALI) in small animal models. Various approaches have been described, such as the inhalation of aerosolized LPS as well as nasal or intratracheal instillation. The presented protocol describes a detailed step-by-step procedure to induce ALI in mice by direct intratracheal LPS instillation and perform FACS analysis of blood samples, bronchoalveolar lavage (BAL) fluid, and lung tissue. After intraperitoneal sedation, the trachea is exposed and LPS is administered via a 22 G venous catheter. A robust and reproducible inflammatory reaction with leukocyte invasion, upregulation of proinflammatory cytokines, and disruption of the alveolo-capillary barrier is induced within hours to days, depending on the LPS dosage used. Collection of blood samples, BAL fluid, and lung harvesting, as well as the processing for FACS analysis, are described in detail in the protocol. Although the use of the sterile LPS is not suitable to study pharmacologic interventions in infectious diseases, the described approach offers minimal invasiveness, simple handling, and good reproducibility to answer mechanistic immunological questions. Furthermore, dose titration as well as the use of alternative LPS preparations or mouse strains allow modulation of the clinical effects, which can exhibit different degrees of ALI severity or early vs. late onset of disease symptoms.

Presented here is a step-by-step procedure to induce acute lung injury in mice by direct intratracheal lipopolysaccharide instillation and to perform FACS analysis of blood samples, bronchoalveolar lavage fluid, and lung tissue. Minimal invasiveness, simple handling, good reproducibility, and titration of disease severity are advantages of this approach.

直接気管内リポ多糖刺激によるマウスの急性肺損傷の誘導

Airway administration of lipopolysaccharide (LPS) is a common way to study pulmonary inflammation and acute lung injury (ALI) in small animal models. ...

Development of a Noninvasive, Laser-Assisted Experimental Model of Corneal Endothelial Cell Loss

Nd:YAG lasers have been used to perform noninvasive intraocular surgery, such as capsulotomy for several decades now. The incisive effect relies on the optical breakdown at the laser focus. Acoustic shock waves and cavitation bubbles are generated, causing tissue rupture. Bubble sizes and pressure amplitudes vary with pulse energy and position of the focal point. In this study, enucleated porcine eyes were positioned in front of a commercially available Nd:YAG laser. Variable pulse energies as well as different positions of the focal spots posterior to the cornea were tested. Resulting lesions were evaluated by two-photon microscopy and histology to determine the best parameters for an exclusive detachment of corneal endothelial cells (CEC) with minimum collateral damage. The advantages of this method are the precise ablation of CEC, reduced collateral damage, and above all, the non-contact treatment.

Here, we present a protocol to detach corneal endothelial cells (CEC) from Descemet&#8217;s membrane (DM) using a neodymium:YAG (Nd:YAG) laser as an ex vivo disease model for bullous keratopathy (BK).

角膜内皮細胞損失の非侵襲的レーザー支援実験モデルの開発

Nd:YAG lasers have been used to perform noninvasive intraocular surgery, such as capsulotomy for several decades now. The incisive effect relies on the ...