信頼性の高い動物モデルは、基礎研究の重要な要素です。私たちのマウスアプローチは、哺乳類における急性肺損傷の発達のメカニズムと運動に関する免疫学的質問に答えることを可能にする。この技術の主な利点は、侵襲性、シンプルなハンドリング、および良好な再現性です。
さらに、用量滴定により、臨床効果を調節することができる。この技術は、重度の肺損傷を有する患者の臨床状況を反映し、基礎となるメカニズムを調査することを可能にする。リポ多糖(LPS)を1ミリリットル当たり5ミリグラムの濃度でアリコートにマイナス20度で保存する。
気管内の内植え付けの場合は、解凍したLPSを無菌リン酸緩衝生理食塩水で希釈し、1ミリリットル当たり2,000マイクログラムの最終濃度にします。22ゲージの静脈カテーテルを20ミリメートルの長さに切ります。温度調節テーブルの上の起こりやすい位置にマウスを置き、体温を摂氏37度に保ちます。
テキストプロトコルに記載されている麻酔に続いて、麻酔下での角膜の乾燥を防ぐために無菌眼用潤滑剤を塗布する。表の約5センチメートル上に位置する水平バーの頭とフック切歯を持ち上げ、前足はテーブルと密接に接触したままにします。テーブルに対して90度の角度で首を超伸ばします。
喉頭の上の皮膚に冷たい光源を置き、声帯を視覚化し、気管を目指します。より簡単な挿管状態のために喉をまっすぐにするために鉗子で舌を保持します。喉頭の適切な可視化と同定は、カテーテルの正しい気管内配置を保証するために重要である。
外部のコールド 光源は、この手順で役立ちます。約10ミリメートルのカテーテルを気管に入れる。挿入が深すぎないようにして、右または左の主気管支に液体を一方的に引き込む。
喉頭の抵抗が生じた場合は、カテーテルを数ミリメートル引き込んでから再び進む。次に、ピペットを使用してLPS希釈MPBSを注入します。注入された容積はマウスの体重によって異なる。
注射器を接続し、50マイクロリットルの空気のボーラスを加えて、完全な液体量が肺に分配されるようにします。カテーテルをゆっくり取り外します。気管からの液体の漏出を避けるために、マウスの上半身を30秒間直立した位置に保ちます。
手術台の上にテープで安楽死させたマウスを固定し、すぐに70%エタノールで腹部の上に毛皮を消毒します。はさみとピンセットで中央線で慎重に腹腔を開きます。腹部大動脈の椎骨柱に右静脈の右にアクセスを達成するために腸の一部を削除します。
腎臓静脈を見つけ、静脈の合流点のすぐ下の静脈の下の静脈の下に、1ミリリットルの注射器に接続された曲がった23ゲージのカニューレを静脈の下に挿入する。250マイクロリットルの血液を吸引し、0.5モルEDTA溶液の20マイクロリットルで満たされた1.5ミリリットルのチューブに移す。EDTAの混合を容易にするために穏やかに振り、氷の上にチューブを置きます。
気管支肺胞洗浄の場合は、3つの1ミリリットルの注射器を調製し、それぞれに0.5ミリリットルの無菌PBSと0.1ミリリットルの空気を入れる。70%エタノールで喉の毛皮を消毒し、慎重にはさみとピンセットで気管を露出させます。気管を動員し、その周りに縫合糸を包みます。
マイクロハサミを使用して気管を穿刺し、22ゲージの静脈カテーテルを挿入し、20ミリメートルの長さにカットします。縫合糸でカテーテルを固定し、無菌PBSの0.5ミリリットルと空気の0.1ミリリットルを植え付ける。60秒後に流体を吸引する。
追加の2つの注射器で手順を繰り返し、氷の上の15ミリリットルのチューブに全体の吸引を収集します。慎重に肺を収穫するためにはさみとピンセットで胸郭を開きます。横隔膜を肋間に沿って切り、2つの横切りで肋骨を切り裂く。
慎重に肺を穿刺しないでください。胸骨をクラニに持ち上げ、固定または取り外します。暖かい、摂氏37度のPBSで2つの10ミリリットルの注射器を準備します。
左心室に小さな切開を行います。右心室を26ゲージのカニューレで穿刺する。次いで、肺循環を事前に温めたPBSで洗い流します。
処置中に肺が青白くなるのに注意してください。肺の右葉を取り出し、半分に切ります。スナップは液体窒素でそれらを凍結し、続いてマイナス80°Cで長期保存して、さらなる遺伝子発現とタンパク質分析を行います。
左肺全体を取り除き、はさみとピンセットで組織を細かく刻んで48ウェルプレートで均質化します。37°Cで2ミリリットルの消化バッファーで組織を60分間インキュベートします。肺組織片を上下に慎重にピペット処理することにより、さらなる均質化を行う。
血液サンプルを5ミリリットルのFACSチューブに移し、2ミリリットルの赤血球リシスバッファーで血液を穏やかに混合します。氷の上にチューブを置き、氷冷PBSの2ミリリットルを追加することによって2分後に反応を終了します。試料を400倍gで5分間遠心し、上清を捨てる。
60マイクロリットルのFACSバッファを有する細胞ペレットを再懸濁し、前述のプロトコルに従って後述のFACS染色処理を行う。遠心BAL液を400回gで5分間用いた。上清を吸引し、液体窒素で凍結し、その後マイナス80°Cで長期保存してさらなるタンパク質分析を行います。
2ミリリットルの冷たいFACSバッファーでBAL細胞ペレットを再懸濁した後、100ミクロンのメッシュフィルターを使用して5ミリリットルのFACSチューブにサスペンションを移してヘアを拘束します。再度サンプルを遠心処理した後、60マイクロリットルのFACSバッファを用いてペレットを再懸濁し、前述のプロトコルに従って後述のFACS染色処理を行います。次に、消化した左肺組織を5ミリリットルのFACSチューブに移し、100ミクロンのメッシュフィルターを使用して塊を抽出します。
400回gで5分間サンプルを遠心する前に、氷冷FACSバッファーの2ミリリットルを追加することによって消化プロセスを終了します。上清を捨て、上記のプロトコルに従って後のFACS染色のためのFACSバッファおよびプロセスの60マイクロリットルでペレットを再中断します。FACS 分析では、CD16/CD32 抗体ブロッキング溶液を 20 マイクロリットルの 5 ミリリットルチューブの 60 マイクロリットルの細胞に加えます。
Fc受容体への免疫グロブリンの非特異的結合をブロックするために、摂氏4度で細胞を15分間インキュベートします。一方、テキストプロトコルに記載されているように、FACSバッファーおよび抗体を用いてマスターミックスを調製する。ブロッキング後、細胞を洗浄しないでください。
1サンプルあたり20マイクロリットルの抗体マスターミックスを加えると、100マイクロリットルの最終体積を得られます。サンプルを暗闇の中で摂氏4度で20分間インキュベートします。各サンプルをFACSバッファーと遠心分離機を1ミリリットルで洗浄します。
上清を捨て、FACS測定のために適切な細胞濃度にFACSバッファーを使用してペレットを再中断します。最後に、各サンプルに市販のフルオロクロム結合キャリブレーションビーズの固定数を追加して、絶対細胞数を決定します。血液、BAL、および組織細胞のテキストプロトコルに示されている格言戦略を使用してフローサイトメトリーを実行します。
24時間と72時間後の気管内点眼点眼は、肺組織におけるTNF-αの発現が著しくアップレギュレートされ、対照動物に比べて持続し、50倍以上の増加に達した。組織および歯槽腔へのロイコサイト浸潤は、急性肺損傷の発症の特徴であり、特徴的である。FACS分析は肺間組球への好中球顆粒球の有意な浸潤を明らかにし、絶対細胞数は24時間後の対照と比較してほぼ9倍に増加した。
無数好中球顆粒球数は72時間後にわずかに減少したが、対照と比較して因子の増加は残った。間質性好中球顆粒球浸潤と一致し、肺組織全体におけるMMP-9発現も同様に全観察期間にわたって有意に増加した。好中球顆粒球は肺組織だけでなくBAL液でも増加した。
コントロール動物と比較して折り目の増加は、肺組織よりも顕著であった。肺胞毛管バリアの重篤な障害による肺浮腫は、急性肺損傷の発症のための病理性である。ELISAによるBAL液中のアルブミン含量の分析は、LPSの植え付け後24時間および72時間でのバリア機能の有意な損失を明らかにした。
LPSの両側の植え付けには、適切なカテーテルの配置が重要です。咳やあえぎなどの呼吸パターンの変化は、しばしば、液体の正しい気管内点眼の点眼を示す。急性肺損傷の誘導後、FACS解析、PCR、タンパク質検出などの多くの後続のステップを、それぞれの研究課題に答えるために行われ得る。
