この作業は、部分的には通信社国立からの補助金によって支えられてLAルシェルシュ、PIRIbioプログラムDynabiofilmを注ぎ、CNRS学際リスクプログラムから。我々は、 大腸菌を提供するための原稿の彼の重要な読書のためのフィリップThomenとクリストフBeloinに感謝本研究で使用した大腸菌株 。

1。細菌培養および懸濁製剤<ol><li>溶原性ブロス（LB）寒天プレートから新鮮に成長したコロニーを選び、5ミリリットルで100μグラム/ mlのアンピシリンおよび7.5μグラム/ mlのテトラサイクリンを含む液体LB培地をそれに接種し、37℃のオンで​​5〜6時間のためにそれをインキュベート揺れプラットフォーム。 </li><li>その後、最小培地（M63B1）は0.4％グルコースと同じ抗生物質濃度を補っ5ミリリットル中の細菌培養の100μLを追加します。揺れプラットフォーム上で37℃で、この新たに希釈した培養を一晩培養する。 </li><li>インキュベーションの16時間後、5ミリリットルM63B1、0.4％グルコースに一晩培養μlの100を追加します。 0.5 ODに達するまで揺れプラットフォームに37℃でチューブを保管してください。サスペンションは、バイオフィルム形成のための実験チャネルに注入するための準備ができる。 </li></ol> 2磁気粒子調製<ol><li> 10μlの磁性粒子を取る -直径2.8μM -在庫から、それらを磁気サンプルラックを用いて190μlの最小培地中で3倍洗う。 </li><li> 5×10 6ビーズ/ mlに粒子濃度を調整します。典型的に洗浄し、ビーズ溶液の50μlを、0.4％グルコースを有するM63B1のさらなる950μリットルと混合される。 </li></ol> 3。チャンネルの調製とバイオフィルムの成長<ol><li>チャンネル取り付け<ol><li> 2長さ8cmの部分を得るために長さ10cm 2の正方形（800μmの辺の長さ）ホウケイ酸ガラスキャピラリーを切った。 </li><li>最初の半分にカット- - （SOスーパーグルーと呼ばれる）即効性シアノアクリレート接着剤を使用して、図1のように、どちらかの端に1cmのオーバーハングとは別に2センチメートル2枚のスライドガラス上に2つのキャピラリー部分を接着します。 </li><li>全体のセットアップと、さらにチャネル接続に必要な必要なチューブをオートクレーブ。 </li><li>下のすべての無菌材料を集める層流フード：I）を搭載し、チャネルとトラップ1、II）、チューブやコネクタ、III）2バブルトラップ - バブルフィルタは一般的に子供の点滴送り（トラップ1）と自家製気泡トラップを保護するために使用大きな直径の長さ4cmの管（トラップ2）のような、iv）のクランプ、v）をM63B1、0.4％グルコース、およびvi）廃液ボトルが充填された30ミリリットルの注射器。 </li><li>廃液ボトルにシリンジポンプ、小児バブルフィルタ、自家製の気泡トラップ、キャピラリー（ 図1、パネルB）、チューブによって制御さ50ミリリットルM63B1注射器：次の順序でルアーロックconnectersまたは接合を有する全体のセットアップを接続します。その後、約10ミリリットルの実験の料金よりも高く/時の速度でシリンジポンプの電源を入れる、無菌M63B1、0.4％グルコースをセットアップを埋める。慎重に追跡し、回路内のすべての気泡を除去する。 </li><li> 10〜15分間システムを介してメディアを流す。同時にセクションからOD 0.5で細菌懸濁液1mlをミックス2.2節で作成洗浄ビーズ溶液1mLで1.3。 </li><li>前後の毛細血管：添付します（ただし、閉じないでください）​​2の位置でチューブにクランプします。流れを切ります。 </li><li>ホーム管は空気流入を防止するために、終了まで保持するように注意しながら、1ミリリットルの注射器を使用して気泡トラップを作った後にキャピラリーに細菌 - ビーズ混合物をご紹介します。チューブを再び取り付けてからクランプを閉じます。 </li><li>第2の毛管のために同じ手順を繰り返し、気泡のためのすべてのチューブをご確認ください。 </li><li>顕微鏡に装置を転送し、それを解決し、キャピラリーの表面に付着する細菌を可能にするために15〜20分間放置する。わずかに高いレベルでの廃棄物容器に顕微鏡ステージ上に毛細血管をインストールします。顕微鏡の横のカウンターの上にシリンジポンプを配置します。気泡を捕捉する毛管面よりもわずかに高い毛管前に気泡トラップを上昇させる。 </li></ol></li><li>バイオフィルムグロWTH <ol><li>シリンジポンプでの流量を調整し、フローを開始し、バイオフィルムは現在、必要な期間の間にキャピラリー表面に発展する - これらの実験では、通常は24または48時間。 </li><li>キャピラリー底面に焦点を当て、サンプル画像のタイムラプス撮影を開始 - 2画像の通常取得頻度/分を十分にバイオフィルムの成長を報告します。このビデオモニター、バイオフィルムの成長後のコントロール（ ビデオ1、2および3の抽出を参照してください）。 </li></ol></li></ol> 4。磁気ピンセットのインストール<ol><li>手動で制御のXYZマイクロマニピュレータ上の磁気ピンセットをねじ込み、比較的毛細血管にピンセットの位置を調整する顕微鏡ステージ上でマニピュレーターをねじ込みます。適切な磁場勾配が観察ゾーンにおいて生成されていることを確認するために、図2のようにピンセットを置く。 </li><li>ピンセットをTに接続するO電力増幅器を介してファンクション·ジェネレータは、24秒でゼロ信号及び4の配列を提供する信号同期のための20秒後に明視野光シャッターに送られ、トリガとの直接的な電流の16秒からなる時間の40秒の周期を生成する図3のようなイベント。 注：これらの2つの操作は、キャピラリーのインストールと測定開始までの任意の時点で達成することができる。 図4の概要スケッチを試して参照してください。 </li></ol> 5。クリープ曲線取得<ol><li>左側の磁極と同じ観察視野内の毛細血管の左端の端を持って来るために顕微鏡ステージのXY移動コントロールを使用します。 （ 図2参照）は、それぞれ、毛細管の端部によって規定されるx軸およびy軸の交点と磁極片の端部で解析参照の起源を取る。 </li><li>ファインフォーカスcを用いてキャピラリーの垂直位置を調整する顕微鏡位置のontrolつまみ。通常、最初に検査面はμ4から7の間メートルキャピラリー底部の上方に位置しています。 ビデオ1は、空間参照の原点にその左上隅を持つXYフィールドに対応しています。 </li><li> ビデオ1の画像取得シーケンスをトリガ手動で、電流発生器に同時に切り替えることにより、セクション4.2および図3に記載されたイベントの40秒シーケンスをトリガする。 </li><li>左に顕微鏡ステージの250μmの翻訳で隣人右のフィールドに、キャピラリを移動し、スライス2のビデオ2を生成するというように、必要なビデオを得るために、セクション5.3のように動作します。 250×250μm 2の典型的に3〜4のフィールドは平面を変更し、新たな面に対して同じ動作を繰り返す前に、x軸に沿って収集される。 </li></ol> 6。フォースキャリブレーション<ol><li>双方向の蒸留水190μLと2×10 9個/ mlの磁性粒子の10μlのグリセロールの39.8グラムを混合することによってグリセロール溶液を調製し、この混合物を用いて実験的なチャネルを記入し、顕微鏡のステージ上に置きますバイオフィルム試料から調製した。 </li><li>セクション4に示すように、磁気ピンセットをインストールした後、5.4節に示されているように、磁力を適用し、キャリブレーションファイルを導き出すために、毛細管内の各単一粒子速度（V）とその位置を抽出するために、タイムラプス画像を作る。このファイルには、キャピラリの分析ストークスの法則によると、F =6πRηv（：粒子の半径R）のゾーン内の位置の関数として加えられた力が含まれている必要があります。 </li></ol> 7。分析<ol><li>セクション5に示すように取得された画像のすべてのスタックの各フレーム内のパーティクルの位置でテキストフ​​ァイルを取得するために「粒子トラッカー」ソフトウェアを使用してください。使うgの画像スタック取得周波数は、時間の関数としての粒子変位（ 例えば、 図5およびビデオ4）を計算する。 </li><li>フォースキャリブレーションファイルを使用して、コンプライアンス曲線に変位曲線を変換する（材料の全コンプライアンス- J（t）は、 -時間の関数として）コンプライアンス式に従って。 <img alt="" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/50857/50857eq1.jpg" width="106" /> これは、材料の歪みとの関係を与え、予めSchnurr及び共同研究者19によって確立された非圧縮性の、均質な粘弾性媒体に埋め込 ​​まれた半径Rのプローブ粒子のために応力を印加する。 </li><li>粘弾性材料のための一般的なバーガーモデルにクリープコンプライアンス曲線を調整し、粘弾性パラメータを導出、J 0、J 1、0η、各粒子のためのη1（ <strong&gt;バーガー&#39;式に基づいて図6）。 <img alt="" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/50857/50857eq2.jpg" width="169" /> 注：この現象論的分析は、以前はそのような巨視的なレオロジーデータ20-22を解釈するバイオフィルムのような生物学的材料を含む広範囲の材料のために採用されている。 </li></ol>

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B., Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscoelastic+properties+of+a+mixed+culture+biofilm+from+rheometer+creep+analysis.">Viscoelastic properties of a mixed culture biofilm from rheometer creep analysis.</a> Biofouling. 19, 279-285 (2003).</li><li>Lau, P. C., Dutcher, J. R., Beveridge, T. J., Lam, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+quantitation+of+bacterial+biofilm+adhesion+and+viscoelasticity+by+microbead+force+spectroscopy.">Absolute quantitation of bacterial biofilm adhesion and viscoelasticity by microbead force spectroscopy.</a> Biophysical journal. 96, 2935-2948 (2009).</li><li>Poppele, E. H., Hozalski, R. 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W., Cunningham, A., Stoodley, P., McKittrick, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+of+fluid-biofilm+interaction+using+a+Burger+material+law.">A model of fluid-biofilm interaction using a Burger material law.</a> Biotechnol Bioeng. 96, 259-271 (2007).</li><li>Jones, W. L., Sutton, M. P., McKittrick, L., Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+and+antimicrobial+treatments+change+the+viscoelastic+properties+of+bacterial+biofilms.">Chemical and antimicrobial treatments change the viscoelastic properties of bacterial biofilms.</a> Biofouling. 27, 207-215 (2011).</li><li>Apgar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple-particle+tracking+measurements+of+heterogeneities+in+solutions+of+actin+filaments+and+actin+bundles.">Multiple-particle tracking measurements of heterogeneities in solutions of actin filaments and actin bundles.</a> Biophysical journal. 79, 1095-1106 (2000).</li></ol>

我々は、開示することは何もありません。

この磁性粒子は、播種し、元の状態で成長しているバイオフィルムの粘弾性パラメータをその場で 3Dマッピングで有効になって実験を引っ張って。このアプローチは、Eの機械的な不均一性を明らかにした大腸菌バイオフィルムは、ここで増殖させ、細胞外マトリックスに強く、より正確には架橋の程度の基本的な意味を示唆し、バイオフィルムの物理的特性...

細菌バイオフィルムは、生物学的または人工表面1-3に関連する細菌の共同体である。彼らは建物4,5を保護し、安定化多糖類を多く含む細胞外マトリックスの生産と相まって接着成長機構によって構成している。これらのバイオフィルムは、表面に付着した細胞の単に受動的な集合体ではなく、組織化され、動的な複雑な生物系。細菌が浮遊性のバイオフィルムのライフスタイルに切り替えると、遺伝子発現および細胞生理の変化が観察されただけでなく、抗菌剤に対する耐性を増加させ、多くの持続的かつ慢性感染症6の原点にあること免疫防御をホストしている。しかし、これらの生活の構造の制御された開発はまた、有害廃棄物処理場のバイオレメディエーション、工業用水やcontaminから土壌·地下水を保護するためのバイオ障壁の形成のバイオろ過などの産業や環境のアプリケーションのための機会を提供ATION。 生活のバイオフィルム方法と特定の分子の機能がますます記載されているが、地域社会の発展と持続性を駆動するメカニズムは不明である。走査型電気化学または蛍光顕微鏡を用いてマイクロスケール測定に関する最近の進歩を用いて、これらの生体組織はかなりの構造的、化学的および生物学的な異質7を示すことが示されている。しかし、今までは、バイオメカニクスは、主にマクロ的に検討されている。例えば、バイオフィルムストリーマの観測は、流体の流量8,9の変化による変形、バイオフィルム片の一軸圧縮を寒天培地から持ち上げたり、カバーをして10,11、環境から収集されたバイオフィルムのせん断および並列に転送をスライド上で増殖プレートレオメーター12,13、AFMカンチレバー14または専用MICRに付着した細菌バイオフィルムとガラスビーズおよびコーティングを使用した原子間力分光法15,16は、材料17の粘弾性の性質に関する有用な情報を提供し、最後の10年間に実施されてきた離脱バイオフィルム断片の引張強度を測定する方法ocantilever。しかしながら、材料はしばしば、これらのアプローチであった場合、その天然の環境から取り出されたとき、その場バイオフィルムの機械的特性の情報が失われる可能性が高いようである。また、均質な材料としてバイオフィルムの治療は、コミュニティ内での物理的性質の可能性のある不均一性に関する情報をミス。したがって、構造バイオフィルム形成における力学とそのような遺伝子発現のパターニングまたは化学的勾配のような生物学的特性の正確な影響はほとんど認められないことができる。バイオフィルムの物理的性質のマイクロスケールの記述に向けて進行し、新たな専用のツールが必要です。 本論文では、達成するために考案さ独創的なアプローチを詳述バイオフィルムを妨害し、マイクロスケールの材料特性の空間分布の描画した後、機械的な不均一性を可能にすることなく、 その場での局所的な機械的パラメータの測定、。実験の原理は、成熟したバイオフィルムの磁気ピンセットを使用してリモートローディングが続く磁性微粒子と成長しているバイオフィルムのドーピングにかかっている。顕微鏡下で画像化され、制御磁気力作用下の粒子変位は、地元の粘弾性パラメータ導出、独自のローカル環境を報告し、各粒子を可能にします。これらのデータから、バイオフィルムの機械的な3Dプロファイルは、空間的および環境条件依存性を明らかにし、引き出すことができる。実験全体を大腸菌にここに表示されます大腸菌バイオフィルムは抑制解除のF様プラスミドを有する遺伝子改変株によって行われた。最近の論文18に詳細な結果は、無傷のバイオメカニクスの内部のユニークなビジョンを提供します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1258">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td colspan="5" height="21" style="height:21px;width:1257px;">Table 1: Reagents and cells</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="20" rowspan="2" style="height:22px;width:216px;">Magnetic particles</td>
			<td rowspan="2" style="width:323px;">Life technologies</td>
			<td rowspan="2" style="width:224px;">14307D</td>
			<td colspan="2" rowspan="2" style="width:496px;">Micrometric magnetic particle, 2.8 &#181;m diameter</td>
		</tr>
		<tr height="2">
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">Ampicillin (Antibiotic)</td>
			<td style="width:323px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:224px;">A9518</td>
			<td colspan="2" style="width:496px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tetracycline (Antibiotic)</td>
			<td style="width:323px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:224px;">87128</td>
			<td colspan="2" style="width:496px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bacterial strain MG1655gfpF</td>
			<td style="width:323px;">UGB, Institut Pasteur, France</td>
			<td style="width:224px;"></td>
			<td colspan="2" style="width:496px;">produces F pili at its surface, resistant to Ampicilllin and tetracycline</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="5" height="21" style="height:21px;width:1257px;">Table 2:&#160; Capillaries and tubing</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:216px;">Filters for pediatric perfusion</td>
			<td style="width:323px;">Prodimed-Plastimed</td>
			<td style="width:224px;">6932002</td>
			<td colspan="2" style="width:496px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Hollow Square Capillaries</td>
			<td style="width:323px;">Composite Metal Scientific</td>
			<td style="width:224px;">8280-100</td>
			<td colspan="2" style="width:496px;">Manufactured in Borosilicate glass. Square 0.8mm x0.8mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tubing silicone peroxyde</td>
			<td style="width:323px;">VWR international</td>
			<td style="width:224px;">228-0512</td>
			<td colspan="2" style="width:496px;">Diameter 1mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tubing silicone peroxyde</td>
			<td style="width:323px;">VWR international</td>
			<td style="width:224px;">228-0700</td>
			<td colspan="2" style="width:496px;">Diameter 3mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Table 3: Biofilm growth</td>
			<td style="width:323px;"></td>
			<td style="width:224px;"></td>
			<td style="width:495px;"></td>
			<td style="width:1px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lysogeny Broth (LB) solution</td>
			<td style="width:323px;">Amresco-VWR</td>
			<td style="width:224px;">J106-10PK</td>
			<td colspan="2" style="width:496px;">standard medium used to grow bacteria</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">M63B1 solution</td>
			<td style="width:323px;">Home-made</td>
			<td style="width:224px;"></td>
			<td colspan="2" style="width:496px;">Standard minimum&#160; medium used to grow bacteria</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glucose</td>
			<td style="width:323px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:224px;">G8270</td>
			<td colspan="2" style="width:496px;">Used to make M63B1 medium with 0.4% glucose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="5" height="21" style="height:21px;width:1257px;">Table 4: Electronics</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Camera EMCCD&#160;&#160;</td>
			<td style="width:323px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:224px;">C9100-02</td>
			<td colspan="2" style="width:496px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">Heater controller</td>
			<td style="width:323px;">World precision instruments</td>
			<td style="width:224px;">300354</td>
			<td colspan="2" style="width:496px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Function generator</td>
			<td style="width:323px;">Agilent technologies</td>
			<td style="width:224px;">33210A</td>
			<td colspan="2" style="width:496px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Power amplifier</td>
			<td style="width:323px;">Home-made</td>
			<td style="width:224px;"></td>
			<td colspan="2" style="width:496px;">It gives a current signal with amplitudes up to 4 A.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Syringe pumps</td>
			<td style="width:323px;">Kd Scientific</td>
			<td style="width:224px;">KDS-220</td>
			<td colspan="2" style="width:496px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Shutter</td>
			<td style="width:323px;">Vincent Associates</td>
			<td style="width:224px;">Uniblitz T132</td>
			<td colspan="2" style="width:496px;"></td>
		</tr>
		<tr height="125">
			<td height="125" style="height:125px;width:216px;">Magnetic tweezers</td>
			<td style="width:323px;">Home-made</td>
			<td style="width:224px;"></td>
			<td colspan="2" style="width:496px;">Two electromagnetic poles, each made of a copper coil with 2,120 turns of 0.56 mm in diameter copper wire and soft magnetic alloy cores (Supra50-Arcelor Mittal, France) square shaped according to the blueprint shown in Fig. 10. The two cores are mounted north pole facing south pole, in order to generate a magnetic force in one direction along the length of the capillary. See coil wiring details in Figure 11.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="5" height="21" style="height:21px;width:1257px;">Table 5: Optics</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Inverted microscope&#160;</td>
			<td style="width:323px;">Nikon</td>
			<td style="width:224px;">TE-300</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">S Fluor x40 Objective (NA 0.9, WD0.3)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td style="width:224px;"></td>
			<td>This a long working distance ojective enabling observation of the biofilm in the depth</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Epifluorescence filters: 1) for green fluorescence: Exc 480/20 nm; DM 495; Em 510/20&#160; 2) for Red fluorescence: Exc 540/25 nm; DM 565; Em 605/55</td>
			<td style="width:323px;">Chroma</td>
			<td style="width:224px;">1)#49020 2)#31002</td>
			<td>Particle displacement upon force application is recorded using the red fluoresecnce filter block.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="5" height="21" style="height:21px;width:1257px;">Table 6: Image analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ImageJ</td>
			<td style="width:323px;">NIH - particle tracker plugin</td>
			<td style="width:224px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

remote magnetic actuation of micrometric probes for in situ 3d mapping of bacterial biofilm physical properties

インターフェイス上の細菌の付着と成長が3次元不均質な構造、いわゆるバイオフィルムの形成につながる。これらの構造の住居の細胞は、細胞外高分子物質のネットワークが介在する物理的な相互作用によって一緒に保持されている。細菌バイオフィルムは、多くの人間の活動に影響を与え、その性質を理解することは、彼らの開発のより良い制御のために重要である - 保守または根絶 - 彼らの有害または有益な結果に依存。本稿では、今まで、唯一の肉眼的および均質材料の観点から検討、 その場にあったバイオフィルムの局所的な物性を測定することを目指して新たな方法論を説明します。ここに記載された実験は、リモートでバイオフィルムの構造特性を乱すことなく作動させることができるローカルなプローブをシードする成長バイオフィルムに磁性粒子を導入することを含む。専用の磁気ピンセットDEVEたバイオフィルムに埋め込まれた各粒子に定義されている力を発揮するloped。セットアップは、粒子引上げ期間のタイムラプス画像の記録を可能にするために顕微鏡のステージに取り付けられている。粒子軌道はその後引っ張っ配列から抽出され、ローカル粘弾性パラメータは、これにより、パラメータの3次元空間分布を提供し、各粒子変位曲線から誘導される。バイオメカニカルプロファイルに洞察を得ることは、アーキテクチャの特性と、これらの構造の具体的な生物学の間の関係を明確にするために、バイオフィルム制御のためのビューの技術者の視点からだけでなく、根本的な観点から必要不可欠である。

典型的な分析は、元の配置を乱すことなく、生きている生物膜上にミクロンスケールでの粘弾性パラメータの空間分布を提供する。弾性コンプライアンス- -深さに沿っおよびバイオフィルムの横方向寸法に沿ってy軸、z軸の関数として与えられる典型的な結果は、J 0の値は、図7に示されている。各ポイントは、クリープ曲線分析は、J 0の値を提供したビーズに対?...

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Remote Magnetic Actuation of Micrometric Probes for in situ 3D Mapping of Bacterial Biofilm Physical Properties

本論文では、細菌バイオフィルムと、その場で界面で微生物によって構築された複雑な生活材料の局所的な機械的特性を測定するための専用の磁気ピンセットの開発に播種磁性粒子の遠隔操作に基づいて、元の方法論を示しています。

のためのマイクロメトリックプローブの遠隔磁気作動<em&gt;その場での</em細菌バイオフィルム物性&gt; 3Dマッピング

Bacterial adhesion and growth on interfaces lead to the formation of three-dimensional heterogeneous structures so-called biofilms. The cells dwelling in ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Remote Magnetic Actuation of Micrometric Probes for in situ 3D Mapping of Bacterial Biofilm Physical Properties

9.1K ビュー.  Sorbonne Universités, UPMC. 本論文では、細菌バイオフィルムと、その場で界面で微生物によって構築された複雑な生活材料の局所的な機械的特性を測定するための専用の磁気ピンセットの開発に播種磁性粒子の遠隔操作に基づいて、元の方法論を示しています。 

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Multiparametric Optical Mapping of the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not have been accomplished by other approaches1. With the use of the calcium- and voltage-sensitive dyes, optical mapping allows measurement of transmembrane action potentials and calcium transients with high spatial resolution without the physical contact with the tissue. This makes measurements of the cardiac electrical activity possible under many conditions where the use of electrodes is inconvenient or impossible1. For example, optical recordings provide accurate morphological changes of membrane potential during and immediately after stimulation and defibrillation, while conventional electrode techniques suffer from stimulus-induced artifacts during and after stimuli due to electrode polarization1. 
The Langendorff-perfused rabbit heart is one of the most studied models of human heart physiology and pathophysiology. Many types of arrhythmias observed clinically could be recapitulated in the rabbit heart model. It was shown that wave patterns in the rabbit heart during ventricular arrhythmias, determined by effective size of the heart and the wavelength of reentry, are very similar to that in the human heart2. It was also shown that critical aspects of excitation-contraction (EC) coupling in rabbit myocardium, such as the relative contribution of sarcoplasmic reticulum (SR), is very similar to human EC coupling3. Here we present the basic procedures of optical mapping experiments in Langendorff-perfused rabbit hearts, including the Langendorff perfusion system setup, the optical mapping systems setup, the isolation and cannulation of the heart, perfusion and dye-staining of the heart, excitation-contraction uncoupling, and collection of optical signals. These methods could be also applied to the heart from species other than rabbit with adjustments to flow rates, optics, solutions, etc.
Two optical mapping systems are described. The panoramic mapping system is used to map the entire epicardium of the rabbit heart4-7. This system provides a global view of the evolution of reentrant circuits during arrhythmogenesis and defibrillation, and has been used to study the mechanisms of arrhythmias and antiarrhythmia therapy8,9. The dual mapping system is used to map the action potential (AP) and calcium transient (CaT) simultaneously from the same field of view10-13. This approach has enhanced our understanding of the important role of calcium in the electrical alternans and the induction of arrhythmia14-16.

This article describes the basic procedures for conducting optical mapping experiments in the Langendorff-perfused rabbit heart using the panoramic imaging system, and the dual (voltage and calcium) imaging modality.

ランゲンドルフ灌流ウサギの心臓のMultiparametric光学マッピング

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not ...

生物工学

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. Cardiovascular physiological phenotyping of the mouse heart can be easily done using fluorescence imaging employing various probes for transmembrane potential (Vm), calcium transients (CaT), and other parameters. Excitation-contraction coupling is characterized by action potential and intracellular calcium dynamics; therefore, it is critically important to map both Vm and CaT simultaneously from the same location on the heart1-4. Simultaneous optical mapping from Langendorff perfused mouse hearts has the potential to elucidate mechanisms underlying heart failure, arrhythmias, metabolic disease, and other heart diseases. Visualization of activation, conduction velocity, action potential duration, and other parameters at a myriad of sites cannot be achieved from cellular level investigation but is well solved by optical mapping1,5,6. In this paper we present the instrumentation setup and experimental conditions for simultaneous optical mapping of Vm and CaT in mouse hearts with high spatio-temporal resolution using state-of-the-art CMOS imaging technology. Consistent optical recordings obtained with this method illustrate that simultaneous optical mapping of Langendorff perfused mouse hearts is both feasible and reliable.

This paper details the dissection procedure, instrumental setup, and experimental conditions during optical mapping of transmembrane potential (Vm) and intracellular calcium transient (CaT) in intact isolated Langendorff perfused mouse hearts.

マウスの心臓の活動電位およびカルシウムトランジェントの光学的マッピング

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Magnetically-Assisted Remote Controlled Microcatheter Tip Deflection under Magnetic Resonance Imaging

X-ray fluoroscopy-guided endovascular procedures have several significant limitations, including difficult catheter navigation and use of ionizing radiation, which can potentially be overcome using a magnetically steerable catheter under MR guidance.
	The main goal of this work is to develop a microcatheter whose tip can be remotely controlled using the magnetic field of the MR scanner. This protocol aims to describe the procedures for applying current to the microcoil-tipped microcatheter to produce consistent and controllable deflections.
	A microcoil was fabricated using laser lathe lithography onto a polyimide-tipped endovascular catheter. In vitro testing was performed in a waterbath and vessel phantom under the guidance of a 1.5-T MR system using steady-state free precession (SSFP) sequencing. Various amounts of current were applied to the coils of the microcatheter to produce measureable tip deflections and navigate in vascular phantoms.
	The development of this device provides a platform for future testing and opportunity to revolutionize the endovascular interventional MRI environment.

Current applied to an endovascular microcatheter with microcoil tip made by laser lathe lithography can achieve controllable deflections under magnetic resonance (MR) guidance, which may improve speed and efficacy of navigation of vasculature during various endovascular procedures.

磁気共鳴イメージング下磁気アシストリモート制御マイクロカテーテルの先端偏向

X-ray fluoroscopy-guided  endovascular procedures have several significant limitations, including  difficult catheter navigation and use of ionizing ...

Fabrication of a Functionalized Magnetic Bacterial Nanocellulose with Iron Oxide Nanoparticles

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide nanoparticles (IONP) (Fe3O4) to yield a magnetic bacterial nanocellulose (MBNC). The synthesis of MBNC is a precise and specifically designed multi-step process. Briefly, bacterial nanocellulose (BNC) pellicles are formed from preserved G. xylinus strain according to our experimental requirements of size and morphology. A solution of iron(III) chloride hexahydrate (FeCl3&#183;6H2O) and iron(II) chloride tetrahydrate (FeCl2&#183;4H2O) with a 2:1 molar ratio is prepared and diluted in deoxygenated high purity water. A BNC pellicle is then introduced in the vessel with the reactants. This mixture is stirred and heated at 80 &#176;C in a silicon oil bath and ammonium hydroxide (14%) is then added by dropping to precipitate the ferrous ions into the BNC mesh. This last step allows forming in situ magnetite nanoparticles (Fe3O4) inside the bacterial nanocellulose mesh to confer magnetic properties to BNC pellicle. A toxicological assay was used to evaluate the biocompatibility of the BNC-IONP pellicle. Polyethylene glycol (PEG) was used to cover the IONPs in order to improve their biocompatibility. Scanning electron microscopy (SEM) images showed that the IONP were located preferentially in the fibril interlacing spaces of the BNC matrix, but some of them were also found along the BNC ribbons. Magnetic force microscope measurements performed on the MBNC detected the presence magnetic domains with high and weak intensity magnetic field, confirming the magnetic nature of the MBNC pellicle. Young&#39;s modulus values obtained in this work are also in a reasonable agreement with those reported for several blood vessels in previous studies.

Here, we present a protocol to make a bacterial nanocellulose (BNC) magnetic for applications in damaged blood vessel reconstruction. The BNC was synthesized by G. xylinus strain. On the other hand, magnetization of the BNC was realized through in situ precipitation of Fe2+ and Fe3+ ferrous ions inside the BNC mesh.

酸化鉄ナノ粒子との機能を有する磁性細菌Nanocelluloseの作製

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide ...

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances (EPS). The EPS serves as a physical and protective scaffold that houses the bacterial cells and consists of a variety of materials that includes proteins, exopolysaccharides and DNA. The composition of the EPS may change, which remodels the mechanic properties of the biofilm to further develop or support alternative biofilm structures, such as streamers, as a response to environmental cues. Despite this, there are little quantitative descriptions on how EPS components contribute to the mechanical properties and function of biofilms. Rheology, the study of the flow of matter, is of particular relevance to biofilms as many biofilms grow in flow conditions and are constantly exposed to shear stress. It also provides measurement and insight on the spreading of the biofilm on a surface. Here, particle-tracking microrheology is used to examine the viscoelasticity and effective crosslinking roles of different matrix components in various parts of the biofilm during development. This approach allows researchers to measure mechanic properties of biofilms at the micro-scale, which might provide useful information for controlling and engineering biofilms.

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Particle-tracking microrheology investigates the viscoelasticity of materials. Here, the technique is used to determine the viscoelasticity, creep compliance and effective crosslinking roles of different matrix components of a bacterial biofilm. The matrix consists of polymeric substances secreted by the bacteria and its components determine biofilm structure and mechanical properties.

粒子追跡マイクロレオロジーによりバイオフィルムの機械的特性のその場でのマッピング

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

Rapid Scan Electron Paramagnetic Resonance Opens New Avenues for Imaging Physiologically Important Parameters In Vivo

We demonstrate a superior method of 2D spectral-spatial imaging of stable radical reporter molecules at 250 MHz using rapid-scan electron-paramagnetic-resonance (RS-EPR), which can provide quantitative information under in vivo conditions on oxygen concentration, pH, redox status and concentration of signaling molecules (i.e., OH&#8226;, NO&#8226;). The RS-EPR technique has a higher sensitivity, improved spatial resolution (1 mm), and shorter acquisition time in comparison to the standard continuous wave (CW) technique. A variety of phantom configurations have been tested, with spatial resolution varying from 1 to 6 mm, and spectral width of the reporter molecules ranging from 16 &#181;T (160 mG) to 5 mT (50 G). A cross-loop bimodal resonator decouples excitation and detection, reducing the noise, while the rapid scan effect allows more power to be input to the spin system before saturation, increasing the EPR signal. This leads to a substantially higher signal-to-noise ratio than in conventional CW EPR experiments.

Rapid Scan Electron Paramagnetic Resonance Opens New Avenues for Imaging Physiologically Important Parameters In Vivo

A new electron paramagnetic resonance (EPR) method, rapid scan EPR (RS-EPR), is demonstrated for 2D spectral spatial imaging which is superior to the traditional continuous wave (CW) technique and opens new venues for in vivo imaging. Results are demonstrated at 250 MHz, but the technique is applicable at any frequency.

高速走査電子常磁性共鳴イメージング生理学的に重要なパラメータのための新しい道を開きます。<em&gt;インビボ</em

We demonstrate a superior method of 2D spectral-spatial imaging of stable radical reporter molecules at 250 MHz using rapid-scan ...

3D Magnetic Stem Cell Aggregation and Bioreactor Maturation for Cartilage Regeneration

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach recently explored for the development of autologous replacements involves the differentiation of stem cells into chondrocytes. To initiate this chondrogenesis, a degree of compaction of the stem cells is required; hence, we demonstrated the feasibility of magnetically condensing cells, both within thick scaffolds and scaffold-free, using miniaturized magnetic field sources as cell attractors. This magnetic approach was also used to guide aggregate fusion and to build scaffold-free, organized, three-dimensional (3D) tissues several millimeters in size. In addition to having an enhanced size, the tissue formed by magnetic-driven fusion presented a significant increase in the expression of collagen II, and a similar trend was observed for aggrecan expression. As the native cartilage was subjected to forces that influenced its 3D structure, dynamic maturation was also performed. A bioreactor that provides mechanical stimuli was used to culture the magnetically seeded scaffolds over a 21-day period. Bioreactor maturation largely improved chondrogenesis into the cellularized scaffolds; the extracellular matrix obtained under these conditions was rich in collagen II and aggrecan. This work outlines the innovative potential of magnetic condensation of labeled stem cells and dynamic maturation in a bioreactor for improved chondrogenic differentiation, both scaffold-free and within polysaccharide scaffolds.

Chondrogenesis from stem cells requires fine tuning the culture conditions. Here, we present a magnetic approach for condensing cells, an essential step to initiate chondrogenesis. In addition, we show that dynamic maturation in a bioreactor applies mechanical stimulation to the cellular constructs and enhances cartilaginous extracellular matrix production.

軟骨再生のための3次元磁気幹細胞凝集およびバイオリアクター成熟

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach ...

Optimized Setup and Protocol for Magnetic Domain Imaging with In Situ Hysteresis Measurement

This paper elaborates the sample preparation protocols required to obtain optimal domain patterns using the Bitter method, focusing on the extra steps compared to standard metallographic sample preparation procedures. The paper proposes a novel bespoke rig for dynamic domain imaging with in situ BH (magnetic hysteresis) measurements and elaborates the protocols for the sensor preparation and the use of the rig to ensure accurate BH measurement. The protocols for static and ordinary dynamic domain imaging (without in situ BH measurements) are also presented. The reported method takes advantage of the convenience and high sensitivity of the traditional Bitter method and enables in situ BH measurement without interrupting or interfering with the domain wall movement processes. This facilitates establishing a direct and quantitative link between the domain wall movement processes&#8211;microstructural feature interactions in ferritic steels with their BH loops. This method is anticipated to become a useful tool for the fundamental study of microstructure&#8211;magnetic property relationships in steels and to help interpret the electromagnetic sensor signals for non-destructive evaluation of steel microstructures.

Optimized Setup and Protocol for Magnetic Domain Imaging with In Situ Hysteresis Measurement

This paper elaborates the sample and sensor preparation procedures and the protocols for using the test rig particularly for dynamic domain imaging with in situ BH measurements in order to achieve optimal domain pattern quality and accurate BH measurements.

最適化されたセットアップおよびヒステリシス測定場の磁区イメージングのためのプロトコル

This paper elaborates the sample preparation protocols required to obtain optimal domain patterns using the Bitter method, focusing on the extra steps ...

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance function result in the same outcome: excess inflammation leads to gliosis, cytotoxicity, and/or formation of a glial scar that collectively exacerbate injury or prevent healthy recovery. With the intent of creating a system to model glial scar formation and study inflammatory processes, we have generated a 3D cell scaffold capable of housing primary cultured glial cells: microglia that regulate the foreign body response and initiate the inflammatory event, astrocytes that respond to form a fibrous scar, and oligodendrocytes that are typically vulnerable to inflammatory injury. The present work provides a detailed step-by-step method for the fabrication, culture, and microscopic characterization of a hyaluronic acid-based 3D hydrogel scaffold with encapsulated rat brain-derived glial cells. Further, protocols for characterization of cell encapsulation and the hydrogel scaffold by confocal immunofluorescence and scanning electron microscopy are demonstrated, as well as the capacity to modify the scaffold with bioactive substrates, with incorporation of a commercial basal lamina mixture to improved cell integration.

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Herein, we present a protocol for the 3D culture of rat brain-derived glia cells, including astrocytes, microglia, and oligodendrocytes. We demonstrate primary cell culture, methacrylated hyaluronic acid (HAMA) hydrogel synthesis, HAMAphoto-polymerization and cell encapsulation, and sample processing for confocal and scanning electron microscopic imaging.

プライマリのグリア細胞の in Vitro Neuroinflammation のモデリングのための三次元ハイドロゲル文化を改善

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

Electric and Magnetic Field Devices for Stimulation of Biological Tissues

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, differentiation, morphology, and molecular synthesis. However, variables such stimuli strength and stimulation times need to be considered when stimulating either cells, tissues or scaffolds. Given that EFs and MFs vary according to cellular response, it remains unclear how to build devices that generate adequate biophysical stimuli to stimulate biological samples. In fact, there is a lack of evidence regarding the calculation and distribution when biophysical stimuli are applied. This protocol is focused on the design and manufacture of devices to generate EFs and MFs and implementation of a computational methodology to predict biophysical stimuli distribution inside and outside of biological samples. The EF device was composed of two parallel stainless-steel electrodes located at the top and bottom of biological cultures. Electrodes were connected to an oscillator to generate voltages (50, 100, 150 and 200 Vp-p) at 60 kHz. The MF device was composed of a coil, which was energized with a transformer to generate a current (1 A) and voltage (6 V) at 60 Hz. A polymethyl methacrylate support was built to locate the biological cultures in the middle of the coil. The computational simulation elucidated the homogeneous distribution of EFs and MFs inside and outside of biological tissues. This computational model is a promising tool that can modify parameters such as voltages, frequencies, tissue morphologies, well plate types, electrodes and coil size to estimate the EFs and MFs to achieve a cellular response.

This protocol describes the step-by-step process to build both electrical and magnetic stimulators used to stimulate biological tissues. The protocol includes a guideline to simulate computationally electric and magnetic fields and manufacture of stimulator devices.

生体組織の刺激のための電界・磁場装置

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, ...