原子間力顕微鏡の自動化は、生物医学の応用に向けた技術の進化における重要な革新である。また、細胞集団の生体力学的特性の調査へのアクセスを開きます。我々の方法は、10個の細胞を測定するのに4時間かかる通常の方法と比較して、4時間で1,000細胞のAFM測定値を記録することを可能にする、これは本当に時間の有意な利益である。
自動化がこの技術を病院の研究室に持ち込むための前提条件であるならば、この概念実証プロトコルは、特定の医療診断戦略の開発に使用する可能性を示唆しています。このプロトコルは、さまざまな微生物を充填することができる汎用性の高いPDMSステムを使用して、異なるシステムを探索することができます。PDMSスタンプを調製するために、PDMs、オリゴマー、及び硬化剤で10~1質量比でPDMS前ポリマー溶液55グラムを混合し、得られた溶液を真空下で1回10倍から10倍のマイナス10~マイナス2本のバーに5~10分間用いった。
すべてのトラップ気泡が取り除かれたら、20グラムの脱気溶液をシリコンマスターモールドに2〜3ミリメートルの厚さに注ぎ、再び脱気します。すべての気泡を取り除いた場合、PDMSを摂氏80度で1時間レキュレートし、メスを使用してPDMSマイクロ構造スタンプを可視のマイクロ構造アレイと平行に切ります。次に、シリコンマスターモールドからスタンプを剥がし、スライドの側面に合わせたマイクロ構造を持つガラススライド上にスタンプマイクロ構造のサイトを置きます。
装置用の細胞を調製するために、目的の細胞懸濁液の600マイクロリットルを遠心分離し、スタンプに上清の200マイクロリットルを加える。真空下で上清を約40分間脱気する。すべての気泡が除去されたら、PDMS表面からの上澄み液を200マイクロリットルの再懸濁液溶液に交換し、室温で15分間インキュベーションします。
スタンプのマイクロ構造にセルをロードするには、30~50度の角度で保持されたガラススライドを使用して、必要に応じてスタンプ全体にセルを数回広げます。微細構造の高い充填率が達成された場合は、ピペットを使用して細胞懸濁液を除去し、洗浄ごとに1ミリリットルの酢酸バッファーで3回洗浄し、トラップされていない細胞を除去します。最後の洗浄後、窒素流を使用してサンプルの背面を乾燥させ、ペトリ皿にスタンプを入れます。
その後、新鮮な酢酸バッファーの2ミリリットルを皿に追加します。原子間力顕微鏡の場合は、原子間力顕微鏡のステージに皿を置き、ステージをゼロからゼロに中央に配置します。ステージが中央に配置されたら、皿を顕微鏡ペトリ皿ホルダーに移動し、ペトリ皿ホルダーのy軸に垂直になるようにスタンプの端を揃えます。
次に、先端がスタンプに衝突するのを避けるために、ステッパーモーターが十分に伸びるように注意して、原子顕微鏡の力をステージに置きます。イメージングでは、顕微鏡ノブを使用して、4.5 x 4.5平方メートルのマイクロメーターウェルの左隅に原子間力顕微鏡先端を中央に配置し、顕微鏡ソフトウェアでフォースマッピングモードを選択します。100×100マイクロメートル面積に対して64 x 64力マップを設定するには、相対設定点を3~5ナノニュートン、Z長を4マイクロメートル、Z移動を一定の持続時間に設定し、延長時間を0.01秒に延長し、延長遅延をゼロにし、引き込み遅延をゼロにし、遅延モードを一定力に設定します。、2048ヘルツへのサンプルレート。
Z 閉じたループをオフにして、正方形の画像をチェックします。高速アクセスを100マイクロメートル、低速軸を100マイクロメートル、Xオフセットをゼロマイクロメートル、Yオフセットをゼロマイクロメートル、グリッド角度をゼロ度、ピクセルを64 x 64、ピクセル比を1対1に設定します。次に、オートメーションソフトウェアを開きます。
ポップアップ ウィンドウで、スクリプト ファイルのパスを選択します。このW1座標は、ギフォンスクリプトの入力ボックスセクションのP1可変線239に、P2変数ライン241にW2座標値を入力する。ピッチ値をスクリプトのピッチ可変行245に帰属させ、ウェル寸法を入力し、ウェルパターンの設計からW-S可変線248に決定することができる。
行251の保存ディレクトリへのパスを書き込み、所望の場所にデータを保存し、合計面積可変行254を100マイクロメートルの複数端に設定する。次に、数値スキャン可変行257にウェルごとに記録された力曲線行列行および列を設定し、実行をクリックしてプログラムを開始する。データを分析するには、ビデオスタジオコードソフトウェアを使用してPythonスクリプトを開き、コピーファイルPythonスクリプトを実行してフォースカーブファイルを1つのフォルダに整理します。
データが格納される一般フォルダへのパスを入力します。力曲線を解析するために、原子間力顕微鏡メーカーのデータ処理ソフトウェアを開きます。ファイルメニューで、分光法曲線のバッチを選択します。
次にファイルと荷重のプロセスを選択し、剛性プロセスを選択します。プロセスの最後のステップを選択し、[維持]をクリックしてすべてのフォースカーブに同じ処理を適用します。Rスクリプトを開くには、データ処理ソフトウェアで抽出された情報を含むファイルをR studioソフトウェアにロードします。
環境ウィンドウで[データセットのインポート]をクリックし、ポップアップウィンドウのテキストリーダーから[参照]をクリックして、ドットTSVファイルを見つけます。ファイルが読み込まれたら、コード実行領域を選択し、all を実行してすべてのコードを実行します。ここで、図示したプロトコルを用いて得られる典型的なヒストグラムが示されている。
この分析では、957のネイティブセルに剛性再パーティション化を記録し、この分析では574カスパポフィン処理細胞の剛性を測定した。数百のセルを使用すると、値のバイモーダル分布が観察されることを知っています。小さいサンプルでは、一般的に単一の分布が観察され、母集団の不均一性の観察の欠如をもたらす可能性があります。
2つの条件を比較すると、細胞の剛性を低下させるカスポフィンの効果が強調されます。天然細胞と処理細胞のANOVA比較によって明らかにされた2つの条件は、非常に、有意に異なる剛性を示す。この値は、多数の分析された細胞のために到達し、得られた結果に対する信頼度が高かった。
上澄み物をPDMSスタンプに加えて、スタンプがいっぱいになるまで細胞をウェルに繰り返しフラッシュする前に、分析の成功に不可欠である。この概念実証では、カンディダ・アルビカンス細胞を分析したが、このプロトコルはパターン細胞、分子、または材料の任意のグループに適用することができる。
