私たちは心からゲル電気泳動のヘルプは博士シンディN.チウに感謝し、DNA及び制限酵素の彼らの寛大な寄付のためのアンディ周とマイケルGrodick。私たちは感謝の機器や材料への寛大なアクセスするための教授J·ヒースと教授D.プローバを認める。私たちは、役立つ提案博士カーンSorasaeneeに感謝。私たちは、ビデオ内の概略図で使用されるイラストを作成するためのメアリーH.唐に感謝。資金は、ジョンソン·エンド·ジョンソンとUSC Y86786によって提供されました。

注：RNAを操作する場合は、DNAとRNAを分解DNaseおよびRNaseを酵素によって汚染を避けるためにクリーンな作業環境を維持する。そのピペットチップとチューブはDNaseおよびRNaseを含まないであることを確認してください。また、除染液でなどピペット、チューブホルダー、などのラボの表面や機器を拭うと便利です。 コロール治療1. RNA転写<ol><li>コロールを準備し、0.01中の化合物阻害剤：[複雑な]の1のモル比：[DNA]。 注：0.43 pmolのDNAは、使用されるDNAテンプレートは、EからLIGA遺伝子とAPET-28Cのベクトルだった：私たちの場合、比率は4.3 fmolのコンプレックスだったT7プロモーターの制御下に大腸菌 。 T7プロモーターを有する他のDNAは、転写アッセイを実行するための有効な候補である。 <ol><li>アクチノマイシンD、きれいな、別個の容器中にジメチルスルホキシド（DMSO）中にトリプトライド、tpfc、およびGa（tpfc）を溶解する。 [cはモル比1：0.01の最終濃度を得るomplex]：ヌクレアーゼフリー水で希釈を使用して、[DNA]。 <ol><li> 1.8ミリリットルのDMSO中に1mgのアクチノマイシンDを溶解する。別の容器に小分けし、10μlのをと1/100希釈を作成するためにヌクレアーゼフリー水で1 mlに希釈する。アリコート1別の容器に希釈μlの1 / 1,000希釈を作成するためにヌクレアーゼフリー水で1mlに希釈する。 NOTE：アクチノマイシンDの最終溶液の濃度は、4.3 fmolである。 </li><li> 0.64ミリリットルのDMSO中1mgトリプトライドを溶解する。別の容器に小分けし1μlの1 / 1,000希釈を作成するためにヌクレアーゼフリー水で1 mlに希釈する。別の容器に分量の希釈を1μlと1 / 1,000秒の希釈を作成するためにヌクレアーゼフリー水で1 mlに希釈する。 注：トリプトリドの最終溶液の濃度は、4.3 fmolである。 </li><li> 2.9ミリリットルDMSO中1mgのtpfcを溶かす。 10μlの別の容器へとヌクレアーゼフリー水で1 mlに希釈するアリコート1/100 Dを作成するilution。アリコート1別の容器に希釈μlの1 / 1,000希釈を作成するためにヌクレアーゼフリー水で1mlに希釈する。 注：tpfcの最終溶液の濃度は、4.3 fmolである。 </li><li> 2.6ミリリットルのDMSO中の1mgのGa（tpfc）を溶解する。別の容器に小分けし、10μlのをと1/100希釈を作成するためにヌクレアーゼフリー水で1 mlに希釈する。アリコート1別の容器に希釈μlの1 / 1,000希釈を作成するためにヌクレアーゼフリー水で1mlに希釈する。 NOTE：ジョージア（tpfc）の最終溶液の濃度は、4.3 fmolである。 注：これらのcorrolesおよび阻害剤は​​水溶性ではなく、DMSOに予め溶解されなければならない。 （1％未満）のDMSO少量の細胞（未発表データ）で細胞毒性を誘導しない。 </li></ol></li></ol></li><li>転写反応を開始する前に、個別に必要な試薬を準備したり、商業ベンダーからそれらを購入する。 <ol><li>すべての凍結氷の上で解凍n個の試薬 ​​は、（凍結試薬のリストについては、表1を参照）。 </li><li>彼らは完全に溶液に溶解するまで混合する10倍反応バッファーと4リボ（ATP、CTP、GTP、およびUTP）ソリューションの時間を許可する。 </li><li>簡単に説明すると、チューブのリム上に材料の損失を防ぐためにすべての試薬を集める。 RTで10倍反応バッファーを維持しながら、一度、氷の上の店のリボヌクレオチドを​​解凍した。 </li><li> RTで転写反応のための試薬 ​​を組み合わせて（試薬のリストについては、表2を参照してください）。 注：反応は氷上ではなく、RTで組み立てられた場合の10倍反応バッファー中スペルミジンは、鋳型DNAの共沈ができる。 </li><li>チューブを軽くはじくか、上下に優しく混合物をピペッティングして完全に混合。混合した後、短時間遠心し、チューブの底に反応混合物を収集する。 </li><li> 2-4時間の合計、37℃で反応混合物をインキュベートする。 注：必要な反応時間は異なりますDNAテンプレートのサイズおよび配列を有する。このステップは、特定の配列の最適化が必要な場合があります。短いテンプレートはトータルRNAの高収率のために長い反応時間を必要とし得る。 </li><li> -20℃で各時間と店舗後の各反応から4μlをを削除します。希望する時点の必要に応じて変更します。 </li></ol></li></ol> 2. RNAスピンカラム<ol><li>転写反応の後、微量互換クロマトグラフィーカラムを使用してRNAを精製する。 注：RNAスピンカラムの使用は、80％以上の回収を超える20塩基結果とRNAを精製する44。 注：カラムクロマトグラフィーは、RNAを精製する一般的かつ便利な方法である。クロロホルム抽出、イソプロパノール沈殿、ならびに他の市販のキット：他の精製方法はまた、塩化リチウム沈殿、フェノールとして存在する。 <ol><li>均等に積極的に反転させることによって、列バッファにデックス行列を再懸濁コラム3回以上。鋭く列をフリックして行います。 </li><li>列からトップキャップを外します。キャップ内のいくらかの残留デックス行列があるでしょう。キャップはマトリックスで満たされている場合には、カラム上にキャップを交換し、マトリックスの大部分が列になるまで、前の手順を繰り返します。 </li><li>塔の底部先端をオフにスナップ。 注：一部の液体をカラムから逃れることがあります。 </li><li>列を詰める。 <ol><li>無菌（RNaseおよびDNaseを無料）を1.5 mlマイクロチューブにカラムを置きます。 </li><li> 1分間千×gで卓上遠心機で遠心操作を行なう。 </li></ol></li><li>カラムから溶出バッファー1.5 mlのマイクロチューブを捨てる。 </li><li>すぐに新しい無菌の1.5ミリリットルのマイクロチューブにカラムを配置し、カラムベッドの中央にサンプルをピペット。列の過負荷を避けるために、サンプルの20〜50μlのを使用してください。 </li><li>千×gで卓上遠心機でチューブを遠心1分間。 注：溶出液は精製されたRNAサンプルである。 </li></ol></li></ol> 3.アガロースゲル電気泳動（1％アガロースゲル）42 注：臭化エチジウムはDNAおよびRNAに結合すると蛍光を発するが、それゆえ、これらの生体分子を0.5μg/ mlのエチジウムブロマイド溶液でそれらをインキュベートすることにより、UV光で可視化することができる。 <ol><li> 10mlの水に5mgの臭化エチジウムを溶解することにより、臭化エチジウム（0.5 mg / ml）での1,000倍のストック溶液を調製する。 </li><li>ゲル電気泳動のためのトリス酢酸EDTA（TAE）ランニングバッファーを準備します。 50X TAE緩衝液を作るために、0.05Mエチレンジアミン四酢酸（EDTA）で2.0 Mトリス - 酢酸を組み合わせて、pHを8.5に調整します。 </li><li> 1 L 1×TAE緩衝液中の10グラム超純アガロースを溶解させ、従来の電子レンジでアガロースを溶融させて1％（重量/容量）アガロースゲルを調製。それは50℃まで冷却した後、1％アガロースゲルソリューに1,000倍の臭化エチジウムを1ml加えるるが、その後、ゲルキャスティングプラットフォームにアガロース溶液を注ぎ、ゲルをRTで固化することができ、軽く旋回によって、または密閉容器内で転倒混和する。 注：エチジウムブロマイドは変異原と潜在的な発がん性物質である。手袋を着用し、慎重にソリューションを扱う。エチジウムブロマイドの適切な取り扱い手順については、以下を参照してください。 <a href="http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667">http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667を</a> 。 </li><li>ゲルが固化した後、電気泳動槽にセットゲルを置く。井戸が水没するまでゲルをカバーするのに十分なTAE緩衝液を追加します。 TAEバッファーのレベルは約1ミリメートルゲルのレベルを超えていることを確認してください。ゲル櫛を削除します。 注：ウェルが水没した後、コームを削除するには、ウェルに捕捉されるのエアポケットを防ぐことができます。 </li><li> RNAサンプルを準備します。 1μlのゲルローディングバッファー（または1μlの10倍のローディングバッファーとdilutとで各々の精製試料アリコート1μlのを組み合わせるヌクレアーゼフリー水で10μlにED）とマイクロピペットでピペッティングによって十分に混合する。 注：10倍のローディングバッファーを20％フィコール400、0.1 MのNa 2 EDTA、pHが8.0、1.0％SDS、0.25％ブロモフェノールブルーが含まれています。それはブロモフェノールブルーと同じ速〜50％が実行され、非常に長いランを監視するために有用であり得るように、0.25％キシレンシアはまた、ローディング緩衝液を添加してもよい。42 </li><li>慎重に各ウェルの底に溶液をピペッティングすることによって、各サンプルでゲルをロードします。気泡を残したり、ウェル間のサンプルを混在しないように注意してください。 注：RNAラダーはまた、転写産物のサイズを決定するために用いることができる。 </li><li> DNAは正極リードに向かってゲル内に移動するように、リード線を取り付けます。ゲルの典型的には、1 V〜10 / cmで、所望のレベルに電圧を設定します。しかし、長いゲルを実行分離の進行をモニターするために、染料の移行を使用して、RNA断片の間の有意な分離のために十分である。 NOTE：150 Vで8センチメートル×8センチゲルは約20分かかりますしながら、250 Vで23センチメートル×25センチゲルは、約1時間かかります。高い電圧で実行したときに小さいRNA断片は、良好な分解能を持っている。 </li><li>ローディングバッファから染料がRNA断片との分離のために十分であると判断距離を移動した際に電源をオフにします。 </li><li>画像臭化エチジウムが蛍光を発するようにUV光の下でRNA。 </li><li>画像の写真を撮ると、各条件から精製されたRNAの蛍光強度を比較する。 </li></ol> UV-Vis分光経由4. RNA定量<ol><li>光度計2000、または類似のマシンで2μlのH 2 Oを配置し、ブランクを測定します。 </li><li>次に、分光光度計で、精製後の各RNAサンプルを2μlを配置し、800nm​​の200nmの波長範囲のUV-Visの測定。 注：1.0のA 260読み取りがRNAの約40μg/ mlに相当し、そして純粋なRNAは、2.1のA 260 / A 280比を有する。45 </li><li>吸光度が1 OD上にある場合には、1未満のODを得るために、ヌクレアーゼフリー水でサンプルを希釈する。 </li><li>様々なサンプルをプロットし、260nmでODを比較するグラフソフトウェアを使用してください。 </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

このアッセイは、ジョージア（tpfc）の添加が知られているDNA結合抗癌剤複合体アクチノマイシンDおよびトリプトライドと同等にRNAの転写を阻害することを実証している。 GA（tpfc）（GI 50 = 58.1から154.7μM）の細胞傷害性挙動は、その抑制的特性によることがあります。ない転写抑制がtpfc観察されなかったので、tpfcの細胞毒性は、RNA転写阻害によるものではないが、まだ研究されてい?...

化学療法は、しばしば、望ましくない副作用、限られた標的を有する広いスペクトルの細胞毒性剤を含む、まだ癌生物学の理解と、より高い癌ターゲティングの有効性および副作用の少ない抗癌剤のためのこれまでの需要が高まっている。1ヒトの癌細胞が頻繁になって生存のための単一の活性化または過剰発現され、癌遺伝子に依存しているので2、多くの抗癌剤は、RNAの転写を阻害するそれらの能力により評価される。癌細胞を排除するのに有効であり、細胞死につながるこれらの形質転換遺伝子の発現を阻止する治療法。3形質転換された細胞は、正常細胞に対応しているよりも、RNA転写の混乱に対してより敏感である。転写を阻害する4抗がん薬を選択的に阻害することが期待されている癌細胞が生存するために必要な癌遺伝子の発現。5したがって、RNA転写のinhibitionは、潜在的な抗がん薬候補を同定し、その作用機序についての詳細を学ぶために便利な方法です。このプロトコルは、GA（tpfc）は化学療法薬アクチノマイシンDとトライドと同じ程度のRNA転写を阻害することを実証している。同様の比較は、他の抗癌薬物候補をこのプロトコルを使用して作製することができる。アクチノマイシンDは、一般的に妊娠性絨毛癌、精巣癌、ウィルムス腫瘍、rhabdomyosacomaを治療するために使用されるRNA転写阻害剤であり、ユーイング肉腫6。アクチノマイシンDは、それが最初に1964.TriptolideにFDAによって承認されてからほぼ50年間の癌治療に使用されてきた30年間、インビトロおよび種々の腫瘍を有する動物モデルで研究されている選択的な転写阻害剤である。7 corrolesの両親媒性大環状性質は、そのような小分子または生物のような他の薬剤クラスに対して重要な利点を与えるsの8-14大環状文字は、このような大きな分子に期待されるよりも大きい細胞透過性を可能にし、それらは、タンパク質のもののような巨大分子表面と相互作用するのに十分な大きさである。8 Corroles生体分子との緊密な非共有結合複合体を形成することが知られているおよび薬物。コロールフレームワーク固有の細胞毒性に加えて、10は、スルホン化コロール、化学療法剤のための担体分子、特にDNAインターカレーアントラサイクリンドキソルビシンとして作用することを実証した。スルホン化コロールドキソルビシンと同時投与したとき、ドキソルビシンのIC 50の3倍の増強は、DU-145細胞で観察された。9コロールフレームワークは、安定であり、官能化され、固有の吸光度および蛍光特性を有し、固有の吸光度のシフトを受けるその特徴付けのために使用することができる。足場の10官能化は、本質的にaffecないコロールの光物理的特性トン、9-15しかし、スルホン化コロールで見られるように、選択的にコロールの枠組みの修正は、実質的にその生物学的特性を変更することができます。16我々は以前7ヒト癌細胞株に対して6 metallocorrolesを評価した。結果は、ヒト癌細胞に対する毒性が特定の金属イオン、ならびに官能基の置換に依存していることを示している。例えば、スルホン化ガリウムcorrolesが高い細胞取り込みを経験し、脳の転移性前立腺癌細胞（DU-145）の核に選択的に浸透し、それは他の細胞株の核内に侵入しないものの同じコロール、乳癌（MDA-MB-231）、黒色腫（SK-MEL-28）、および卵巣（OVCAR-3）のためのより大きな細胞毒性を示すよりも、癌細胞前立腺癌9 初期の細胞ベースのアッセイは、これらの化合物は、抗癌治療薬、フュルトメリットとして有望であることを示している作用機序にER調査。転写阻害は、特定の有機金属錯体17-27で観察し、我々はコロール家族の細胞傷害行動のための可能なメカニズムとして、このプロセスを検討することが求められている。この転写アッセイは、生細胞におけるこれらの分子の影響についての詳細な情報につながる転写阻害を、評価するための、簡単で安価な、そして容易な方法を提供する。 ここでは、ガリウムの転写阻害（III）5,10,15-（トリス）pentafluorophenylcorrole（GA（tpfc））とその遊離塩基アナログ5,10,15-（トリス）pentafluorophenylcorrole（tpfc）（ 図1）がテストされます。いくつかの遷移金属錯体とは異なり、ガリウム（III）、酸化還元に不活性であり、したがって、直接酸化還元系の代謝経路のレドックスプロセスに関与しない。28かかわらず、ガリウム（III）の細胞傷害性特性を示さず、治療目的のために検討されている。ガリウムは、プラチナの後に抗癌治療のための第二の最も有望な金属であり、多くの研究や調査を受けている。硝酸塩及び塩化ガリウム塩が肝癌、リンパ腫、膀胱癌、および他の疾患に対する臨床試験で評価されている。29-34ガリウム（III）、したがって抗がんコロール研究のための理想的です。初期データとして、Ga（tpfc）とtpfcは、様々な癌細胞株（ 図2参照）と、低GI 50、最大細胞増殖の50％を阻害するのに必要な薬物濃度を有し示す。これは、それらの抑制性の特性を決定するためにこれら2つの化合物に関するさらなる実験の正当性を肯定。私たちは、一般的な抗がん剤アクチノマイシンDとトライドとのこれらの化合物を比較する。アクチノマイシンDインターカレーDNAは、RNA伸長を阻害し、ピコモル濃度で、特定の細胞株においてアポトーシスを誘導する6,35-37トリプトライドは、腫瘍増殖を阻害することが示されている。人間XPB / ERCC3、サブoを特異的に結合するfの転写因子TFIIH、RNAポリメラーゼII活性の阻害につながる。6-7,38-40 それは一般的にcorrolesが細胞毒性を示すことが知られているが、機能化から生じる異なる機序についてはほとんど情報が存在する。 RNA転写のコロール阻害が生体高分子との相互作用に大きな洞察を提供するであろう。そのような二ロジウム（II、II）としてDNAに結合することが知られている他の複合体、複合体、クロム（III）錯体、ルテニウム（II）ポリピリジル錯体、ロジウム（III）錯体、および様々な他のものは、RNA転写アッセイに供した18-生体高分子との相互作用の理解になり27。この容易で広く利用可能な実験はまた、所定の分子の細胞毒性特性を評価し、それのメ​​リット、さらに生物学的試験かどうかを判断するには良い初期テストです。 RNAの転写アッセイはまた、varyinなどの多くの修正、を可能にするG化合物または使用される酵素の量は、インキュベーション時間は、反応時間とサンプル時点を変える。したがって、潜在的に大量のデータを提供し、興味のある他の変数の中で、DNA鋳型の長さおよび配列を変化させる。コンポーネントが購入し、個別に調製することができるが、この転写アッセイもまた提供されるすべての必要な反応成分と手頃なキットとして容易に入手可能である。これらの実験では、高い収率を有することが知られている市販のキットを使用して図41 アガロースゲル電気泳動およびUV-Vis分光：転写阻害を評価するために、我々は2つ​​の方法を使用しています。アガロースゲル電気泳動は、25 kbのDNA及びRNA断片に分離同定、および精製0.5-ための簡単で有効な方法である。42 UV-Vis分光法は、RNAの濃度および純度を決定するために用いることができる。43

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="809">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:219px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Actinomycin D</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A1410</td>
			<td>Store at 2-8 &#176;C , protect from light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triptolide</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T3652</td>
			<td>Store at 2-8 &#176;C , protect from light</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">nuclease-free H2O&#160;</td>
			<td style="width:219px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM9938</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEGAscript T7 Transcription Kit</td>
			<td style="width:219px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM1334</td>
			<td>Store at &#8211;20 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Ethidium Bromide</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E7637</td>
			<td>CAUTION: For proper handling procedures of ethidium bromide, please see: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Tris Acetate</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T6025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">EDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">UltraPure Agarose</td>
			<td style="width:219px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">16500-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">mini Quick Spin RNA Columns</td>
			<td style="width:219px;">Roche Life Science</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11814427001</td>
			<td>Store at 2-8 &#176;C , do not freeze</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">1 kb DNA Ladder</td>
			<td style="width:219px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">N3232S</td>
			<td>Store at &#8211;20 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro enzymatic assay to measure transcription inhibition by gallium(iii) and h3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

化学療法は、しばしば、多くの副作用、限られた標的で広域スペクトルの細胞傷害性薬剤を含む。 Corrolesは、キレート化金属と官能基のアイデンティティーに応じて、特定の細胞株における差動細胞増殖抑制及び細胞毒性特性を示すテトラピロール大環状化合物のクラスである。特定の細胞株に向かって官能化corrolesのユニークな挙動は、標的化学療法の可能性を紹介します。 多くの抗癌剤は、RNAの転写を阻害するそれらの能力により評価される。ここでは、既知および潜在的な阻害剤の存在下で、RNA転写のためのステップバイステップのプロトコルを提示する。ゲル電気泳動およびUV-Vis分光法による転写反応のRNA産物の評価は、それらの作用機序についての複数のアッセイの改変を用いて、潜在的な抗癌剤候補の防錆特性に関する情報を提供し、。 リトルコロール細胞毒性の作用の分子メカニズムについて知られている。ガリウム（III）5,10,15-（トリス）pentafluorophenylcorrole（GA（tpfc））と遊離塩基アナログ5,10,15-（トリス）pentafluorophenylcorrole（tpfc）：この実験では、我々は2つ​​のコロールの化合物を考える。 RNA転写アッセイcorrolesの防錆特性を調べた。五転写反応を調製した：アクチノマイシンD、トリプトリドで処理したDNA、ジョージア（tpfc）、[錯体]でtpfcを[テンプレートDNAベース]は、それぞれ0.01の比率、および未処理の対照。 転写反応は、アガロースゲル電気泳動およびUV-Vis分光法を使用して4時間後に分析した。 GA（tpfc）、アクチノマイシンD、およびトライドによる明確な阻害があります。 このRNA転写アッセイは、抗癌複合体、DNA、またはポリメラーゼ酵素の濃度を変えることによって、または攻殻有するDNAまたはポリメラーゼをインキュベートすることにより、より機械的な詳細を提供するために修飾することができる前のRNA転写にXES。これらの変更は、DNAや酵素が関与する阻害機構との間を区別します。 RNAの転写複合体が劣化しているかどうかをテストまたはRNAを加水分解するために使用することができた後、複合体を加える。このアッセイはまた、付加的な抗癌剤候補を研究するために使用することができる。

アガロースゲル電気泳動によるRNA転写定性的に評価 アガロースゲル電気泳動は、画像に転写されたRNAが用いられる。エチジウムブロマイドは、RNAの46許可イメージング（λEMは 605ナノメートル、λEX = 210nmで、285 nmの=）を結合した際に蛍光を発する。ゲル中の暗いバンドは、RNAのより高い濃度に対応する。アクチノマイシンDは、トリ?...

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An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by GalliumIII and H3 5,10,15-trispentafluorophenylcorroles

ガリウム（III）5,10,15-（トリス）pentafluorophenylcorroleとその遊離塩基類似体は、低マイクロモル細胞の細胞毒性を示す。この原稿はcorrolesによる転写阻害を評価するために、UV-Vis分光法によるRNA転写反応、臭化エチジウム染色ゲルを有するイメージングRNA、および定量RNAを説明し、抗癌剤候補の特性を評価する簡単な方法を示す。

アン<em&gt;インビトロ</em&gt;酵素アッセイは、ガリウム（III）とHによる転写阻害を測定する<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15トリス（ペンタフルオロフェニル）corroles

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic ...

an-vitro-enzymatic-assay-to-measure-transcription-inhibition

Research

JoVE Journal

Bioengineering

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

11.5K ビュー.  California Institute of Technology. ガリウム（III）5,10,15-（トリス）pentafluorophenylcorroleとその遊離塩基類似体は、低マイクロモル細胞の細胞毒性を示す。この原稿はcorrolesによる転写阻害を評価するために、UV-Vis分光法によるRNA転写反応、臭化エチジウム染色ゲルを有するイメージングRNA、および定量RNAを説明し、抗癌剤候補の特性を評価する簡単な方法を示す。 

ビデオ: An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by GalliumIII and H3 5,10,15-trispentafluorophenylcorroles

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and other matrix-modifying oxidants/enzymes released during inflammation) are implicated in triggering pathological changes in cellular function, phenotype and viability in a number of diseases. Here, we describe how cell-substrate impedance and live cell imaging approaches can be readily employed to accurately quantify real-time changes in cell adhesion and de-adhesion induced by matrix modification (using endothelial cells and myeloperoxidase as a pathophysiological matrix-modifying stimulus) with high temporal resolution and in a non-invasive manner. The xCELLigence cell-substrate impedance system continuously quantifies the area of cell-matrix adhesion by measuring the electrical impedance at the cell-substrate interface in cells grown on gold microelectrode arrays. Image analysis of time-lapse differential interference contrast movies quantifies changes in the projected area of individual cells over time, representing changes in the area of cell-matrix contact. Both techniques accurately quantify rapid changes to cellular adhesion and de-adhesion processes. Cell-substrate impedance on microelectrode biosensor arrays provides a platform for robust, high-throughput measurements. Live cell imaging analyses provide additional detail regarding the nature and dynamics of the morphological changes quantified by cell-substrate impedance measurements. These complementary approaches provide valuable new insights into how myeloperoxidase-catalyzed oxidative modification of subcellular extracellular matrix components triggers rapid changes in cell adhesion, morphology and signaling in endothelial cells. These approaches are also applicable for studying cellular adhesion dynamics in response to other matrix-modifying stimuli and in related adherent cells (e.g., epithelial cells).

Here, we present a protocol to continuously quantify cell adhesion and de-adhesion processes with high temporal resolution in a non-invasive manner by cell-substrate impedance and live cell imaging analyses. These approaches reveal the dynamics of cell adhesion/de-adhesion processes triggered by matrix modification and their temporal relationship to adhesion-dependent signaling events.

マトリックス修飾により誘導される細胞接着及び脱接着におけるリアルタイムの変化を測定するために、細胞 - 基質インピーダンスと生細胞イメージングを使用して、

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

生物工学

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

再構成ヒト角膜上皮様（RHCE）組織モデルを使用して眼刺激性化学物質の有害性の同定のための眼刺激性試験（EIT）

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Development of an In Vitro Ocular Platform to Test Contact Lenses

Currently, in vitro evaluations of contact lenses (CLs) for drug delivery are typically performed in large volume vials,1-6 which fail to mimic physiological tear volumes.7 The traditional model also lacks the natural tear flow component and the blinking reflex, both of which are defining factors of the ocular environment. The development of a novel model is described in this study, which consists of a unique 2-piece design, eyeball and eyelid piece, capable of mimicking physiological tear volume. The models are created from 3-D printed molds (Polytetrafluoroethylene or Teflon molds), which can be used to generate eye models from various polymers, such as polydimethylsiloxane (PDMS) and agar. Further modifications to the eye pieces, such as the integration of an explanted human or animal cornea or human corneal construct, will permit for more complex in vitro ocular studies. A commercial microfluidic syringe pump is integrated with the platform to emulate physiological tear secretion. Air exposure and mechanical wear are achieved using two mechanical actuators, of which one moves the eyelid piece laterally, and the other moves the eyeballeyepiece circularly. The model has been used to evaluate CLs for drug delivery and deposition of tear components on CLs.

Development of an In Vitro Ocular Platform to Test Contact Lenses

Current in vitro models for evaluating contact lenses (CLs) and other eye-related applications are severely limited. The presented ocular platform simulates physiological tear flow, tear volume, air exposure and mechanical wear. This system is highly versatile and can be applied to various in vitro analyses with CLs.

開発<em&gt;インビトロ</em&gt;眼プラットフォームはコンタクトレンズをテストします

Currently, in vitro evaluations of contact lenses (CLs) for drug delivery are typically performed in large volume vials,1-6 which fail to mimic ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and dampen loads in the spine. The IVD consists of a proteoglycan-rich nucleus pulposus (NP) and a collagen-rich annulus fibrosis (AF) sandwiched by cartilaginous end-plates. Together with the adjacent vertebrae, the vertebrae-IVD structure forms a functional spine unit (FSU). These microstructures contain unique cell types as well as unique extracellular matrices. Whole organ culture of the FSU preserves the native extracellular matrix, cell differentiation phenotypes, and cellular-matrix interactions. Thus, organ culture techniques are particularly useful for investigating the complex biological mechanisms of the IVD. Here, we describe a high-throughput approach for culturing whole lumbar mouse FSUs that provides an ideal platform for studying disease mechanisms and therapies for the IVD. Furthermore, we describe several applications that utilize this organ culture method to conduct further studies including contrast-enhanced microCT imaging and three-dimensional high-resolution finite element modeling of the IVD.

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Whole organ culture of the intervertebral disc (IVD) preserves the native extracellular matrix, cell phenotypes, and cellular-matrix interactions. Here we describe an IVD culture system using mouse lumbar and caudal IVDs in their functional spinal units and several applications utilizing this system.

アン<em&gt;インビトロ</emマウス椎間板の&gt;器官培養モデル

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver engineering, including in vivo organ decellularization followed by repopulation, has emerged as a promising approach over ex vivo liver engineering. However, postoperative survival was not achieved. The aim of this study is to develop a novel surgical technique of in vivo selective liver lobe perfusion in rats as a prerequisite for in vivo liver engineering. We generate a circuit bypass only through the left lateral lobe. Then, the left lateral lobe is perfused with heparinized saline. The experiment is performed with 4 groups (n = 3 rats per group) based on different perfusion times of 20 min, 2 h, 3 h, and 4 h. Survival, as well as the macroscopically visible change of color and the histologically determined absence of blood cells in the portal triad and the sinusoids, is taken as an indicator for a successful model establishment. After selective perfusion of the left lateral lobe, we observe that the left lateral lobe, indeed, turned from red to faint yellow. In a histological assessment, no blood cells are visible in the branch of the portal vein, the central vein, and the sinusoids. The left lateral lobe turns red after reopening the blocked vessels. 12/12 rats survived the procedure for more than one week. We are the first to report a surgical model for in vivo single liver lobe perfusion with a long survival period of more than one week. In contrast to the previously published report, the most important advantage of the technique presented here is that perfusion of 70% of the liver is maintained throughout the whole procedure. The establishment of this technique provides a foundation for in vivo partial liver engineering in rats, including decellularization and recellularization.

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

We establish a novel surgical technique for an in vivo single liver lobe perfusion model in rat as a prerequisite for further studying in vivo partial liver engineering in the future.

ラットでの肝部分工学生体内での基盤として新しい手術手技

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene expression regulation are commonly disrupted in many diseases, a locus-specific, endogenous, and reversible method to study and control these mechanisms of action has been lacking. To address this issue, we have developed and characterized novel gene-regulating bifunctional molecules. One component of the bifunctional molecule binds to a DNA-protein anchor so that it will be recruited to an allele-specific locus. The other component engages endogenous cellular chromatin-modifying machinery, recruiting these proteins to a gene of interest. These small molecules, called chemical epigenetic modifiers (CEMs), are capable of controlling gene expression and the chromatin environment in a dose-dependent and reversible manner. Here, we detail a CEM approach and its application to decrease gene expression and histone tail acetylation at a Green Fluorescent Protein (GFP) reporter located at the Oct4 locus in mouse embryonic stem cells (mESCs). We characterize the lead CEM (CEM23) using fluorescent microscopy, flow cytometry, and chromatin immunoprecipitation (ChIP), followed by a quantitative polymerase chain reaction (qPCR). While the power of this system is demonstrated at the Oct4 locus, conceptually, the CEM technology is modular and can be applied in other cell types and at other genomic loci.

Regulation of the chromatin environment is an essential process required for proper gene expression. Here, we describe a method for controlling gene expression through the recruitment of chromatin-modifying machinery in a gene-specific and reversible manner.

化学のエピジェネティックな修飾剤の細胞機械装置をリダイレクトすることによって遺伝子の転写を抑制

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.

ナノ製剤中のエンドトキシン検出カブトガニ リムラス ライセート (ラル) 試金を使用して

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and introduces uncertainty in results due to variability between scorers. To remedy this, automated slide-scanning microscopy as well as conventional flow cytometry methods have been introduced in an attempt to remove scorer bias and improve throughput. However, these methods have their own inherent limitations such as inability to visualize the cytoplasm of the cell and the lack of visual MN verification or image data storage with flow cytometry. Multispectral Imaging Flow Cytometry (MIFC) has the potential to overcome these limitations. MIFC combines the high resolution fluorescent imagery of microscopy with the statistical robustness and speed of conventional flow cytometry. In addition, all collected imagery can be stored in dose-specific files. This paper describes the protocol developed to perform a fully automated version of the MN assay on MIFC. Human lymphoblastoid TK6 cells were enlarged using a hypotonic solution (75 mM KCl), fixed with 4% formalin and the nuclear content was stained with Hoechst 33342. All samples were run in suspension on the MIFC, permitting acquisition of high resolution images of all key events required for the assay (e.g. binucleated cells with and without MN as well as mononucleated and polynucleated cells). Images were automatically identified, categorized and enumerated in the MIFC data analysis software, allowing for automated scoring of both cytotoxicity and genotoxicity. Results demonstrate that using MIFC to perform the in vitro MN assay allows statistically significant increases in MN frequency to be detected at several different levels of cytotoxicity when compared to solvent controls following exposure of TK6 cells to Mitomycin C and Colchicine, and that no significant increases in MN frequency are observed following exposure to Mannitol.

The in vitro micronucleus assay is a well-established method for evaluating genotoxicity and cytotoxicity but scoring the assay using manual microscopy is laborious and suffers from subjectivity and inter-scorer variability. This paper describes the protocol developed to perform a fully automated version of the assay using multispectral imaging flow cytometry.

マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーを用いてインビトロ微小核アッセイを行う自動化方法

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and ...

Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro

Pre-clinical drug research of vascular diseases requires in vitro models of vasculature that are amendable to high-throughput screening. However, current in vitro screening models that have sufficient throughput only have limited physiological relevance, which hinders the translation of findings from in vitro to in vivo. On the other hand, microfluidic cell culture platforms have shown unparalleled physiological relevancy in vitro, but often lack the required throughput, scalability and standardization. We demonstrate a robust platform to study angiogenesis of endothelial cells derived from human induced pluripotent stem cells (iPSC-ECs) in a physiological relevant cellular microenvironment, including perfusion and gradients. The iPSC-ECs are cultured as 40 perfused 3D microvessels against a patterned collagen-1 scaffold. Upon the application of a gradient of angiogenic factors, important hallmarks of angiogenesis can be studied, including the differentiation into tip- and stalk cell and the formation of perfusable lumen. Perfusion with fluorescent tracer dyes enables the study of permeability during and after anastomosis of the angiogenic sprouts. In conclusion, this method shows the feasibility of iPSC-derived ECs in a standardized and scalable 3D angiogenic assay that combines physiological relevant culture conditions in a platform that has the required robustness and scalability to be integrated within the drug screening infrastructure.

This method describes the culture of iPSC-derived endothelial cells as 40 perfused 3D microvessels in a standardized microfluidic platform. This platform enables the study of gradient-driven angiogenic sprouting in 3D, including anastomosis and stabilization of the angiogenic sprouts in a scalable and high-throughput manner.

iPSC由来内皮細胞の浸透した3D血管新生発芽をインビトロで研究するための標準化およびスケーラブルなアッセイ

Pre-clinical drug research of vascular diseases requires in vitro models of vasculature that are amendable to high-throughput screening. However, current ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of robust, predictive in vitro test systems is essential. Hepatic toxicology is key when considering ENM exposure, as the liver serves a vital role in metabolic homeostasis and detoxification as well as being a major site of ENM accumulation post exposure. Based upon this and the accepted understanding that 2D hepatocyte models do not accurately mimic the complexities of intricate multi-cellular interactions and metabolic activity observed in vivo, there is a greater focus on the development of physiologically relevant 3D liver models tailored for ENM hazard assessment purposes in vitro. In line with the principles of the 3Rs to replace, reduce and refine animal experimentation, a 3D HepG2 cell-line based liver model has been developed, which is a user friendly, cost effective system that can support both extended and repeated ENM exposure regimes (&#8804;14 days). These spheroid models (&#8805;500 &#181;m in diameter) retain their proliferative capacity (i.e., dividing cell models) allowing them to be coupled with the &#8216;gold standard&#8217; micronucleus assay to effectively assess genotoxicity in vitro. Their ability to report on a range of toxicological endpoints (e.g., liver function, (pro-)inflammatory response, cytotoxicity and genotoxicity) has been characterized using several ENMs across both acute (24 h) and long-term (120 h) exposure regimes. This 3D in vitro hepatic model has the capacity to be utilized for evaluating more realistic ENM exposures, thereby providing a future in vitro approach to better support ENM hazard assessment in a routine and easily accessible manner.

This procedure was established to be used for developing advanced 3D hepatic cultures in vitro, which can provide a more physiologically relevant assessment of the genotoxic hazards associated with nanomaterial exposures over both an acute or long-term, repeated dose regimes.

長期ナノ材料暴露後のインビトロ遺伝子毒性試験のための高度な3D肝モデル

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...