メリーランド大学Greenebaumがんセンターのトランスレーショナル基盤施設、特に博士の技術支援および計測。レナLapidusはとMariola Sadowskaは、深く感謝している。このアッセイの開発を担当して作業がAHA費補助金GRNT2130014、APへのVA優秀賞、およびマレーネ·スチュワートに提供メリーランド大学のタバコ反発基金（CRF）により、NIH RO1CA108846によって部分的に資金を供給されたGreenebaumがんセンター。

いくつかのステップは、前もって実行され、いくつかの試薬は、処置の前に調製され、記憶される：（1）細胞培養およびタンパク質の単離、（2）オリゴヌクレオチドの調製、（3）96ウェルプレートを調製する、（4）核抽出物インキュベーション一晩。手順が原因DNAオリゴヌクレオチドとの核タンパク質の一晩のインキュベーションの2日間を必要とします。 1。バッファーの調製 1.1核タンパク質の分離<ol><li>低張緩衝液：98.3ミリリットルのH 2 Oに1ミリリットル（1 M HEPES、pHは7.9）、150μL（1 M MgCl 2）中 、333μL（3 MのKCl）を追加し、低張緩衝液100mlを調製するために最終濃度：10mMのHEPES、1.5mMのMgCl 2、10mMのKCl。低張性緩​​衝液+ NP40（ステップ2.11で使用するため）の場合：9.5ミリリットルに、最終的な0.5％NP40のための低張性緩衝液を0.5ミリリットル（10％NP40）を追加します。 </li><li>低塩緩衝液：（ステップ2.15で使用するための）低塩緩衝液100mlを調製するには、1ミリリットル（1 M HEPES、pHは7.9）、25メートルを追加Lグリセロール、73ミリリットルのH 2 Oに150μL（1 M MgCl 2）中、666μL（3 MのKCl）、40μL（0.5M EDTA）最終濃度：10mMのHEPES、25％グリセロール、1.5mMのMgCl 2を 、20のKCl、0.2mMのEDTA。 </li><li>高塩緩衝液：（ステップ2.15で使用するための）高塩緩衝液100mlを調製するには、1ミリリットル（1 M HEPES、pHは7.9）、25ミリリットルのグリセロール、150μL（1 M MgCl 2）中 、26.7ミリリットルを追加します（3男塩化カリウム）、47ミリリットルのH 2 Oに40μL（0.5M EDTA）最終濃度：10mMのHEPES、25％グリセロール、1.5のMgCl 2、800のKCl、0.2mMのEDTA。 </li><li> 10パーセントNP40洗剤：10ミリリットルNP40 90ミリリットルのH 2 O </li><li>プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤[低張緩衝液に加え+ NP40（ステップ2.11）、低塩緩衝液（ステップ2.15）に、高塩緩衝液に（ステップ2.15）使用直前]：2.5μL（1 M DTT）を追加し、50 0.5mMのDTTおよび1×プロテアーゼ阻害剤の最終濃度は、各緩衝液5mlにプロテアーゼ阻害剤（100倍）を含有した。プロテアーゼ阻害100Xストック混合物が含まれています：フッ化ナトリウム（セリン/スレオニン、酸性ホスファターゼ）、オルトバナジウム酸ナトリウム（Tyrを、アルカリホスファターゼ）、β-グリセロリン酸（セリン/スレオニンホスファターゼ）、ピロリン酸ナトリウム（セリン/スレオニンホスファターゼ）、アプロチニン（セリンプロテアーゼ）、ベスタチン（アミノペプチダーゼ）、E64（システインプロテアーゼ）、ロイペプチン（SER /システインプロテアーゼ）、EDTA（メタロプロテアーゼ）。 </li></ol> 1.2アッセイプレートの調製を<ol><li>プレート定着液：500mlの溶液を調製した500mlのH 2 Oに5.25グラムの炭酸ナトリウムを追加し、よく混合し、0.1 Mの炭酸ナトリウムを最終濃度9.7にpHを調整する。 </li><li>ソリューション遮光板：株価ポリのdI / DCオリゴヌクレオチドを​​調製するためには、pHが7.9を50μgの/のストック濃度は1 mMのEDTAを含む、10mMトリス/ HClを1ミリリットル中のポリのdI / DCの1号機（〜50 mg）を再懸濁μL。ストックは/μlの使用前に1μgのに希釈する。 </li></ol> 1.3洗浄バッファー、抗体希釈液 NOTE：ストレプト洗浄緩衝液である<html>添加の間に、プレートを洗浄し、一次および二次抗体を希釈する。 <ol><li>ストレプトアビジンを洗浄緩衝液1 Lを調製し、2.4グラムトリス/ HCl、37.5ミリリットル（4 M NaCl）を10mlの（10％BSA）を5ml（10％Tween-20）で、1 Lミリポア濾過滅菌水を追加、pHは7.18。 4℃で保存する最終濃度：20mMのトリス/ HCl、150mMのNaCl、0.1％BSA、0.05％のTween-20。 </li></ol> 1.4 DNA結合バッファー注：このバッファは、-20℃で保存する<ol><li> DNA結合緩衝液15ミリリットルを準備するために、180μL（1 M HEPES、pHは7.9）、300μL（3 MのKCl）、12μL（0.5M EDTA、pH8.0）を、7.5μL（1 M DTT）、3.0ミリリットルを追加蒸留/脱イオンH 2 O（12ml）で希釈した（60％グリセロール）を300μl（50μgの/μlのポリのdI / dCを）。最終濃度：12のHEPES / PH 7.9、60のKCl、0.4mMのEDTA、0.5mMのDTT、12％グリセロール、1μgの/μLポリのdI / DC。 </li></ol> 2。細胞培養および核タンパク質の単離T &quot;&gt;注：準備は約3時間を必要とする細胞の刺激は、実験に依存し、各実験のために使用される細胞の数は変化し、すべてのボリュームが3×10 7細胞/ポイントを使用して典型的な実験を反映し対応するためにボリュームを調整してください。。。実際に、実験6において使用される細胞数。 <ol><li> DNA結合アッセイ、適切な培地中で6 RUNX2（内皮、骨肉腫、乳癌細胞）を発現する培養ヒト細胞について核タンパク質を調製した。 </li><li> G2 / M細胞周期境界6で細胞を停止させるためにノコダゾール（16時間0.2μg/ ml）をしてフルエント細胞を処理。これらの条件下で、RUNX2タンパク質を安定化し、最大結合DNAが達成される。このように、十分な核タンパク質は、同じ製剤から比較することができ、複数のアッセイおよび阻害剤の使用可能です。 </li><li>各ステップについては、4℃に遠心分離を予め冷却して緩衝液を調製し、細胞採取前に4℃で20分間冷やす。</li><li>チル細胞（4℃）し、氷上で行動手順。 </li><li> 15mlのポリプロピレン丸底チューブ内で5分間1,000 rpmで遠心分離細胞。 </li><li>氷冷PBSで洗浄1X（Ca 2 +およびMg 2 +を含まない）。 </li><li>再び遠心分離し、PBS上清を捨てる。 </li><li>完全に細胞ペレットを再懸濁するように注意しながら、プロテアーゼ阻害剤なしで低張緩衝液500μlを追加します。 </li><li> 1.5ミリリットルエッペンドルフチュー​​ブにコンテンツを転送します。 </li><li>すぐに5.5分間5,500 rpmで遠心、上清を捨て、細胞ペレットをキープ。 </li><li> 0.5％NP40を含む低張緩衝液500μl中で細胞ペレットを再懸濁します。プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤および0.5mMのDTTを（ステップ1.1.5に記載のように）入れる。 </li><li>サンプルは30分間氷上で休むことができます。 </li><li> 10分間13,000 rpmで遠心分離する。 </li><li>上清（細胞質ゾルのタンパク質を含む）を廃棄します。 </li><li> 60μlの低SALの各々における核ペレットを再懸濁120μLの合計（プロテアーゼ阻害剤および0.5mMのDTT、手順1.1.5から追加されたため）、Tバッファと高塩緩衝液（プロテアーゼ阻害剤および0.5mMのDTT、手順1.1.5から追加されたため）。最初にペレットを再懸濁し、低塩緩衝液60μl加え、次いで、高塩緩衝液60μlを加える。再懸濁を支援するために、ペレットをボルテックスする。 </li></ol>注：この手順は、核膜タンパク質のいくつかを取り除くのに役立ちますし、溶解工程のために設定：低塩一（ペレットを再懸濁し、ボルテックス）、次いで、高塩（渦）は、この手順を最適化します。最初の10分後にボルテックスしながら、30分間氷上で抽出しておいてください。 <ol start="16"><li> 15分間12,000 rpmで遠心する。核タンパク質を含む上清を保つ。 </li><li>タンパク質濃度を測定します（2-5 mg / mlのでサンプルを維持しようとする）、-80℃で適切な量（10μL/管）や店舗での分量</li></ol>注：推定収量：30×10 6セル画LSは、120μlの5μgの/μLタンパク質が得られます。 5×10 6個の細胞を40μlに2.2μgの/μLタンパク質が得られます。 3。二本鎖オリゴヌクレオチドの調製<ol><li>両端の互換性のハーフサイトに相補的なオリゴヌクレオチドを​​設計します。 RUNX2のために、これらは、以下のとおりです。5&#39;-CGTATT AACCACA ATACTCGCGTATT AACCACA ATACTCGCGTATT AACCACA ATAC TCG-3&#39;-ビオチン（センス）および5&#39;CGAGTAT TGTGGTT AATACGCGAGTAT TGTGGTT AATACGCGAGTAT T GTGGTT AATACG-3&#39;-ビオチン（アンチセンス）。 </li></ol>注：3 RUNX2結合部位およびシングルエンドビオチン標識は、最も再現性のある結果が得られたと判断したパイロット実験。 <ol start="2"><li> 5Xアニーリング緩衝液を準備します。260μlのH 2 O（最終600μL）に300μL（1 Mトリス塩酸、pH 7.6）、30μL（1 M MgCl 2）中 、10μL（1 M DTT）を追加します。 </li><li>各一本鎖oligの200ピコモルへonucleotide（3μL）、60μL（200 pmol/60μL）、合計5倍アニーリング緩衝液12μlの45μlのH 2 Oを加える。 </li><li>加熱ブロック内の5〜10分間95℃で加熱する。 </li><li>加熱ブロックの電源をオフに（または65℃の水50ml中に配置することにより、徐々に室温に冷却し、ゆっくりと65°C（65°Cまで温度を設定することによって、それが15分を要する）、その後に冷却氷上のビーカー中の、これは15〜20分かかります）。 </li></ol> 4。 96ウェルプレートの調製注：洗浄バッファに乳タンパク質を使用しないでください。 <ol><li>定着液（0.1M炭酸ナトリウム）でプレートを修正：300μL/ウェルを追加。 </li><li>室温（RT）で揺れていない場合、または4°C（O / N）で揺動させ、2時間インキュベートする。 </li><li>ストレプトアビジン洗浄バッファー（WB）でプレート3回洗浄：300μL/ウェルのたびに追加します。 </li><li> W 2時間、ビオチン標識二本鎖オリゴヌクレオチド（ヌクレオチドあたり3コンセンサス結合部位）を追加ITH（1.25ナノモル/ウェル;100μl/ウェル）ロッキング。 </li><li>冷たいWBで洗浄3Xは：300μL/ウェルを追加してから、すぐに流しにプレートを反転し、各添加後にペーパータオルの上縁を吸い取る。 </li></ol>注：井戸からDNA複合体：ビオチン：これはアビジンをこすり可能性があるプレートから流体を除去するためにピペットチップを使用しないでください。それ以降のすべての洗浄ステップのためにこれを行う。 5。核抽出物とのインキュベーション注：ポリのdI / DCブロッキングバッファ用のサケやニシン精子DNAを代用しないでください。乳タンパク質でプレートをブロックしないようにしてください。これらのブロッキング剤は、いずれも高いバックグラウンド値になる。 <ol><li>核抽出物（90μL/ウェル）から調製された特異的な転写因子でインキュベートする。結合緩衝液1X DNA中（50μgの/ ULストックから/μL1μg）を+ポリのdI / DC;核抽出物を含有するマスターミックスを調製（3-9μgの/ウェルのDNA結合タンパク質）。ボリュームは総数のために必要とされる必要なウェル（90μL/ウェル）。 </li><li>例えばビタミンD3（ 図2）又はCADD化合物5221975（ 図3）、又はエタノールなどの溶媒対照、適切に希釈として任意の潜在的な阻害剤は、この工程で添加される。 </li><li> 4℃でO / N、プラットフォームをロッキングの上に置いてプレート</li><li> WBで洗浄3Xは：300μL/ウェルを追加</li></ol> 6。一次抗体を加え注：一次抗体希釈液を新たに調製する必要がある - ストレージはお勧めしません。 <ol><li> RUNX2特異的モノクローナル抗体（株式1μgの/μL）1/5に希釈する、ストレプトアビジンでの000は、バッファを洗う。三重に（90μlの/ウェル）を96ウェルプレートの各ウェルに添加するために十分に準備する。 </li><li>ロッキングプラットフォーム上で室温で1時間インキュベートする。 </li><li> WBで洗浄3Xは、300μL/ウェルを追加。 </li></ol> 7。二次抗体の添加注：二次抗体希釈はSTO可能4℃で一晩、赤であれば、次の日必要としていました。 <ol><li>ストレプト洗浄緩衝液中で1:1,400に希釈F AB-特異的親和性精製し、HRP結合抗体（7.1 mg / mlのストック）：3.5μLantibody/5.0 mlの洗浄バッファー。三重に（90μlの/ウェル）を96ウェルプレートの各ウェルに添加するために十分に準備する。 </li><li>ロッキングプラットフォーム上で室温で30分間インキュベートする。 </li><li>シンク（300μL/ウェル）にプレートを反転させてWBで洗浄6X。 </li></ol> 8。 HRP基質および製品開発<ol><li>ストックボトルから直接ウェルあたりTMB基質50μlのを追加します。 </li><li>暗闇の中で、室温で10〜20分インキュベートする（反応法を停止）または直接（連続運動モニタリング）の吸光度を測定します。 </li></ol> 9。反応測定<ol><li>反応方法を停止します。視覚的な停止反応のために、透明から青に色の変化を確認し、50μlの硫酸で反応を停止。 </li><li> 450 nmの吸光度を測定してバイオトラックII可視プレートリーダー分光光度計（Amersham Biosciences社、GEヘルスケアバイオサイエンス社ピスカタウェイNJ、USA）または類似の器具。 </li><li>連続運動監視方法：最後の洗浄後に基板を追加して、直前に、分光光度計に配置する（反応を停止しないでください）​​。 </li><li>バイオテックシナジーHTマルチ反応マイクロプレートリーダー分光光度計を用いて635 nmの吸光度を測定（バイオテック·インスツルメンツ社、ウィヌースキ、バーモント州、米国）、または類似の楽器。 </li></ol>

<ol>
	<li>Hellman, L. M., Fried, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+mobility+shift+assay+(EMSA)+for+detecting+protein-nucleic+acid+interactions.">Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions.</a> Nat. Protoc. 2, 1849-1861 (2007).</li><li>Bhattacharya, N., Sarno, A., Idler, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+detection+of+nuclear+factor-kappaB+activity+using+a+sensitive+oligo-based+chemiluminescent+enzyme-linked+immunosorbent+assay.">High-throughput detection of nuclear factor-kappaB activity using a sensitive oligo-based chemiluminescent enzyme-linked immunosorbent assay.</a> Int. J. Cancer. 127, 404-411 (2010).</li><li>Hartzell, D. D., Trinklein, N. D., Mendez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+analysis+of+the+CREB+signaling+pathway+using+HaloCHIP-chip+and+high+throughput+reporter+assays.">A functional analysis of the CREB signaling pathway using HaloCHIP-chip and high throughput reporter assays.</a> BMC Genomics. 10, 497 (2009).</li><li>Vuori, K. A., Ahlskog, J. K., Sistonen, L., Nikinmaa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TransLISA,+a+novel+quantitative,+nonradioactive+assay+for+transcription+factor+DNA-binding+analyses.">TransLISA, a novel quantitative, nonradioactive assay for transcription factor DNA-binding analyses.</a> FEBS J. 276, 7366-7374 (2009).</li><li>D'Souza, D. R., Salib, M. M., Bennett, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperglycemia+Regulates+RUNX2+Activation+and+Cellular+Wound+Healing+through+the+Aldose+Reductase+Polyol+Pathway.">Hyperglycemia Regulates RUNX2 Activation and Cellular Wound Healing through the Aldose Reductase Polyol Pathway.</a> J. Biol. Chem. 284, 17947-17955 (2009).</li><li>Underwood, K. F., D'Souza, D. R., Mochin, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+RUNX2+transcription+factor-DNA+interactions+and+cell+proliferation+by+Vitamin+D3+(cholecalciferol)+prohormone+activity.">Regulation of RUNX2 transcription factor-DNA interactions and cell proliferation by Vitamin D3 (cholecalciferol) prohormone activity.</a> J. Bone Miner Res. 27, 913-925 (2012).</li><li>Held, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+ß-galactosidase+activity+using+the+PowerWave+HT+and+Gen5+data+analysis+software:+basic+enzyme+kinetic+determinations.">Kinetic analysis of ß-galactosidase activity using the PowerWave HT and Gen5 data analysis software: basic enzyme kinetic determinations.</a> Biotek Instruments Application Note. , (2007).</li><li>Renard, P., Ernest, I., Houbion, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+sensitive+multi-well+colorimetric+assay+for+active+NFkappaB.">Development of a sensitive multi-well colorimetric assay for active NFkappaB.</a> Nucleic Acids Res. 29, E21 (2001).</li><li>Pommier, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+topoisomerase+I+inhibitors:+chemistry,+biology,+and+interfacial+inhibition.">DNA topoisomerase I inhibitors: chemistry, biology, and interfacial inhibition.</a> Chem Rev. 109, 2894-2902 (2009).</li><li>Pennisi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomics.+ENCODE+project+writes+eulogy+for+junk+DNA.">Genomics. ENCODE project writes eulogy for junk DNA.</a> Science. 337, 1159-1161 (2012).</li></ol>

我々は、開示することは何もありません。

DNA結合アッセイは、DNAと相互作用する転写因子の能力を測定するために使用される。 DNA結合のためのアッセイは、電気泳動移動度シフト（EMSA）1およびクロマチンimmuneprecipitation（チップ）に基づくアッセイ3だけでなく、このような化学発光アッセイ2として96ウェルフォーマット4を採用したアッセイが含まれる。 EMSAは、非定量的であり、放射性標識...

DNA結合アッセイは、DNAと相互作用する転写因子の能力を測定するのに有用である。 DNA結合のためのアッセイは、放射性標識オリゴヌクレオチドは、1または化学発光アッセイ2に依存する電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）を含む。 96ウェルフォーマット4を用いたクロマチンimmuneprecipitation法（ChIP）に基づくアッセイ3ならびにアッセイも記載されている。しかしながら、EMSA、放射性標識オリゴヌクレオチドの使用を必要とする非定量的アッセイである。核タンパク質は、特定のヌクレオチドプロモーター配列と会合する場合、結合複合体は、ポリアクリルアミドゲル上で遅角であり、特定の転写因子は、抗体「スーパーシフト」で検証することができる。我々は定義されたプロモーター要素iに対応するDNA結合配列とRUNX2の相互作用を測定することができる酵素結合免疫吸着フォーマット（D-ELISA）を用いて定量的DNA結合アッセイを開発したn個のRUNX2標的遺伝子。抗RUNX2抗体の使用は、アッセイに特異性を提供し、放射性標識の不足は、伝統的なゲルシフトアッセイ5からこのアッセイを区別する。結合複合体の検出は、分光測光分析のための着色生成物へのHRP基質テトラメチルベンジジン（TMB）を変換する西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）に結合された二次抗体を用いて可能である。ここで報告アッセイは、対照として変異したDNAオリゴヌクレオチドの使用を組み込むことができ、DNA結合の競合的又は非競合的阻害剤の検出のために使用することができる。新規な抗腫瘍化合物のスクリーニングは、このアッセイでも可能である。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the Reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly dI/dC</td>
			<td>GE Healthcare, Piscataway, NJ</td>
			<td>US20539-5UN</td>
			<td>1 U ~50mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RUNX2 antibody</td>
			<td>MBL International Corp., Woburn, MA</td>
			<td>D130-3</td>
			<td>1 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fab-specific peroxidase conjugated antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>A9917</td>
			<td>7.1 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB Substrate (tetramethyl benzidine)</td>
			<td>EXALPHA Biologicals, Shirley, MA</td>
			<td>X1189S</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>57995</td>
			<td>Plate-fixing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric Acid</td>
			<td>VWR, West Chester, PA</td>
			<td>BDH-39922-1</td>
			<td>Stop solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-well plates</td>
			<td>Greiner Bio-One, Basel, Switzerland</td>
			<td>655996</td>
			<td>Avidin-coated, black sides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HALT</td>
			<td>Thermo-Scientific/Pierce, Rockford, IL</td>
			<td>78440</td>
			<td>Protease and phosphatase inhibitors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td>Various manufacturers</td>
			<td>Laboratory grade</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Table 1. Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer: Biotrak II Visible plate reader</td>
			<td>Amersham Biosciences</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>For use with stop reaction method</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer: Bio-Tek Synergy HT Multi-reaction microplate reader</td>
			<td>Bio-Tek Instruments, Inc.</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>For use with continuous kinetic monitoring</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Table 2. Equipment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a quantitative assay to study protein:dna interactions, discover transcriptional regulators of gene expression, and identify novel anti-tumor agents

このような電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）、化学発光アッセイ、クロマチン免疫沈降法（ChIP）に基づくアッセイ、およびマルチウェルベースの​​アッセイなどの多くのDNA結合アッセイは、転写因子活性を測定するために使用される。しかしながら、これらのアッセイは、非定量的である特異性を欠いている、放射性標識オリゴヌクレオチドの使用を含み得る、DNAおよび結合の阻害剤のスクリーニングに適用可能でなくてもよい。一方、定量的DNA結合酵素結合免疫吸着アッセイ（D-ELISA）アッセイを用いて、我々は、ビオチンに存在するコンセンサスDNA結合配列と特異的会合に依存RUNX2転写因子を用いてDNAを有する核タンパク質相互作用を実証する標識されたオリゴヌクレオチド。細胞は、核タンパク質の抽出、および二本鎖オリゴヌクレオチドの設計の調製が記載されている。アビジン被覆96ウェルプレートを、アルカリ性緩衝液で固定し、ブロッキング緩衝液中のヌクレオチド、核タンパク質と共にインキュベートする。 Follプレートを十分に洗浄するため、特異的一次抗体および二次抗体のインキュベーションは、比色反応の西洋ワサビペルオキシダーゼ基質及び現像を加えている。反応停止モードまたは連続的動力学的モニタリングを定量的DNAとタンパク質の相互作用を測定するために使用した。我々は、非特異的IgGとまたはタンパク質または一次抗体のない治療を含め、適切な特異性を制御し、議論する。アッセイのアプリケーションは、その薬剤スクリーニングにおける有用性​​と代表の正と負の結果が議論されているなど、記載されている。

D-ELISA法であれば、コンセンサス結合部位RUNX2（ACACCA）の3つのコピーを含有する配列特異的二本鎖オリゴヌクレオチドが使用されているとして指定DNA結合タンパク質に高度に特異的である。タンパク質因子を認識し、一次抗体は、特異性を向上させます。二次抗体は、検出を容易にします（ 図1）の着色生成物に明確な基質（テトラメチルベンジジン）に変換共有結合した西洋ワ?...

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A Quantitative Assay to Study Protein:DNA Interactions, Discover Transcriptional Regulators of Gene Expression, and Identify Novel Anti-tumor Agents

我々は、DNAと転写因子との相互作用を測定するための定量的なDNA結合性、ELISAベースのアッセイを開発した。 RUNX2タンパク質に対して高い特異性は、コンセンサスDNA認識オリゴヌクレオチドと特異的モノクローナル抗体を用いて達成された。酵素結合抗体基質反応と比色検出をリアルタイムでモニターした。

遺伝子発現のDNA相互作用、ディスカバー転写レギュレータ、および新規抗腫瘍剤を同定：タンパク質を研究するために、定量的アッセイ

Many DNA-binding assays such as electrophoretic mobility shift assays (EMSA), chemiluminescent assays, chromatin immunoprecipitation (ChIP)-based assays, ...

a-quantitative-assay-to-study-proteindna-interactions-discover

Research

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Biology

18.5K ビュー.  University of Maryland School of Medicine. 我々は、DNAと転写因子との相互作用を測定するための定量的なDNA結合性、ELISAベースのアッセイを開発した。 RUNX2タンパク質に対して高い特異性は、コンセンサスDNA認識オリゴヌクレオチドと特異的モノクローナル抗体を用いて達成された。酵素結合抗体基質反応と比色検出をリアルタイムでモニターした。 

ビデオ: A Quantitative Assay to Study Protein:DNA Interactions, Discover Transcriptional Regulators of Gene Expression, and Identify Novel Anti-tumor Agents

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

エレクトロポレーションのためのマウス骨髄からの一次造血細胞培養の準備

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

生物学

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

高効率で初代培養細胞をトランスフェクトするためにジーンパルサーMXcellのエレクトロポレーションシステムの使用

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, into close spatial proximity 2-6. Deciphering the relationship between chromosome organization and genome activity will aid in understanding genomic processes, like transcription and replication. However, little is known about how chromosomes fold. Microscopy is unable to distinguish large numbers of loci simultaneously or at high resolution. To date, the detection of chromosomal interactions using chromosome conformation capture (3C) and its subsequent adaptations required the choice of a set of target loci, making genome-wide studies impossible 7-10.
We developed Hi-C, an extension of 3C that is capable of identifying long range interactions in an unbiased, genome-wide fashion. In Hi-C, cells are fixed with formaldehyde, causing interacting loci to be bound to one another by means of covalent DNA-protein cross-links. When the DNA is subsequently fragmented with a restriction enzyme, these loci remain linked. A biotinylated residue is incorporated as the 5' overhangs are filled in. Next, blunt-end ligation is performed under dilute conditions that favor ligation events between cross-linked DNA fragments. This results in a genome-wide library of ligation products, corresponding to pairs of fragments that were originally in close proximity to each other in the nucleus. Each ligation product is marked with biotin at the site of the junction. The library is sheared, and the junctions are pulled-down with streptavidin beads. The purified junctions can subsequently be analyzed using a high-throughput sequencer, resulting in a catalog of interacting fragments.
Direct analysis of the resulting contact matrix reveals numerous features of genomic organization, such as the presence of chromosome territories and the preferential association of small gene-rich chromosomes. Correlation analysis can be applied to the contact matrix, demonstrating that the human genome is segregated into two compartments: a less densely packed compartment containing open, accessible, and active chromatin and a more dense compartment containing closed, inaccessible, and inactive chromatin regions. Finally, ensemble analysis of the contact matrix, coupled with theoretical derivations and computational simulations, revealed that at the megabase scale Hi-C reveals features consistent with a fractal globule conformation.

The Hi-C method allows unbiased, genome-wide identification of chromatin interactions (1). Hi-C couples proximity ligation and massively parallel sequencing. The resulting data can be used to study genomic architecture at multiple scales: initial results identified features such as chromosome territories, segregation of open and closed chromatin, and chromatin structure at the megabase scale.

ハイC：ゲノムの三次元構造を研究する方法。

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

ナマルバ細胞におけるIL - 4依存性遺伝子発現のsiRNAのノックダウン：遺伝子発現研究を簡素化する自動化セルカウンターの使い方

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited from their latent state in the cytoplasm to cell surface receptors where they are activated by phosphorylation at a single tyrosine residue1. They then dimerize and translocate to the nucleus to drive the transcription of target genes, affecting growth, differentiation, homeostasis and the immune response. Not surprisingly, given their widespread involvement in normal cell processes, dysregulation of STAT function contributes to human disease, particularly to cancers2 and autoimmune diseases3. It is well established that transcription is regulated by alterations to the chromatin template4,5. These alterations include the activities of ATP-dependent complexes, as well as covalent histone modifications and DNA methylation6. Because STAT activation of gene expression is both rapid and transient, it requires specific mechanisms for modulating the chromatin template at STAT-dependent gene loci. To define these mechanisms, we characterize the histone modifications and the enzymatic activities that generate them at gene loci that respond to STAT signaling. This protocol describes chromatin immunoprecipitation, a method that is valuable for the study of STAT signaling to chromatin in activated gene expression.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

This protocol describes how chromatin immunoprecipitation (ChIP) is used to study the dynamic alterations to the chromatin template that regulate transcription induced by a signal transduction pathway.

ヒト細胞において活性化遺伝子発現のアッセイのダイナミックヒストン修飾のクロマチン免疫沈降（ChIP）

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

アクティブT.の試験管内再構成でcastaneumのテロメラーゼ

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

リボソーム結合した新生ポリペプチドの分離<em&gt; in vitroで</em&gt; mRNAに沿って並進一時サイトを識別するために

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

低酸素症後単一細胞レベルでのグローバルのRNA合成の分析

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

培養哺乳動物細胞内の生物学的経路のユビキチンおよびユビキチン様システムレギュレータを識別するために、siRNAのスクリーニング

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 (Kir4.1)

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a cytosine-guanine dinucleotide. While DNA methylation provides long-lasting and stable changes in gene expression, patterns and levels of DNA methylation are also subject to change based on a variety of signals and stimuli. As such, DNA methylation functions as a powerful and dynamic regulator of gene expression. The study of neuroepigenetics has revealed a variety of physiological and pathological states that are associated with both global and gene-specific changes in DNA methylation. Specifically, striking correlations between changes in gene expression and DNA methylation exist in neuropsychiatric and neurodegenerative disorders, during synaptic plasticity, and following CNS injury. However, as the field of neuroepigenetics continues to expand its understanding of the role of DNA methylation in CNS physiology, delineating causal relationships in regards to changes in gene expression and DNA methylation are essential. Moreover, in regards to the larger field of neuroscience, the presence of vast region and cell-specific differences requires techniques that address these variances when studying the transcriptome, proteome, and epigenome. Here we describe FACS sorting of cortical astrocytes that allows for subsequent examination of a both RNA transcription and DNA methylation. Furthermore, we detail a technique to examine DNA methylation, methylation sensitive high resolution melt analysis (MS-HRMA) as well as a luciferase promoter assay. Through the use of these combined techniques one is able to not only explore correlative changes between DNA methylation and gene expression, but also directly assess if changes in the DNA methylation status of a given gene region are sufficient to affect transcriptional activity.

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 Kir4.1

DNA methylation is capable of maintaining stable levels of gene expression as well as allowing for dynamic changes in gene expression in response to a variety of stimuli. We detail techniques that allow the study of gene-specific changes in DNA methylation and the effect of these changes on gene expression.