マイクロRNA機能とのニューラルマイクロRNA標的相互作用にアクセスするには、MicroRNAが健康な状態と病気状態の両方で様々な生物学的プロセスをどのように調節するかを理解することが重要です。このプロトコルは、マイクロRNAの直接標的の検証が困難であるため、マイクロRNA標的および機能的マイクロRNAを同定する戦略を通じて再現を記述する。当社のプロトコルは、個々のマイクロRNAの機能と癌治療におけるマイクロRNAの影響に関する洞察を提供することができます。
半最大阻害濃度の計算は、マイクロRNA研究だけでなく、他の抗癌薬の有効性評価のための重要な方法です。我々のプロトコルは、細胞内のマイクロRNAのレベルを理解するための基本的な方法を説明したので、新しい研究者に役立ちます。プロトコルを開始するには、セル カウンタを持つセルをカウントします。
96ウェルプレートに細胞をプレートします。翌日、マイクロRNA制御模倣の複数の最終濃度で細胞をトランスフェクションするトランスフェクション混合物のセットを調製し、マイクロRNA-107を模倣する。25マイクロモルマイクロRNA対照模倣、またはmicroRNA-107模倣のストックから、マイクロ遠心チューブ中のトランスフェクション試薬と共に還元血清培地にミミックまたはマイクロRNA-107を希釈して追加します。
マイクロピペットを用いてオリゴ含有混合物を軽く混ぜる。細胞培養フードに10分間インキュベーションした後、オリゴ含有混合物をもう一度軽く混ぜ、50マイクロリットルの混合物を各ウェルに加えます。トランスフェクトした細胞を細胞培養インキュベーターに保管してください。
プレートの各ウェルに細胞培養培地を慎重に吸引し、速やかに100マイクロリットルの100マイクロリットルのトリクロロ酢酸(TCA)を各ウェルに充填します。10%TCAを含むプレートを摂氏4度で1時間保ちます。次に、水道水で浴槽に浸してプレートを数回洗います。
水が残らなくなるまでプレートをタップして、井戸の中から余分な水を取り除き、プレートを乾燥させます。ピペット50マイクロリットルの0.4%SRB溶液は、ブランクウェルを含む各ウェルに。0.4%SRB溶液がウェルの底部を均等に覆うまでプレートをそっと振ります。
その後、プレートを40〜60分間インキュベートする。インキュベーション後、非結合色素が完全に洗い流されるまで1%酢酸でプレートを洗います。ピペット100マイクロリットルの10ミリモルトリスベース溶液は、ブランクウェルを含む対応する井戸に。
プレートをシェーカーの上に10分間置いておきます。492ナノメートルで吸光度を測定します。SRBアッセイの吸光度値を用いて、各群の平均吸光度と標準偏差の割合を計算します。
処理濃度、平均吸光度、標準偏差などの生データを、データを垂直方向に整列させることでソフトウェアにインポートします。[グラフの作成] タブをクリックし、[単純な散布図のエラー バー] を選択します。[ワークシートの列] を [シンボルの値] として選択し、[次へ] をクリックします。
[データフォーマット]パネルで、[X-Yペア]を選択し、[次へ]をクリックします。[データの選択] パネルで、対応するデータ列を選択します。[完了]をクリックしてプロットを作成します。
X 軸をダブルクリックして、軸のスケールの種類を変更します。スケールの種類を線形から対数に変更します。開始範囲と終了範囲の番号をそれぞれ 0.01 と 200 に変更します。
散布図を右クリックし、[カーブ フィット]を選択して、[ユーザ定義]サブカテゴリに移動します。線量応答曲線を選択します。次のボタンをクリックし、[完了] をクリックします。
レポート タブに移動し、n、k、および R の値を確認します。付属のテキスト プロトコルで詳細に説明されているように PCR を実行します。次に、制限酵素Exo1とNot1を含む反応混合物をチューブに組み合わせて二重消化に移ります。
37°Cの水浴で3〜4時間混合物をインキュベートします。1%アガロースゲルで二重消化製品を実行します。その後、UV光の下でバンドをカットします。
二重消化PCR産物と切除バンドからのルシファーゼベクターを精製します。DNAリガーゼを含む20マイクロリットルのライゲーション反応混合物を調製することにより、PCR産物のルシファーゼベクターへのライゲーションを継続する。チューブを10〜15秒間短く遠心分離します。
サーマルサイクラーを使用して、一晩摂氏16度で結紮をインキュベートします。翌日、管轄細胞を含むチューブにライゲーション混合物を加えて変換を行う。チューブを軽くタップし、氷の上に20分間置きます。
30秒から1分間、42°Cのヒートブロックにチューブを素早くそっと移します。熱ショックの後、チューブを氷の上に20分間置きます。LB寒天プレート上の有能な細胞を広げます。
一晩摂氏37度でインキュベーターで有能な細胞を成長させます。翌日、個々のコロニーを摘み取り、超純水を含む8ストリップチューブの1つに大腸菌を再中断し、このステップを繰り返して4個から8個の無作為に選択されたコロニーから大腸菌を再中断する。25マイクロリットルの大腸菌懸濁液を別の8ストリップチューブセットに移します。
大腸菌懸濁液を用いてコロニーPCRを行う。ルシファーゼアッセイを24ウェルプレートで調製します。各ウェルに対して500マイクロリットルの細胞培養培地中の4つの細胞に1~2倍の10を加える。
一晩インキュベーションした後、50ナノグラムのルシファーゼベクターを、トランスフェクション試薬を用いて、コントロールミミックまたは特異的マイクロRNA模倣を用いて細胞内に入る。翌日、リン酸緩衝生理食塩を使用してウェルの内側を2回洗います。200マイクロリットルのライシス試薬をウェルに塗布し、ルシファーゼ活性を測定する前に細胞ライシスを十分に行います。
プレートを少なくとも15分間振っておいてください。5~10マイクロリットルの細胞溶解液を新しいチューブに移し、100マイクロリットルの試薬を1個加え、すぐにピペット処理で溶液を混合します。その後、イルミノメーターを使用してホタルルシメラーゼ活性を10〜15秒間読み取ります。
同じチューブに100マイクロリットルの試薬2を加え、2回ピペットで混ぜます。最後に、イルミナメーターを使用して10〜15秒間レニラルシファーゼ活性を読み取ります。RTPCRは、HPNE細胞と比較してマイクロRNA-107およびPANC-1およびCAPAN-1細胞の有意な減少を示す。
マイクロRNA-301のレベルは、HPNE細胞と比較して、PANC-1およびCAPAN-1細胞において有意にアップレギュレートされた。この研究のSRBアッセイは、PANC-1細胞の増殖がマイクロRNA-107模倣トランスフェクションに続いて減少したことを明確に示している。microRNA-107の11の潜在的な予測標的のスクリーニングは、腫瘍細胞増殖の正の調節因子であるシヌクレインガンマ(SNCG)のみがmicroRNA-107およびPANC-1細胞と直接相互作用することを明らかに示し、microRNA-107がSNCG発現を調節することによってPANC-1細胞の増殖を否定的に調節できることを示している。
テトラヒドロレム系エンティティおよびCFSEを用いる成体細胞増殖アッセイは、細胞タイプに応じてマイクロRNA模倣などの効果をスクリーニングするために適用可能である。マイクロRNAの実験的に検証された機能に基づいて、ルシファーゼアッセイの前に候補標的のリストを絞り込むために、データベースとターゲット予測プログラムの体系的な見直しが必要です。抗癌薬とのマイクロRNAの併用効率の評価のために、組合せ指数の評価のための我々のプロトコルに基づいて調整されたIC値を計算することが有利である。
