この作品は、NIHの助成金DE018304、R01DE018281によってサポートされていました。 KTは、メッドを通じて、ハワードヒューズ医学研究所（HHMI）からグラッドイニシアティブにノースカロライナ大学チャペルヒル校にT32 GM07092 - 34でと助成金によってサポートされています。 PCはT32 CA009156によってサポートされています。

完全にテカン自由エボロボット（A）、またはマトリックス電子マルチチャンネルピペット（B）と手で自動化さとして定量PCRプレmiRNAプロファイリングアレイを設定することができます。 1）マスターミックス、プライマープレートやサンプルを準備します。 <ol><li> 0.5pMで96ウェルフォーマット（2枚の合計）は186のプライマーペアを含むプライマープレートを-80℃で保存してください。使用前に軽く室温、ボルテックスと遠心でプレートを解凍。 </li><li>マスターミックスを調製するために、室温でSYBRグリーン2倍のPCRミックスを解凍。各反応は2ulプライマーと8ulマスターミックスを使用しています。反応あたりマスターミックスの組成は4ul SYBRミックス、3ul PCRグレードの水、10〜20 ngのサンプルのDNAまたはcDNAである。 </li><li>各96ウェルプライマープレートのセットアップについては、4つのマスターミックスのチューブが必要になります。サンプルを4連で4プレートあたりのサンプル（singlicate）、プレートごとに2つのサンプル（重複）または単一のサンプルを実行することができます。 </li><li> 4〜2ミリリットルエッペンドルフチュー​​ブの各々にSYBR、水とサンプルを組み合わせることにより、マスターミックスを調製する。各チューブは廃棄物をピペッティングするための過剰でき、約100反応のための十分なマスターミックスが含まれている必要があります。ミックスする渦。 </li></ol>自由テカンエボロボットを使用してプリmiRNAのアッセイのA.セットアップ。 <ol><li>ロボットの初期化とEvowareプログラムのロードに続いて、ピペッティングの精度に干渉する気泡のシステムをクリアする30mlsそれぞれで三回フラッシュします。 </li><li>以下を含むようにロボットのプラットフォームを設定します。 <ul><li>標識した384ウェルプレート</li><li> 96ウェルプライマープレート（1） </li><li>マスターミックス</li><li> 2％の漂白剤を含むトラフ</li><li>満たされたシステムの流体容器</li><li>空の廃棄物容器</li></ul></li><li>二回&quot;Ru​​n&quot;を選択することで自動化されたロボットの実行を開始します。 </li><li>プログラムの終了時に、ライトサイクラー480シーリングホイルで384ウェルプレートとシールを取り除き、軽く遠心する。場所は、ホテルの位置1に384ウェルプレートを密封。 </li><li> 2.2ステップと、新しいマスターミックスと新しい384ウェルプレートでプライマープレート2の繰り返しに移動します。 <ol><li>ホテルの位置2に密閉プレートを置きます。 </li></ol></li><li>ホテルからライトサイをロードするための新しいEvowareのプログラムを開いて、二度&quot;実行&quot;を選択します。 <ol><li>自由エボは、自動的にライトサイに各プレートをロードし、以下のSYBR -緑色のI / HRMサイクリングプログラムを実行します。 事前に（1サイクル）： 50 4.8のランプ速度で5分〜° /秒 95 4.8のランプ速度で5分〜° /秒 アンプ（45サイクル）： 95 4.8ランプの速度で15秒℃です° /秒 62 2.5ランプの速度で30秒℃です° /秒 （このステップの間に単一のデータ収集） 融解曲線： 95 4.8ランプの速度で5秒℃です° /秒 1 2.5のランプ速度で分° /秒、60℃ 95℃0.11 ° /秒の昇温速度で連続 ° Cごとに5買収 クール： 50 25の昇温速度で30秒℃です° /秒</li></ol></li></ol>マトリックス電子マルチチャンネルピペットを使用してプリmiRNAのアッセイのB.セットアップ： <ol><li>リザーバにマスターミックスのチューブ1の内容を置きます。 </li><li> 2 8ulとマスターミックスの16ulを吸引パージ工程に続いてのステップを分配する電子ピペットを設定します。 </li><li>マスターミックス1の場合、よくA1から始まる、384ウェルプレート（384ウェル先端の間隔で設定）の他のすべてのウェルに8ulを分注する。 （すなわち井戸A1、C1、E1、等）第二8ulは調剤については、廃棄物の容器とDisposeのヒント以上パージして（すなわち井戸A3、C3、E3、等）の3列目に移動します。 </li><li>あなたがよくA23に到達するまで、残りの5サイクルのためにこのパターンに従ってください。 </li><li>マスターミックス3（よくB1、D1、F1、などで始まり）;マスターミックス4（B2で始まり、D2、F2、など（よくA2、C2、E2、などで始まる）、マスターミックス2に繰り返します。 。）。 </li><li>プライマープレートのaliquottingの場合は、2ulを吸引し、パージ工程を以下のと2ulディスペンスする電子ピペットを設定します。廃棄物容器およびDisposeのヒント以上384ウェルプレート、井戸A1、C1、E1、等パージに96ウェルプライマープレート（AH）のカラム1からのプライマーの2ulを分注する。 B1、D1、F1;とB2、D2、F2などのウェルA2、C2、E2の繰り返し</li><li>フル384ウェルプレートが小分けされるまで、各プライマーの列ごとに2列の上に移動、96ウェルプライマーの行の2月12日のために繰り返します。 </li><li>ライトサイクラーシーリング箔と簡単に遠心によるシールプレート。 </li><li> SYBRグリーンI / HRMの検出フォーマットを使用して、以下の設定にしたがってサイクラー480とサイクルプレートに入れますプレート： 事前に（1サイクル）： 50 4.8のランプ速度で5分〜° /秒 95 4.8のランプ速度で5分〜° /秒 アンプ（45サイクル）： 昇温速度で15秒、95℃4.8 ° /秒 62 2.5ランプの速度で30秒℃です° /秒 （このステップの間に単一のデータ収集） 融解曲線： 95 4.8ランプの速度で5秒℃です° /秒 1 2.5のランプ速度で分° /秒、60℃ 95℃0.11 ° /秒の昇温速度で連続 ° Cごとに5買収 クール： 50 25の昇温速度で30秒℃です° /秒</li><li>新しく調製したマスターミックスを使用して、新鮮な384ウェルプレートにaliquotting、プライマープレート2を使用して繰り返します。 </li></ol>成功の秘訣： PCRアレイを設計する重要な特性はすべての186のプライマーペアが同じアニーリング温度を持っていることである、板が同一の最適なPCRの実行プログラムの設定で実行することができますので。 それぞれの新しい配列が前に実行されているサンプルは、3つのコントロールを使用してチェックする必要があります。これらのコントロールは以下のとおりです。 プライマーのコンタミネーションを排除するために水または0.1 X TEで実行されたすべてのプライマーの1失点。 1にはキャリーオーバーのないことを確認するために、水/ TEおよび陽性コントロールを交互に実行する。 図3は、実行間の再現性を確保するために、同一の陽性コントロールを使用して実行されます。 マスターミックスを新たに調製する必要がある、とプレートが最適な結果を得るために24時間以内に実行する必要があります プライマープレート箔は、ウェル間のコンタミネーションのリスクを減らすために徐々に削除する必要があります。 固定のヒントを持つロボットを使用する場合、2％の漂白剤の洗浄は、水のフラッシュに続いて各ピペッティングステップの間でのヒントを、洗浄する必要があります。これは、他の方法でデータを汚染し、明確な結果につながる可能性のキャリーオーバーを、防止し、排除します。 プレートはライトサイ経由で実行された後、それはPCRのセットアップルームで再び開かれるべきではない。これはPCRの汚染を防ぐことができます。 代表的な結果： 定量PCRの結果は、典型的にライトサイクラー解析ソフトウェアから決定CT値で表されます。正常な実行は、通常、正のサンプルのサンプルのため、通常は20から35の間にCTの範囲で構成されています。いい走りで水のサンプルは&gt; 40のCTで常にあり、37以上のサンプルやCTで特定のwellはネガティブまたは検出されないと見なされます。原則として、&lt;10のCTをもたらすサンプルも信頼性が低いとさらなる分析から除外されます。私たちのアッセイで定量PCRのデータと内部統制のインクルージョンを分析する方法はいくつかのサンプル入力の変動を制御するに役立つがあります。プリのmiRの配列は、しばしば異なる試料からのCT値を正規化するために、リファレンス遺伝子として使用されているU6コントロールプライマーが含まれています。この正規化された値は、デルタCT値（DCT）と呼ばれています。結果は、しばしば生のCT、DCTの値としてグラフ化されたり、さらに標準化された値に分析することができます。 図1では、timecourseの実験からの4つの異なるサンプルの完全なプレmicroRNAの配列の分析は、ヒートマップ形式で表示されます。各プレマイクロRNAの相対的な発現が示され、三大、異なるクラスターが出現しています。 （図1A）が期待どおりに分析プレmiRの大半は、小さな、些細な変更を受けた。しかし、事前にマイクロRNAのごく一部が有意に減少した（図1B）またはtimecourse実験を通して（図1C）劇的に増加した。各プレマイクロRNAの発現のレベルはベースラインレベルとして0Hタイムポイント（サンプル1）に正規化された。いくつかのインスタンスでは、クラスタ化されたプレマイクロRNAの一部は、（：のlet - 7aは、図1B EX）ヒートマップの分析で一緒にクラスタ化することに気づくかもしれません。実験に応じて、クラスタは、ウイルス感染に依存していることに共通の分子やシグナル伝達経路によって調節されている事前マイクロRNAまたはプレmiRの細胞型特異的な発現をemergeすることがあります。 我々はまた、開発したプレmicroRNAのアッセイは、ヒトプレmiRはに加えて、ヘルペスウイルス（KSHV）とエプスタインバーウイルス（EBV）の関連カポジ肉腫でエンコードされた既知のウイルスのプレマイクロRNAと遺伝子の数が含まれます。これらは、細胞株および使用するサンプルのウイルスの状況に応じて、正または負の対照として使用することができます。図2では、4連で実行されるKSHV陰性サンプルから平均CTSが表示されます。重要なのは、KSHV LANAは、高感度の定量PCRアレイでは、このサンプルでは検出されなかった。しかし、U6 - 内部統制とlet - 7A - 高度に発現されたヒトプレマイクロRNAは、検出可能なレベルで発現された。最後に、予想通り、PCRグレードの水のネガティブコントロールは、定量PCRの製品を得られなかった。 成功した定量PCRの実行の別の指標は、サンプル中の汚染の可能性への洞察を与えることができる良好な融解曲線分析、である。 PCRが完了した後、溶融温度を確立するには、プレートがゆっくりと加熱される。別々のDNA鎖として、SYBRの緑がリリースされ、蛍光シグナルが減少する。このDRの温度オペアンプは、グラフ化され発生し、そしてサンプルの融解温度として知られています。 DNA配列に応じて、サンプルがお互いからとはDNAが存在しないので、溶融温度を持ってはならない水ネガティブコントロール、異なる温度で溶融。各プライマー対のPCR産物は、同様の温度で溶融してください。例えば、図3は、重複して同じサンプルを使用して、異なる2つのプライマーの融解曲線分析を示しています。それは、溶融温度が2つのプライマーペアごとに異なる​​が、サンプルは、各レプリケートするためのまったく同じ温度で溶融されていることは明らかです。不良または汚染の可能性のあるサンプルの兆候は、入力の二つの異なる情報源の存在を示唆し、いくつかの融解ピークが含まれる場合があります。 <img src="/files/ftp_upload/2210/2210fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。プレmicroRNAの署名は、新たな定量PCRベースの配列を使用してプロファイリングを通して現れる。平均deltaCTU6を計算し、標準化された値は、ヒートマップとして表示される3つの異なるクラスターをもたらし、ArrayMinerTMソフトウェアに読み込まれました。 （）式の中で小さな変化のプレマイクロRNAが示されている。そのレベルは大幅に減少していたプレマイクロRNAは、（B）または（C）の増加も示されている。赤が増加発現レベルを表し、青は発現の低いレベルに対応しています。 <img src="/files/ftp_upload/2210/2210fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。定量PCRベースのプレマイクロRNAの配列の内部統制を含める。 3種類の遺伝子と、テンプレートなしのコントロールのための生のCT値が表示されます。 PCR H2Oが私たちのネガティブコントロールとして機能しながらU6は、内部ポジティブコントロールとして使用されます。せ- 7A - 1 - 1はKSHV LANAを使用する細胞株または組織のウイルスの状況に基づいて、正または負の対照として使用することができますが、通常は多くの異なる種類の細胞で発現するマイクロRNAです。 <img src="/files/ftp_upload/2210/2210fig3.jpg" alt="図3" /> 図3。プレマイクロRNAのプライマーとサンプルの汚染がないのピーク解析を溶解。融解曲線は、ライトサイクラーソフトウェアでのTmの呼び出しの解析を用いて得られた。重複で実行される同じサンプルに対して2つの異なるプライマー（プライマーAおよびB）が表示されます。各プライマーの融解温度が異なるです。しかし、サンプルはサンプルのコンタミネーションがないことを示す、1つのピークのみを持っています。

<ol>
	<li>Bustin, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIQE+Guidelines:+Minimum+Information+for+Publication+of+Quantitative+Real-Time+PCR+Experiments.">The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments.</a> Clinical Chem. 55 (4), 611-622 (2009).</li><li>Fr&#233;geau, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Processing+of+Forensic+Casework+Samples+using+Robotic+Workstations+Equipped+with+Nondisposable+Tips+-+Contamination+Prevention.">Automated Processing of Forensic Casework Samples using Robotic Workstations Equipped with Nondisposable Tips - Contamination Prevention.</a> J. Forensic Sci. 53 (3), 53-533 (2008).</li><li>O'hara, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-micro+RNA+Signatures+Delineate+Stages+of+Endothelial+Cell+Transformation+in+Kaposi+Sarcoma.">Pre-micro RNA Signatures Delineate Stages of Endothelial Cell Transformation in Kaposi Sarcoma.</a> PLoS Pathog. 5 (4), e1000389-e1000389 (2009).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

QPCRが研究にサンプル間の遺伝子発現レベルを比較するだけでなく、ウイルスの場合に陽性を判断するために使用できる高感度のアッセイである。定量PCRアレイを用いての利点は、短期間で各サンプルのために多くのプライマーを（私たちの場合は、186プライマーペア）を実行する機能です。このようなテカン自由エボとしてピペッティングロボットを使用して、追加テストを設定するため?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Freedom Evo 150</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Tecan</td>
<td>30017587</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Matrix Electronic Multichannel Pipette</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>2001-MTX</td>
<td>(or any comparable Thermo Scientific multichannel that can pipette the volumes described above)</td>
</tr>
<tr>
<td>Matrix Integrity Filter Tips, Sterile</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>7435</td>
<td>(or comparable tip for multichannel used)</td>
</tr>
<tr>
<td>Lightcycler 480 SYBR Green 1 Master</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>04 707 516 001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lightcycler 480 Instrument II</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>05015243001</td>
<td>384-well version</td>
</tr>
<tr>
<td>Lightcycler 480 Multiwell Plate 384, white</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>04729749001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LightCycler 480 Sealing Foil</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>04729757001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LightCycler 480 Multiple Plate Analysis Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>05075122001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Eliminase Decontaminant</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Decon Laboratories</td>
<td>04-355-31</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

profiling of pre-micro rnas and micrornas using quantitative real-time pcr (qpcr) arrays

定量リアルタイムPCR（QPCR）は、遺伝子発現レベルのプロファイリングで、正確かつ有用なツールとして浮上している。その多くの利点の一つは、各アッセイのために入力の少量を使用しながら、遺伝子発現プロファイリングの他の方法に比べて検出下限値です。自動化された定量PCRのセットアップは、より再現性を可能にすることで、このフィールドを改善しました。その便利で迅速なセットアップは、各実験で同時に多くの異なる遺伝子のプロファイリングを有効にする、ハイスループットの実験が可能になります。内部プレートのコントロールと共にこのメソッドは、他の技法に共通する実験変数を減らすことができます。我々は最近、186プライマーペアのセットを使用して事前にマイクロRNA（プレmiRNA）のプロファイリングのための定量PCRアッセイを開発した。マイクロRNAは、転写後レベルで多くの標的mRNAを調節する能力を持つ小型の、非コードRNAの新たなクラスとして浮上している。これらの小さなRNAは、まず前駆体のmiRNA（プレmiRNAの）に切断されている主なmiRNA（PRI - miRNA）の転写産物として、RNAポリメラーゼIIによって転写される。プリmiRNAはダイサーは成熟miRNAを生成するヘアピンループを切断する細胞質にエクスポートされます。 miRNAレベルの増加は、前駆体および成熟miRNAレベルの両方で観察することができ、これらのフォームの両方のプロファイリングに便利です。成熟miRNAのいくつかの市販のアッセイがありますが、しかし、彼らの高いコストは、このプロファイリング手法から研究者を阻止することができる。ここで、我々は、プレmiRNAをプロファイリングの費用対効果の高い、信頼性、SYBRベースの定量PCR法を説明します。プリmiRNAレベルの変化はしばしば成熟したmiRNAの変化を反映し、成熟したmiRNA発現の有用な指標となることができます。彼らは非冗長情報を貢献し、マイクロRNAプロセシングへの洞察を提供することができますしかし、プレmiRNAのと成熟miRNAの両方の同時プロファイリングは最適かもしれません。さらに、ここで説明する手法は、特定の経路や病原体の他のライブラリのセットのプロファイルを含むように拡張することができます。

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Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

我々は、事前にマイクロRNAの設定と分析サーモ科学マトリックスマルチチャンネルピペットで手でだけでなく、ロボットを使用してQPCR用96穴の配列のデモンストレーションを行います。

定量リアルタイムPCR（定量PCR）アレイを用いたプレマイクロRNAとマイクロRNAのプロファイリング

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

profiling-pre-micro-rnas-micrornas-using-quantitative-real-time-pcr

Research

JoVE Journal

Biology

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

17.2K ビュー.  University of North Carolina at Chapel Hill. 我々は、事前にマイクロRNAの設定と分析サーモ科学マトリックスマルチチャンネルピペットで手でだけでなく、ロボットを使用してQPCR用96穴の配列のデモンストレーションを行います。

ビデオ: Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and accuracy of the assay. These primer/probe sets are pre-designed to &gt;98% of the human and mouse genomes and feature significant improvements from previously available technologies. These improvements were made possible by virtue of a novel design algorithm, developed by Thermo Scientific bioinformatics experts.
Several convenient features have been incorporated into the Solaris qPCR Assay to streamline the process of performing quantitative real-time PCR. First, the protocol is similar to commonly employed alternatives, so the methods used during qPCR are likely to be familiar. Second, the master mix is blue, which makes setting the qPCR reactions easier to track. Third, the thermal cycling conditions are the same for all assays (genes), making it possible to run many samples at a time and reducing the potential for error. Finally, the probe and primer sequence information are provided, simplifying the publication process.
Here, we demonstrate how to obtain the appropriate Solaris reagents using the GENEius product search feature found on the ordering web site (www.thermo.com/solaris) and how to use the Solaris reagents for performing qPCR using the standard curve method.

The Solaris qPCR Gene Expression Assays are novel pre-designed qPCR primer/probe combinations designed to simplify the qPCR process without sacrificing the specificity and robustness of the assay.

サーモサイエンティフィックのSolaris定量PCRアッセイを用いて定量的リアルタイムPCR

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

生物学

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB continues to spread rapidly and attacks ash trees of different ages, from saplings to mature trees. However, to date very little or no molecular knowledge exists for EAB. We are interested in deciphering the molecular-based physiological processes at the tissue level that aid EAB in successful colonization of ash trees. In this report we show the effective use of quantitative real-time PCR (qRT-PCR) to ascertain mRNA levels in different larval tissues (including midgut, fat bodies and cuticle) and different developmental stages (including 1st-, 2nd-, 3rd-, 4th-instars, prepupae and adults) of EAB. As an example, a peritrophin gene (herein named, AP-PERI1) is exemplified as the gene of interest and a ribosomal protein (AP-RP1) as the internal control. Peritrophins are important components of the peritrophic membrane/matrix (PM), which is the lining of the insect gut. The PM has diverse functions including digestion and mechanical protection to the midgut epithelium.

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) is an effective tool to diagnose mRNA levels in different insect tissues and developmental stages. In this report we show the use of qRT-PCR to ascertain mRNA levels in different larval tissues and developmental stages of the invasive insect species, emerald ash borer.

エメラルドアッシュボーラーの遺伝子発現の解析（ Agrilus planipennis）を使用して定量的リアルタイム- PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, messages are carried by neurotransmitters released from presynaptic terminals and received by receptors on postsynaptic cells. Our previous research in Caenorhabditis elegans has shown that VSM-1 negatively regulates exocytosis. Additionally, analysis of synapses in vsm-1 mutants showed that animals lacking a fully functional VSM-1 have increased synaptic connectivity. Based on these preliminary findings, we hypothesized that C. elegans VSM-1 may play a crucial role in synaptogenesis. To test this hypothesis, double-labeled microarray analysis was performed, and gene expression profiles were determined. First, total RNA was isolated, reversely transcribed to cDNA, and hybridized to the DNA microarrays. Then, in-silico analysis of fluorescent probe hybridization revealed significant induction of many genes coding for members of the major sperm protein family (MSP) in mutants with enhanced synaptogenesis. MSPs are the major component of sperm in C. elegans and appear to signal nematode oocyte maturation and ovulation . In fruit flies, Chai and colleagues 1 demonstrated that MSP-like molecules regulate presynaptic bouton number and size at the neuromuscular junction. Moreover, analysis performed by Tsuda and coworkers 2 suggested that MSPs may act as ligands for Eph receptors and trigger receptor tyrosine kinase signaling cascades. Lastly, real time PCR analysis corroborated that the gene coding for MSP-32 is induced in vsm-1(ok1468) mutants. Taken together, research performed by our laboratory has shown that vsm-1 mutants have a significant increase in synaptic density, which could be mediated by MSP-32 signaling.

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray analysis was conducted to determine genetic expression profiles in C. elegans, and real-time PCR was used to validate and quantify microarray data.

で遺伝子発現プロファイルを決定 C.エレガンスマイクロアレイとリアルタイムPCRを用いて

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base excision repair (BER) molecular beacons. The substrate (beacon) is comprised of a deoxyoligonucleotide containing a single base lesion with a 6-Carboxyfluorescein (6-FAM) moiety conjugated to the 5'end and a Dabcyl moiety conjugated to the 3' end of the oligonucleotide. The BER molecular beacon is 43 bases in length and the sequence is designed to promote the formation of a stem-loop structure with 13 nucleotides in the loop and 15 base pairs in the stem1,2. When folded in this configuration the 6-FAM moiety is quenched by Dabcyl in a non-fluorescent manner via F&ouml;rster Resonance Energy Transfer (FRET)3,4. The lesion is positioned such that following base lesion removal and strand scission the remaining 5 base oligonucleotide containing the 6-FAM moiety is released from the stem. Release and detachment from the quencher (Dabcyl) results in an increase of fluorescence that is proportionate to the level of DNA repair. By collecting multiple reads of the fluorescence values, real-time assessment of BER activity is possible. The use of standard quantitative real-time PCR instruments allows the simultaneous analysis of numerous samples. The design of these BER molecular beacons, with a single base lesion, is amenable to kinetic analyses, BER quantification and inhibitor validation and is adaptable for quantification of DNA Repair activity in tissue and tumor cell lysates or with purified proteins. The analysis of BER activity in tumor lysates or tissue aspirates using these molecular beacons may be applicable to functional biomarker measurements. Further, the analysis of BER activity with purified proteins using this quantitative assay provides a rapid, high-throughput method for the discovery and validation of BER inhibitors.

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates. The assay yields rates of DNA Repair activity amenable to kinetic analysis and is adaptable for quantification of DNA Repair activity in tissue and tumor lysates or with purified proteins.

病変の特異的分子ビーコンを活用した細胞ライセート中の塩基除去修復活性の定量、リアルタイム分析

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different lineages. A single cell transcriptome assay can be a new approach for dissecting individual variation. We have developed the single cell qRT-PCR method, and confirmed that this method works well in several gene expression profiles. In single cell level, each human embryonic stem cell, sorted by OCT4::EGFP positive cells, has high expression in OCT4, but a different level of NANOG expression. Our single cell gene expression assay should be useful to interrogate population heterogeneities.

Single cell gene expression assay is needed for understanding stem cell heterogeneities.

定量的RT-PCRによって個々のヒト胚性幹細胞のプロファイリング

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and understanding the nature of such interactions is a central step in biological research. Surface Plasmon Resonance (SPR) is a sensitive detection technique for label-free study of bio-molecular interactions in real time. In a typical SPR experiment, one component (usually a protein, termed 'ligand') is immobilized onto a sensor chip surface, while the other (the 'analyte') is free in solution and is injected over the surface. Association and dissociation of the analyte from the ligand are measured and plotted in real time on a graph called a sensogram, from which pre-equilibrium and equilibrium data is derived. Being label-free, consuming low amounts of material, and providing pre-equilibrium kinetic data, often makes SPR the method of choice when studying dynamics of protein interactions. However, one has to keep in mind that due to the method's high sensitivity, the data obtained needs to be carefully analyzed, and supported by other biochemical methods. 
SPR is particularly suitable for studying membrane proteins since it consumes small amounts of purified material, and is compatible with lipids and detergents. This protocol describes an SPR experiment characterizing the kinetic properties of the interaction between a membrane protein (an ABC transporter) and a soluble protein (the transporter's cognate substrate binding protein).

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Surface Plasmon Resonance (SPR) is a label-free method for detecting bio-molecular interactions in real time. Herein, a protocol for a membrane protein:receptor interaction experiment is described, while discussing the pros and cons of the technique.

膜タンパク質のリアルタイム測定：受容体相互作用は、表面プラズモン共鳴を使用した（SPR）

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that provides an accurate and reproducible analysis. Probe-based chemistry offers the least background fluorescence as compared to other (dye-based) chemistries. Presently, there are several platforms available that use probe-based chemistry to quantitate transcript abundance. qPCR in a 96 well plate is the most routinely used method, however only a maximum of 96 samples or miRNAs can be tested in a single run. This is time-consuming and tedious if a large number of samples/miRNAs are to be analyzed. High-throughput probe-based platforms such as microfluidics (e.g. TaqMan Array Card) and nanofluidics arrays (e.g. OpenArray) offer ease to reproducibly and efficiently detect the abundance of multiple microRNAs in a large number of samples in a short time. Here, we demonstrate the experimental setup and protocol for miRNA quantitation from serum or plasma-EDTA samples, using probe-based chemistry and three different platforms (96 well plate, microfluidics and nanofluidics arrays) offering increasing levels of throughput.

Circulating microRNAs have recently emerged as promising and novel biomarkers for various cancers and other diseases. The goal of this article is to discuss three different probe-based real-time PCR platforms and methods that are available to quantify and determine the abundance of circulating microRNAs.

プローブベースのリアルタイムPCRは、マイクロRNAの定量的測定のためのアプローチ

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

qPCRTag分析 - 高スループット、Sc2.0ジェノタイピングのためのリアルタイムPCRアッセイ

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

Absolute Quantification of Plasma MicroRNA Levels in Cynomolgus Monkeys, Using Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR

RT-qPCR is one of the most common methods to assess individual target miRNAs. MiRNAs levels are generally measured relative to a reference sample. This approach is appropriate for examining physiological changes in target gene expression levels. However, absolute quantification using better statistical analysis is preferable for a comprehensive assessment of gene expression levels. Absolute quantification is still not in common use. This report describes a protocol for measuring the absolute levels of plasma miRNA, using RT-qPCR with or without pre-amplification.
A fixed volume (200 &#181;L) of EDTA-plasma was prepared from the blood collected from the femoral vein of conscious cynomolgus monkeys (n = 50). Total RNA was extracted using commercially available system. Plasma miRNAs were quantified by probe-based RT-qPCR assays which contains miRNA-specific forward/reverse PCR primer and probe. Standard curves for absolute quantification were generated using commercially available synthetic RNA oligonucleotides. A synthetic cel-miR-238 was used as an external control for normalization and quality assessment. The miRNAs that showed quantification cycle (Cq) values above 35 were pre-amplified prior to the qPCR step.
Among the 8 miRNAs examined, miR-122, miR-133a, and miR-192 were detectable without pre-amplification, whereas miR-1, miR-206, and miR-499a required pre-amplification because of their low expression levels. MiR-208a and miR-208b were not detectable even after pre-amplification. Sample processing efficiency was evaluated by the Cq values of the spiked cel-miR-238. In this assay method, technical variation was estimated to be less than 3-fold and the lower limit of quantification (LLOQ) was 102 copy/&#181;L, for most of the examined miRNAs.
This protocol provides a better estimate of the quantity of plasma miRNAs, and allows quality assessment of corresponding data from different studies. Considering the low number of miRNAs in body fluids, pre-amplification is useful to enhance detection of poorly expressed miRNAs.

This report describes a protocol for measuring the absolute levels of plasma miRNA, using quantitative real-time reverse transcription PCR with or without pre-amplification. This protocol affords better understanding of the quantity of plasma miRNAs and allows qualitative assessment of corresponding data from different studies or laboratories.

定量的リアルタイム逆転写 PCR を用いたカニクイザルにおける血中マイクロ Rna の絶対定量

RT-qPCR is one of the most common methods to assess individual target miRNAs. MiRNAs levels are generally measured relative to a reference sample. This ...

Real-Time Monitoring of Aurora kinase A Activation using Conformational FRET Biosensors in Live Cells

Epithelial cancers are often hallmarked by the overexpression of the Ser/Thr kinase Aurora A/AURKA. AURKA is a multifunctional protein that activates upon its autophosphorylation on Thr288. AURKA abundance peaks in mitosis, where it controls the stability and the fidelity of the mitotic spindle, and the overall efficiency of mitosis. Although well characterized at the structural level, a consistent monitoring of the activation of AURKA throughout the cell cycle is lacking. A possible solution consists in using genetically-encoded F&#246;rster&#8217;s Resonance Energy Transfer (FRET) biosensors to gain insight into the autophosphorylation of AURKA with sufficient spatiotemporal resolution. Here, we describe a protocol to engineer FRET biosensors detecting Thr288 autophosphorylation, and how to follow this modification during mitosis. First, we provide an overview of possible donor/acceptor FRET pairs, and we show possible cloning and insertion methods of AURKA FRET biosensors in mammalian cells. Then, we provide a step-by-step analysis for rapid FRET measurements by fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) on a custom-built setup. However, this protocol is also applicable to alternative commercial solutions available. We conclude by considering the most appropriate FRET controls for an AURKA-based biosensor, and by highlighting potential future improvements to further increase the sensitivity of this tool.

The activation of the multifunctional Ser/Thr kinase AURKA is hallmarked by its autophosphorylation on Thr288. Fluorescent probes relying on FRET can discriminate between its inactive and activated states. Here, we illustrate some strategies for probe engineering, together with a rapid FRET protocol to follow the kinase activation throughout mitosis.

ライブ細胞におけるコンソジショナルフレットバイオセンサーを用いたオーロラキナーゼ活性化のリアルタイムモニタリング

Epithelial cancers are often hallmarked by the overexpression of the Ser/Thr kinase Aurora A/AURKA. AURKA is a multifunctional protein that activates upon ...