This work was supported by the following funding sources: R01-AR063649, AG-020591, F31-AR035931.

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透過性の単一骨格筋線維の収縮特性の評価は、コンテキストの多種多様な筋機能を調査するために使用されます。例としては、繊維構造と機能に12、運動10,13,14、宇宙飛行15、傷害2,3,16、薬物治療17,18、疾患19および遺伝子操作20,21の老化の影響を評価した研究があります。による直接ネイティブ構成で筋原線維の収縮性能を評価する能力に、この技術は、信号伝送と励起誘発性カルシウム放出神経筋に存在する潜在的な交絡効果の筋原繊維の機能は存在しないの理解を形成するのに魅力的なプラットフォームを提供します研究中のシステムに含まれています。また、単繊維の機能テストは、これらのような収縮タンパク質同定の結果を補完するために使用することができ免疫組織化学またはゲル電気泳動+ウエスタンブロット22を経て得られました。 骨格筋の主要な機能の一つは、力を生成することです。したがって、SF 0、収縮システムの固有の力発生能力の尺度は、筋肉の生理学に大きな関心があります。 SF o の信頼性の推定値は、繊維CSAとF Oの両方の正確な措置を必要とします。繊維は、断面において、一般的に、円形でもない、またその長さに沿ってCSAが均一であるので、CSAを推定する際に、細心の注意を払うべきです。この目的のために、測定は、90°で分離された2つの観点から、それぞれの位置で、繊維の長さに沿ったいくつかの場所で作られています。 F o の信頼性の尺度は、カルシウム濃度Tと活性化溶液を用い、厚い及び薄いフィラメントの重なりを最大にするために、筋節の長さを調整する、受動的な力を占めを含むいくつかの詳細に注意を必要とします最大活性化ハット結果は、所望の実験温度に維持し、実験の日の前の繊維の最適な保存条件（温度及び時間）を維持します。 ここで説明する手順は、最大等尺性力を評価するための手順を説明しているが、それは骨格筋線維の他の重要な機能の品質を評価することがしばしば望ましいです。これは、繊維の追加の機械的操作を含むように実験プロトコルを拡張することによって達成することができます。例えば、繊維は、異なる負荷の一連に対して短縮する速度の測定は、力のパワーおよび速度パワー関係は10,23,24を計算することが可能な力-速度関係の決意を可能にします。また、無負荷短縮の速度は、弛み誘発短縮一連の工程を適用することから成る「たるみ試験」25、及びmeasuriを用いることによって決定することができますたるみを除去するために、ファイバによって必要な時間をngの。頻繁に報告されている別の運動パラメータが一時的にすべてのクロスブリッジ26を切り離し機械的摂動次力再開発のためのK TR、速度定数です。最後に、カルシウム濃度と活性力発生（「強制-PCAの関係」）との間の関係は、多くの場合、興味18であり、収縮を活性化するための閾値以下の範囲のカルシウム濃度を有する一連の溶液に繊維を曝すことによって決定することができます最大活性化とそのための最大の力（FのO）を誘発するのに十分なものにシステム。 上記の機器の多くは単繊維の収縮性を評価するために必要とされているが、他の機器では絶対に必要というわけではありません。長さコントローラは、例えば、繊維の急速なまたは正確な延長または短縮を必要とする任意の実験プロトコルのために不可欠です、（力レコード内のゼロ力レベルはまだいくつかの手段によって識別されなければならないが）が、最大等尺性力を評価するために絶対に必要ではありません。実験室内に繊維を配置するときの断面積を評価するのに有用ながら、側面からの繊維の観察を可能にするプリズムは、絶対に必要ではありません。さらに、種々の実験の溶液に繊維を露出させるための代替手段は、チャンバーの手動操作系または溶液の迅速な充填および排出を可能にする単一のチャンバを工夫するなど、使用することができます。このような15°Cのサブ生理学的実験の温度は一般的に機械的な測定1,2,3,5,8,12,17,27の再現性を改善するために使用される最後に、それは他の温度23に有効なデータを生成することができます溶液特性（ 等カルシウム濃度、pH）に対する温度の影響を考慮する限り、28。 </P&gt; 試験液の組成は、ここで説明する透過処理繊維技術の最も重要な側面の一つです。溶液組成物に関する検討事項は複雑であり、この記事の範囲を超えています。プロトコルセクションの手順5で説明したソリューションは、一定のイオン強度、陽イオン組成、および浸透圧6,29を維持しながら解決策を活性化に事前に活性化からの転送時に、透過性繊維の急速な活性化に重点を置いて設計されています。溶液組成物への他のアプローチは、他の研究グループによる顕著な成功を収めて使用され、一般的に公開された結合定数と計算ツール27,30,31を利用することがされています。様々な活性化溶液中のカルシウムイオンの濃度は、このような力-PCAの評価として最大下の活性化を含む研究において特に重要です。そのようなもののような繊維が完全に活性化された実験について説明しますDここで、活性化溶液中のカルシウム濃度は、典型的には、その正確な知識があまり重要で作る最大の力を達成するために必要な余裕によって越えます。クレアチンリン酸の添加は、そうでない場合は、収縮活性に関連するであろうintramyofibrillar ATPおよびADPの変動を緩衝するために重要です。クレアチンキナーゼは、ADPのクレアチンリン酸からのリン酸転移を触媒するために必要とされます。高温での作業や高速ファイバ32の高速短縮を測定するなど、高いATP離職率につながる実験条件の下では、クレアチンキナーゼは、繊維に結合したままで、内因性のクレアチンキナーゼを補充するために溶液に添加されなければなりません。あまり厳しい実験条件のために、ATP再生系27はあまり重要です。 透過性単繊維技術の制限は、以下のものが挙げられます。これらのテストによって生成されたデータは、定義します実験装置に取り付けられた特定の筋原繊維ユニットの収縮特性。したがって、これは、セグメントが順番に、筋肉内の繊維の総数のごく一部を表す、取得された全体多核繊維のごく一部を捕捉します。研究者らは、このように、慎重に実験から引き出された任意の結論をサポートするために必要なサンプリングを検討する必要があります。さらに、繊維機能の運動トレーニングの介入の影響を評価する評価した繊維が実際にトレーニング中に動員されたことを前提としています。プロトコルは、繊維の自然な細胞内環境を模倣しようとしたが、筋細胞膜の透過化処理は、非特異的であり、必ずしも可溶性の細胞内成分が自由に入浴液中に拡散することができます。膜透過性のさらなる結果は、繊維体積33に腫脹によって証明浸透圧バランスの変化です。ザ繊維の膨潤は、筋フィラメントシステム34,35の減少カルシウム感受性の結果、アクチンとミオシンフィラメントの間の距離が大きくなりますが、大規模な、浸透活性化合物34の導入によって逆転させることができます。考慮すべき最後の制限は、実験装置に繊維を取り付けるために使用される技術の結果です。これは、常に機能欠損に出席して、取付点で近くフィラメントシステム内の空間的関係を歪める必要です。具体的には、時の繊維および取り付け点に隣接する領域は、機能的に侵害され、それによって、測定システムへの人為シリーズ弾性を貢献しています。 要約すると、我々は、 インビトロで化学的に透過性骨格筋線維の力発生能力を評価する手段を記載しています。この記事の焦点は、最大等尺性力の評価になっているがgeneratinヒト骨格筋線維gの容量、実験的なアプローチは、修飾された哺乳動物または他の種の範囲にわたって速度パラメータとの関係の多様を決定するために拡張することができます。

骨格筋の主要な機能は、力を生成することです。筋力は運動神経活動電位、神経筋伝達、筋線維の活動電位、細胞内カルシウムの放出、および規制と収縮タンパク質の系の活性化が含まれる事象の複雑なシーケンスをin vivoで誘発されます。力発生は、この配列の最終的な結果であるので、力の赤字は、個々のステップのうちの1つまたは複数の障害が原因で発生することが。透過処理繊維の準備の重要な属性は、筋原線維装置が残りに関連した唯一の規制および収縮機能を、in vivoでの力発生のために必要な手順のほとんどを排除することです。研究者は、カルシウムとエネルギー（ATP）を活性化の配信の制御を想定しており、それらの天然の共同で、単離された規制や収縮構造の評価を可能にする簡略化したシステムで報われますnfiguration。 in vivoで観察された筋機能の変化を評価する際に透過性骨格筋線維を用いた力の測定は、このように有用です。例えば、私たちは、ミオスタチン欠損マウス1から繊維の力発生能力を特徴づけるために持続的な筋力低下の原因を評価するためにこの技術を使用している慢性腱板涙2,3次を示しました。 現代の透過処理繊維の方法論は、初期の影響力の研究4,5にトレースし、多数の研究グループによって現在使用中であることができます。技術は、文献に記載されているが、それらはまだビデオフォーマットで提示されていません。この記事の目的は、化学的に透過性に骨格筋試料から単繊維の最大の力を発生する能力を測定するための更新、有効かつ信頼性の高い技術を説明することです。これを達成するために、個々の繊維セグメントは、（本明細書で言及しました̶0;繊維」）繊維のプレ透過性バンドルから抽出され、リラックスした溶液、&lt;10nmのカルシウム濃度となっている決定的な特徴を含む実験用チャンバ内に配置されています。繊維は、次に、力変換器の一方の端部と、長さ制御の他方の端部に取り付けられています。最適なサルコメア長で開催された繊維では、最大活性化し、それによって最大の等尺性収縮力を誘発するのに十分なカルシウム濃度を有する活性化溶液に移されます。力データは、取得された格納されたパーソナルコンピュータを用いて分析します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Polystyrene culture test tube with cap</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>14-956-3D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mL screw cap micocentrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>02-681-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mL microcentrifuge caps with o-ring</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>02-681-358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge cryobox</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>5055-5005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Mettler-Toledo</td>
			<td>FE20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>08-757-11YZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonsterile-suture 10-0 monofilament</td>
			<td>Ashaway Line Twine</td>
			<td>S30002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps - Dumont #5</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdissecting scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>MZ8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micrometer drives</td>
			<td>Parker Hannifin</td>
			<td>3936M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermometer</td>
			<td>Physitemp</td>
			<td>BAT-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath circulator&#160;</td>
			<td>Neslab Instruments</td>
			<td>RTE-111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Aplha Omega Instruments</td>
			<td>Series 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabVIEW software</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Varied</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber system</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td>802D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Length-controller</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td>312C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Force-transducer</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td>403A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-proprionate</td>
			<td>TCI America</td>
			<td>P0510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imadizole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#8226;6H20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brij 58</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA (acid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E0396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2H2ATP&#8226;0.56H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (acid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>529699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDTA (acid)</td>
			<td>TCI America</td>
			<td>D2019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaN3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH (1N)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>35113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCL (1N)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>318949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2CrP&#8226;4H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH 10 standard</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SB115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH 7 standard</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SB107</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of maximum isometric force generated by permeabilized skeletal muscle fibers

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle function at the level of the single muscle cell. Single muscle fiber studies are useful in both basic science and clinical studies. For basic studies, single muscle fiber contractility measurements allow investigation of fundamental mechanisms of force production, and analysis of muscle function in the context of genetic manipulations. Clinically, single muscle fiber studies provide useful insight into the impact of injury and disease on muscle function, and may be used to guide the understanding of muscular pathologies. In this video article we outline the steps required to prepare and isolate an individual skeletal muscle fiber segment, attach it to force-measuring apparatus, activate it to produce maximum isometric force, and estimate its cross-sectional area for the purpose of normalizing the force produced.

健康、化学的に透過性に単繊維の形状が均一に表示され、高倍率で見たときに、一貫した線条の間隔を持っている必要があります。鉗子で操作したときに柔軟性がないか、明らかな構造的損傷を持っている繊維は、廃棄されるべきです。 ステップ15の間に採取高倍率のデジタル画像は、繊維の中央部に沿って5対の直径の測定のために分析されます。繊維CSAは、 図7（a）に示すように楕円形の断面を仮定し、5個々のCSAの測定値を平均。 図7Bはまた、1つのビューの繊維寸法は、他のビューでペアリングの寸法と比較して有意に異なることができる方法を説明するのに役立つ（すなわち、クロス推定されていますセクション）は、一般的には、丸くなっていません。 人間の低速および高速の繊維からの代表的な力のトレースは、それぞれ、 図8Aおよび8Bに示されています。 VOLTAG力変換器の電子出力は、テスト中に取得され、データ収集および分析ソフトウェア（LabVIEWの）を使用して（Mn）を強制的に変換される。 図9は、減算することにより算出された最大活性力（F o を ） を評価するために使用する方法を示しれます最適な筋節長で繊維を維持するのに必要な力弛緩状態にある間に（受動的な力、F P）、最大繊維活性化の間に開発され、最大等尺力（合力、F T）から。ゼロの力に対応する力変換器の出力は、一般的に、別の入浴室の各々のために異なるので、我々は簡単で、ゼロ力レベルを捕捉するために、両方のプレ活性化し、活性化溶液中で繊維を緩め実験記録。繊維CSAによる最大活性力の正規化は、特定の力（SF 0）のより有益な値を生成するために使用されます。それは考慮に入れ、繊維のCSAがかかるので、SFのO </sUB&gt;これにより、異なるサイズの繊維との間の機能の比較を可能にする、繊維の収縮装置の固有の力発生能力の尺度を提供します。しかしながら、CSAの測定は、他の細胞内構造占める割合対収縮フィラメントにより占有繊維の割合を区別することができないことに留意すべきです。 クラフリンらから健康な成人の繊維の代表的な特性。人間のために2011年10、Mendias らマウスとGumucio ら 2011 1。ラットの2012年2 表3に示すデータはすべて使用して生成された表3に詳述されています。この資料に記載された技術。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="text-align:center"><tbody><tr><td rowspan="3" style="border:0px #fff solid"></td><td colspan="4"> 人間 （外側広筋） </stronG&gt; </td><td> マウス （EDL） </td><td nowrap="nowrap"> ラット （棘） </td></tr><tr><td colspan="2">男性</td><td colspan="2">女性</td><td>男性</td><td>男性</td></tr><tr><td>タイプ1 </td><td>タイプ2A </td><td>タイプ1 </td><td>タイプ2A </td><td> （型付きではありません） </td><td> （型付きではありません） </td></tr><tr><td> CSA（μmの2） </td><td> 6900 - 4880 </td><td> 8380 - 5270 </td><td> 5470 - 3870 </td><td> 5610 - 4010 </td><td> 3080 - 1850 </td><td> 8010 - 5290 </td></tr><tr><td> FのO（MN） </td><td> 0.79から1.17 </td><td> 1.02から1.54 </td><td> 0.64から0.97 </td><td> 0.71から1.07 </td><td> 0.14から0.25 </td><td> 0.55から0.97 </td></tr><tr><td> SFのO（キロパスカル） </td><td> 142から182 </td><td> 165から210 </td><td> 156から193 </td><td> 172から214 </td><td> 67から94 </td><td> 102から131 </td></tr><tr><td> N </td><td> 129 </td><td> 160 </td><td> 149 </td><td> 207 </td><td> 37 </td><td> 94 </td></tr></tbody></table> 人間広筋からの健康な成人の繊維の表3.一般的な特性は10 lateralis、マウス長指伸筋1およびラット棘は2筋肉。最適な筋節の長さは、両方のマウスのためのヒト繊維7,8 2.7ミクロンと2.5ミクロン（36に設定しました37）およびラット繊維（38）。実験L Fの範囲 （25 番目と75 番目の四分位数）は、それぞれ1.39〜1.73ミリメートル、1.17〜1.53ミリメートルとヒト、マウス、ラットのための1.32〜1.59ミリメートルでした。示された範囲は、25 番目と75 番目の四分位数を示し、nは試験された繊維の数です。 テスト中に経験した最も一般的な問題は、力RESPONSになる縫合糸ループスリップを含み、このような図10（a）に示すような「キャッチ」し、急に向かってまたは（中断）に戻る力応答をもたらす繊維の部分的または完全な厚さの涙、ゼロの電子繊維はまだ解決策を活性化中に浸漬されている間（ 図10B）。スリップ、涙やブレークが実験中に発生した場合、繊維の失敗の記録を維持することも11有益であることができるが、繊維が破棄されるべきであり、データは除外しました。発生する可能性のある他の否定的な結果は、事前活性化溶液（ 図10C）にある間に繊維の早期活性化です。予備活性化溶液中の部分的な活性化は、（ すなわち、中のカルシウム濃度の意図しない上昇よくプレ活性化）有意な交差ウェル汚染を示唆しています。この例では、すべての浴は、吸引されるべきであり、脱イオン水で十分にすすぎました。チャンバ間の分割面を乾燥することもrecommenですこれらの領域中の水分や結露などのDEDは風呂の間、溶液のウィッキングにつながる可能性があります。データを含めるか除外するかどうかは、最終的には実験的な焦点に依存し、調査を設計する際にこのように考慮されるべきです。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig1.jpg" /> 図1：縫合糸ループ（10-0モノフィラメントナイロン縫合糸）。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig2.jpg" /> 図2：バンドル切開鉗子は左手にあるが、顕微解剖はさみは右手にあります。赤い線は、繊維の縦軸と手首とはさみの良好な姿勢を示しています。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig3.jpg" /> 図3： </stron標識されたコンポーネントとG&gt;（A）試験装置。 （a）は、透明な底部との実験室。 （b）は長さコントローラ。 （C）フォース·トランスデューサ。 （d）の光源。デジタル表示（e）の長さコントローラのxyzマイクロドライブ。デジタル表示（F）ステージマイクロドライブ。 （G）フォーストランスデューサのxyzマイクロドライブ。 （H）に較正レーザー回折ターゲットスクリーンのためのプラットフォーム。 （I）除振台。 （B）は、実験室のクローズアップビュー。 （j）の長コントローラから延びるステンレス取付面。 （k）は 、力変換器から延びるステンレス取付面。 （L）サイドビュープリズム。 （m）は 、熱電冷却モジュール用ハウジング。室TEを報告するための（n）の熱電対mperature。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig4.jpg" /> 図4：実験室に解剖皿から繊維を転送するために使用される改変された100μlのピペットチップ。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig5.jpg" /> 図5：実験装置の上に単繊維のマ ​​ウント（A）を調製した縫合糸ループは、ステンレス製の取付面にねじ込ま。 （B）光ファイバは、実験室に移しました。 （C）光ファイバを除去し、過剰な縫合糸で縫合糸ループの最初のペアによってステンレス鋼取付面に固定します。縫合糸ループの（D）第二の対は、第1の縫合糸ループの上にねじ山及び場所に結びました。 <img alt="図6"SRC = &quot;/ファイル/ ftp_upload / 52695 / 52695fig6.jpg&quot; /&gt; 図6：サルコメア長さを較正ターゲットスクリーン上にレーザー干渉パターンを投影することによって評価される（a）は、レーザ光 ​​源。 （b）のミラー。 （c）の画面を対象とします。 （d）のレーザー干渉パターン。 <img alt="図7A" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig7A.jpg" /><img alt="図7B" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig7B.jpg" /> 図7：最適な筋節長（人間= 2.7ミクロン）で繊維断面積の（A）決意。楕円形の断面を想定すると、CSAは、繊維中央部に沿って5箇所のそれぞれについて計算され、5個々の測定値の平均を繊維CSAとして報告されます。図2aは、トップビューの直径を表し、あります<html>楕円の一方の軸は、図​​2（b）は側面直径を表し、楕円の他方の軸です。 （B）は上面と側面の両方で撮影した5相当径測定のそれぞれを示す代表的なファイバ像。 <img alt="図8" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig8.jpg" /> 図8：健康なヒト外側広筋からの代表的な力トレースは筋線維をlateralis（A）1繊維（CSA：5710μm2で、FのO：0.89 MnおよびSFのO：156キロパスカル）を入力します。。 （B）は図2（a）繊維（：9510μm2で、F O：1.66 MnおよびSFのO：174キロパスカルCSA）を入力します。繊維ミオシン重鎖タイプは、電気泳動分離及び銀染色技術22を使用することによって決定しました。 OAD / 52695 / 52695fig9.jpg &quot;/&gt; 図9：最大活性力（F 0）の計算前活性化溶液中に開始長コントローラのたるみ誘導移動中の繊維の力応答の（a）の拡大図。 F Pは、安静時に繊維と2.7ミクロンの筋節の長さを維持するために必要な力です。 （b）は長さコントローラたるみ誘導運動の拡大図。 F P -そのF 0 = F Tに注意してください。 <img alt="図10" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig10.jpg" /> 図10：力の立ち上がり時に力トレースで「キャッチ」によって証明（A）縫合糸ループスリップ、。ループは、繊維を活性化する前に、安全であるかどうかを確認してください。 （B）活性化中の繊維の休憩。縫合糸ループの場所の間に乏しい繊維の完全性や積極的な繊維処理が原因である可能性がありメント。原因のCa 2+とのプレ活性化チャンバーの汚染を（C）早期の部分的な繊維の活性化。

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Measurement of Maximum Isometric Force Generated by Permeabilized Skeletal Muscle Fibers

化学的に皮を剥がれ、または透過化、骨格筋線維の収縮特性の分析は、単一の筋細胞のレベルでの筋機能を評価することにより、強力な手段を提供しています。この記事では、製造するのに有効かつ信頼性の高い技術の概要を説明し、試験は、in vitroでの骨格筋線維を透過処理しました。

透過性に骨格筋線維によって生成される最大等尺性力の測定

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle ...

measurement-maximum-isometric-force-generated-permeabilized-skeletal

Research

JoVE Journal

Bioengineering

25.1K ビュー.  University of Michigan Medical School. 化学的に皮を剥がれ、または透過化、骨格筋線維の収縮特性の分析は、単一の筋細胞のレベルでの筋機能を評価することにより、強力な手段を提供しています。この記事では、製造するのに有効かつ信頼性の高い技術の概要を説明し、試験は、in vitroでの骨格筋線維を透過処理しました。 

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Measurement of Aggregate Cohesion by Tissue Surface Tensiometry

Rigorous measurement of intercellular binding energy can only be made using methods grounded in thermodynamic principles in systems at equilibrium. We have developed tissue surface tensiometry (TST) specifically to measure the surface free energy of interaction between cells. The biophysical concepts underlying TST have been previously described in detail1,2. The method is based on the observation that mutually cohesive cells, if maintained in shaking culture, will spontaneously assemble into clusters. Over time, these clusters will round up to form spheres. This rounding-up behavior mimics the behavior characteristic of liquid systems. Intercellular binding energy is measured by compressing spherical aggregates between parallel plates in a custom-designed tissue surface tensiometer. The same mathematical equation used to measure the surface tension of a liquid droplet is used to measure surface tension of 3D tissue-like spherical aggregates. The cellular equivalent of liquid surface tension is intercellular binding energy, or more generally, tissue cohesivity. Previous studies from our laboratory have shown that tissue surface tension (1) predicts how two groups of embryonic cells will interact with one another1-5, (2) can strongly influence the ability of tissues to interact with biomaterials6, (3) can be altered not only through direct manipulation of cadherin-based intercellular cohesion7, but also by manipulation of key ECM molecules such as FN8-11 and 4) correlates with invasive potential of lung cancer12, fibrosarcoma13, brain tumor14 and prostate tumor cell lines15. In this article we will describe the apparatus, detail the steps required to generate spheroids, to load the spheroids into the tensiometer chamber, to initiate aggregate compression, and to analyze and validate the tissue surface tension measurements generated.

We describe a method of measuring binding energy, expressible as tissue surface tension, between cells within 3D tissue-like aggregates. Differences in tissue surface tension have been demonstrated to correlate with invasiveness of lung, muscle, and brain tumors, and are fundamental determinants of establishing spatial relationships between different cell types.

組織の表面張力測定ごとの集計凝集力の測定

Rigorous measurement of intercellular binding energy can only be made using methods grounded in thermodynamic principles in systems at equilibrium.  We ...

生物工学

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface. It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid environment, without the need to chemically treat the sample. In order to accomplish this goal, the sample must sufficiently adhere to the mounting surface to prevent removal by forces exerted by the scanning AFM cantilever tip. In many instances, successful imaging depends on immobilization of the sample to the mounting surface. Optimally, immobilization should be minimally invasive to the sample such that metabolic processes and functional attributes are not compromised. By coating freshly cleaved mica surfaces with porcine (pig) gelatin, negatively charged bacteria can be immobilized on the surface and imaged in liquid by AFM. Immobilization of bacterial cells on gelatin-coated mica is most likely due to electrostatic interaction between the negatively charged bacteria and the positively charged gelatin. Several factors can interfere with bacterial immobilization, including chemical constituents of the liquid in which the bacteria are suspended, the incubation time of the bacteria on the gelatin coated mica, surface characteristics of the bacterial strain and the medium in which the bacteria are imaged. Overall, the use of gelatin-coated mica is found to be generally applicable for imaging microbial cells.

Live Gram-negative and Gram-positive bacteria can be immobilized on gelatin-coated mica and imaged in liquid using Atomic Force Microscopy (AFM).

原子間力顕微鏡によるイメージングのための細菌の固定化

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to study pressure ulcers, for regenerative medicine and as a meat alternative 1. The first reported 3D muscle constructs have been made many years ago and pioneers in the field are Vandenburgh and colleagues 2,3. Advances made in muscle tissue engineering are not only the result from the vast gain in knowledge of biochemical factors, stem cells and progenitor cells, but are in particular based on insights gained by researchers that physical factors play essential roles in the control of cell behavior and tissue development. State-of-the-art engineered muscle constructs currently consist of cell-populated hydrogel constructs. In our lab these generally consist of murine myoblast progenitor cells, isolated from murine hind limb muscles or a murine myoblast cell line C2C12, mixed with a mixture of collagen/Matrigel and plated between two anchoring points, mimicking the muscle ligaments. Other cells may be considered as well, e.g. alternative cell lines such as L6 rat myoblasts 4, neonatal muscle derived progenitor cells 5, cells derived from adult muscle tissues from other species such as human 6 or even induced pluripotent stem cells (iPS cells) 7. Cell contractility causes alignment of the cells along the long axis of the construct 8,9 and differentiation of the muscle progenitor cells after approximately one week of culture. Moreover, the application of electrical stimulation can enhance the process of differentiation to some extent 8. Because of its limited size (8 x 2 x 0.5 mm) the complete tissue can be analyzed using confocal microscopy to monitor e.g. viability, differentiation and cell alignment. Depending on the specific application the requirements for the engineered muscle tissue will vary; e.g. use for regenerative medicine requires the up scaling of tissue size and vascularization, while to serve as a meat alternative translation to other species is necessary.

Engineered muscle tissue has great potential in regenerative medicine, as disease model and also as an alternative source for meat. Here we describe the engineering of a muscle construct, in this case from mouse myoblast progenitor cells, and the stimulation by electrical pulses.

電気刺激のマウス筋芽細胞前駆細胞およびアプリケーションからの工学骨格筋組織

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to ...

Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) antibody conjugated latex beads have been utilized to create a biosensor designed for discrimination of methicillin resistant (MRSA) and sensitive (MSSA) S. aureus species 1,2. The lytic phages have been converted into phage spheroids by contact with water-chloroform interface. Phage spheroid monolayers have been moved onto a biosensor surface by Langmuir-Blodgett (LB) technique 3. The created biosensors have been examined by a quartz crystal microbalance with dissipation tracking (QCM-D) to evaluate bacteria-phage interactions. Bacteria-spheroid interactions led to reduced resonance frequency and a rise in dissipation energy for both MRSA and MSSA strains. After the bacterial binding, these sensors have been further exposed to the penicillin-binding protein antibody latex beads. Sensors analyzed with MRSA responded to PBP 2a antibody beads; although sensors inspected with MSSA gave no response. This experimental distinction determines an unambiguous discrimination between methicillin resistant and sensitive S. aureus strains. Equally bound and unbound bacteriophages suppress bacterial growth on surfaces and in water suspensions. Once lytic phages are changed into spheroids, they retain their strong lytic activity and show high bacterial capture capability. The phage and phage spheroids can be utilized for testing and sterilization of antibiotic resistant microorganisms. Other applications may include use in bacteriophage therapy and antimicrobial surfaces.

Lytic phage biosensors and antibody beads are able to discriminate between methicillin resistant (MRSA) and sensitive staphylococcus bacteria. The phages were immobilized by a Langmuir-Blodgett method onto a surface of a quartz crystal microbalance sensor and worked as broad range staphylococcus probes. Antibody beads recognize MRSA.

抗生物質耐性ブドウ球菌の細菌の検出のためのバイオセンサー

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) ...

Preparation of Light-responsive Membranes by a Combined Surface Grafting and Postmodification Process

In order to modify the surface tension of commercial available track-edged polymer membranes, a procedure of surface-initiated polymerization is presented. The polymerization from the membrane surface is induced by plasma treatment of the membrane, followed by reacting the membrane surface with a methanolic solution of 2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA). Special attention is given to the process parameters for the plasma treatment prior to the polymerization on the surface. For example, the influence of the plasma-treatment on different types of membranes (e.g.&#160;polyester, polycarbonate, polyvinylidene fluoride) is studied. Furthermore, the time-dependent stability of the surface-grafted membranes is shown by contact angle measurements. When grafting poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (PHEMA) in this way, the surface can be further modified by esterification of the alcohol moiety of the polymer with a carboxylic acid function of the desired substance. These reactions can therefore be used for the functionalization of the membrane surface. For example, the surface tension of the membrane can be changed or a desired functionality as the presented light-responsiveness can be inserted. This is demonstrated by reacting PHEMA with a carboxylic acid functionalized spirobenzopyran unit which leads to a light-responsive membrane. The choice of solvent plays a major role in the postmodification step and is discussed in more detail in this paper. The permeability measurements of such functionalized membranes are performed using a Franz cell with an external light source. By changing the wavelength of the light from the visible to the UV-range, a change of permeability of aqueous caffeine solutions is observed.

A plasma-induced polymerization procedure is described for the surface-initiated polymerization on polymer membranes. Further postmodification of the grafted polymer with photochromic substances is presented with a protocol of conducting permeability measurements of light-responsive membranes.

複合表面グラフトと後置修飾法による光応答膜の調製

In order to modify the surface tension of commercial available track-edged polymer membranes, a procedure of surface-initiated polymerization is ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. Kelvin probe force microscopy (KPFM) is a module of atomic force microscopy (AFM) that measures the contact potential difference between surfaces at the nano-scale. The combination of KPFM with AFM allows for the simultaneous generation of surface potential and topographical maps of biological samples such as bacterial cells. Here, we employ KPFM to examine the effects of surface potential on microbial adhesion to medically relevant surfaces such as stainless steel and gold. Surface potential maps revealed differences in surface potential for microbial membranes on different material substrates. A step-height graph was generated to show the difference in surface potential at a boundary area between the substrate surface and microorganisms. Changes in cellular membrane surface potential have been linked with changes in cellular metabolism and motility. Therefore, KPFM represents a powerful tool that can be utilized to examine the changes of microbial membrane surface potential upon adhesion to various substrate surfaces. In this study, we demonstrate the procedure to characterize the surface potential of individual methicillin-resistant Staphylococcus aureus USA100 cells on stainless steel and gold using KPFM.

Here, we present a protocol explaining the use of Kelvin probe force microscopy as a tool for generating high resolution nano-scale surface potential maps. This tool was applied to assess the role of surface potential on the binding capacity of microorganisms to substrate surfaces.

ケルビンプローブフォース顕微鏡を用いて細菌の表面電位測定

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM)

Exosomes are microvesicular structures that play a mediating role in intercellular communication. It is of interest to study the internal cargo of exosomes to determine if they carry disease discriminatory biomarkers. For performing exosomal analysis, it is necessary to develop a method for extracting and analyzing exosomes from target biofluids without damaging the internal content.
Electric field-induced release and measurement (EFIRM) is a method for specifically extracting exosomes from biofluids, unloading their cargo, and testing their internal RNA/protein content. Using an anti-human CD63 specific antibody magnetic microparticle, exosomes are first precipitated from biofluids. Following extraction, low-voltage electric cyclic square waves (CSW) are applied to disrupt the vesicular membrane and cause cargo unloading. The content of the exosome is hybridized to DNA primers or antibodies immobilized on an electrode surface for quantification of molecular content.
The EFIRM method is advantageous for extraction of exosomes and unloading cargo for analysis without lysis buffer. This method is capable of performing specific detection of both RNA and protein biomarker targets in the exosome. EFIRM extracts exosomes specifically based on their surface markers as opposed to size-based techniques.
Transmission electron microscopy (TEM) and assay demonstrate the functionality of the method for exosome capture and analysis. The EFIRM method was applied to exosomal analysis of 9 mice injected with human lung cancer H640 cells (a cell line transfected to express the exosome marker human CD63-GFP) in order to test their exosome profile against 11 mice receiving saline controls. Elevated levels of exosomal biomarkers (reference gene GAPDH and protein surface marker human CD63-GFP) were found for the H640 injected mice in both serum and saliva samples. Furthermore, saliva and serum samples were demonstrated to have linearity (R = 0.79). These results are suggestive for the viability of salivary exosome biomarkers for detection of distal diseases.

Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement EFIRM

Exosomes are microvesicular structures found within biofluids that potentially carry important disease discriminatory biomarkers. Here, a novel method is used to specifically extract exosomes and rapidly test the exosomal cargo for both RNA/protein targets following the disruption of exosomes using non-uniform electric cyclic square waves.

電界誘起リリースおよび測定によるエキソソームのバイオマーカーの検出（EFIRM）

Exosomes are microvesicular structures that play a mediating role in intercellular communication. It is of interest to study the internal cargo of ...

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from traumatic injury, disease and various congenital, genetic and acquired conditions are quite common. Tissue engineering and regenerative medicine technologies have enormous potential to provide a therapeutic solution. However, utilization of biologically relevant animal models in combination with longitudinal assessments of pertinent functional measures are critical to the development of improved regenerative therapeutics for treatment of VML-like injuries. In that regard, a commercial muscle lever system can be used to measure length, tension, force and velocity parameters in skeletal muscle. We used this system, in conjunction with a high power, bi-phase stimulator, to measure in vivo force production in response to activation of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. We have previously used this equipment to assess the functional impact of VML injury on the tibialis anterior (TA) muscle, as well as the extent of functional recovery following treatment of the injured TA muscle with our tissue engineered muscle repair (TEMR) technology. For such studies, the left foot of an anaesthetized rat is securely anchored to a footplate linked to a servomotor, and the common peroneal nerve is stimulated by two percutaneous needle electrodes to elicit muscle contraction and dorsiflexion of the foot. The peroneal nerve stimulation-induced muscle contraction is measured over a range of stimulation frequencies (1-200 Hz), to ensure an eventual plateau in force production that allows for an accurate determination of peak tetanic force. In addition to evaluation of the extent of VML injury as well as the degree of functional recovery following treatment, this methodology can be easily applied to study diverse aspects of muscle physiology and pathophysiology. Such an approach should assist with the more rational development of improved therapeutics for muscle repair and regeneration.

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

We describe an in vivo protocol to measure dorsiflexion of the foot following stimulation of the peroneal nerve and contraction of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. Such measurements are an indispensable translational tool for evaluating skeletal muscle pathology and tissue engineering approaches to muscle repair and regeneration.

の応用<em&gt;インビボ</em組織工学骨格筋の修復を評価するためのラット前脛骨の&gt;機能テスト

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from ...

Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called mechanotransduction. A crucial step in mechanotransduction is the transmission of forces between the external and internal environments. To transmit forces, there must be a sustained, unbroken physical linkage created by a series of protein-protein interactions. For a given protein-protein interaction, mechanical load can either have no effect on the interaction, lead to faster disassociation of the interaction, or even stabilize the interaction. Understanding how molecular load dictates protein turnover in living cells can provide valuable information about the mechanical state of a protein, in turn elucidating its role in mechanotransduction. Existing techniques for measuring force-sensitive protein dynamics either lack direct measurements of protein load or rely on the measurements performed outside of the cellular context. Here, we describe a protocol for the F&#246;rster resonance energy transfer-fluorescence recovery after photobleaching (FRET-FRAP) technique, which enables the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells. This technique is potentially applicable to any FRET-based tension sensor, facilitating the study of force-sensitive protein dynamics in variety of subcellular structures and in different cell types.

Here, we present a protocol for the simultaneous use of F&#246;rster resonance energy transfer-based tension sensors to measure protein load and fluorescence recovery after photobleaching to measure protein dynamics enabling the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells.

蛍光技術の組み合わせを用いた生細胞内力感受性タンパク質ダイナミクスの測定

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.