この作品は、ポール·D Wellstone共同研究センター（AR052646）によってサポートされていました。

すべての手順は、ペンシルベニア大学の動物実験委員会によって審査され、承認されています。 1。 EDLの解剖と準備（約30分） <ol><li>彼らは処置中は痛みや苦痛を経験しないことを保証するためにマウスを麻酔しますが、筋肉が十分に循環させることによって酸素化のままにしておくこと。我々は日常的にIPを介して注入されたケタミン/キシラジンカクテル（100/10 mg / kg）を使用しています。麻酔の手術面は完全ペダルやpalpedral撤退反射の欠如、または耳の攣縮反応の欠如によって決定されます。 </li><li>医療用テープを使用して、後肢を固定し、この領域の筋肉を露出させるために下顎後肢の皮膚を取り除きます。一定の間隔で、PBSのアプリケーションと筋肉の潤いを保つ。 </li><li>解剖スコープ]で、EDL筋の近位腱を露出させるために、膝に横に小さな切開を行います。そこに、この領域内の2つの腱があり、両方を再有効にするためにカットする必要がありますEDLのmoval。 </li><li>内側の足首に、 メタtarsalsに沿って延びているEDLの遠位腱を露出させ、TAの筋肉の腱を切った。 EDLの下をカットしたり、触れないように注意しながら、道のTAの筋肉を持ち上げます。 、EDLの遠位腱に戻るスニップ各1、その後腱を把握し、足首を介してそれらを描き、そっと手足の残りの部分から離れてEDLを引き出します。それは自由に近位端から離し、そうでない場合、腱が切断されたことを確認するために横切開に戻るべきである。チルド酸素リンガーでいっぱい解剖皿に筋肉や場所を削除します。 生体内で見つかった長さである約休憩長で腱、筋肉をピン。長さは、筋肉が筋肉は解剖ピンを引っ張っている場合皿に弛緩し、長すぎる場合には短すぎる。 </li><li>頸椎脱臼による筋除去直後にマウスを安楽死させる。 </li><li> 10に縫合糸を結ぶドンズ、できるだけ近くの筋肉にしますが、筋肉に触れていない。約縫合糸を使用して長さを休んで筋肉をピン。 </li></ol> 2。ダイヤフラム解剖と準備（約30分） <ol><li>同じマウスを頸椎脱臼で確認続く解剖、あるいはCO 2の両方を受けた場合には、麻酔下頚椎脱臼により前に、この手順にマウスを安楽死させる。 </li><li>腹部や胸部空洞を公開するために皮膚切開を加えます。腹腔を開き、ちょうど肋骨下の体壁を切った。骨のはさみを使用して、ダイヤフラムの上に挿入開始、リブのラインに続く胸郭全体の周りにカットし、背骨を切って。ダイアフラムが容易に除去することができるように横隔膜の中心を通る血管を切った。 </li><li>マウスからダイアフラムを外し、酸素リンガーズでいっぱい解剖皿に置きます。優しくdiapを扇動血を洗い流すための皿の中でhragm。必要に応じてリフレッシュ液をリンゲル。 </li><li>横hemidiaphragmsの中央部における繊維の配向に沿って腱中心から肋骨横隔膜の小さなストリップをカット。ストリップは広い2〜4ミリメートルの間でなければなりません。骨のはさみを使用して、ダイヤフラムストリップの両側にリブの約1〜2 mmのオーバーハングを残して、ストリップの両側にリブをカット。 </li><li>腱中心に縫合糸を結ぶ。横方向に突き出たリブ側にそれぞれ縫合糸を結び、その後の大きなループを作るために一緒にこれらを結ぶ。 </li><li>二つのストリップは、任意のダイヤフラム（各側から1）から取得することができます。 </li></ol> 3。力学バースの取り付け筋肉<ol><li>縫合糸をつかみ、一方の端部に剛性のポストに筋肉を付けるために、これらを使用し、もう一方の端に力変換器に。 </li><li>筋肉がたるんではありませんが、ピンと張っていないことを確認するために長さを調整します。良い近似が休憩MUSCです1.4のように、leの長さ - 1.5。 </li><li>浴°Cはテストのために筋肉の安定性を延ばすために22で維持酸素化リンゲル液で満たされるべきである。その筋肉の温度が22℃に戻したので、筋肉が前に機能テストにこの浴中で5分間休むべき</li></ol> 4。等尺性収縮<ol><li>最大上刺激条件を確立します。筋肉が風呂に配置された後、けいれんを生成するために、単一の0.5ミリ秒の刺激パルスを使用し、力の出力を監視します。力が最大ではあるが着実なレベルになるまで徐々に電流を増加させる。残りの実験のために、このレベルより10％以上の電流は増加します。 </li><li>最適な長さを確立します。最大の力が得られるまでアイソメトリック筋の刺激を用いて、徐々に筋肉の長さを調整します。各収縮の間に筋肉〜10秒を休ませてください。収縮力が最大になるときに最適な筋肉の長さ（L o）が達成されます。レコード筋肉の長さ（長さノギスを使用して、EDLのため、リブの中心腱myotendinousジャンクショ​​ンと筋肉の間に挿入myotendinous接合）トゥイーン。 </li><li>最大等尺性強縮フォース。最大上刺激で0.5ミリ秒のパルスのシリーズとと融合周波数（周波数、力関係（ 例えば Refの高原からで、500ミリ秒の期間L Oに設定した筋肉を刺激する：8）EDL筋肉のプラトーがある典型的には120 Hzの、100 Hzの横隔膜の筋肉のために達成しました。あらゆる筋肉の刺激の試合の間に5分の休憩時間に、それぞれの周波数で3回を刺激する。 </li></ol> 5。エキセントリック収縮<ol><li>筋肉はアイソメトリックとエキセントリック収縮を実行する間に5分を休ませることができます。 </li><li>最後の200ミリ秒の刺激で10％L Oストレッチ （0.5L oの伸び率が続く最初の500ミリ、等尺用80 Hzで筋肉を刺激/秒）。 </li><li>エキセントリック収縮の必要な数の間に5分休符と刺激パターンを繰り返します。 </li><li>ストレッチの前に期間中の各収縮力を測定する。最初と最後の間の収縮力の低下を計算します。 </li></ol> 6。装置からの筋肉の取り外し<ol><li>トランスデューサからの筋肉の穏やかな除去を可能にし、投稿し、リンガーと解剖皿にそれを戻すために、筋肉の長さを短くしてください。 </li><li>筋肉から縫合糸を外します。 </li><li> EDLの筋肉は、筋肉を二回ブロット、その後の処理（ 例えば凍結、固定など）の前に、それを重量を量る。これは、断面積、および特定の力を計算するために重要となるであろう。 </li><li>横隔膜筋の場合、0.1％プロシオンオレンジ、15〜20分間、膜透過性の染料に浸します。これは解剖損傷の指標を提供します。 </li><li>離れて骨の挿入から筋肉だけでなく、セントを解剖するRAL腱。これは、筋肉の正確な重量を提供することが必要である。体重とその後の準備の前に上記のように吸い取る。 </li><li>断面積（CSA）をクロス計算します。 CSA（㎜2）=質量（mg）/ [（L Oミリメートル）*（L / L○）*（1.06ミリグラム/ mm 3の ）] ここで、L / L、Oは、筋肉の長さの比（EDL、ダイヤフラムの1.0の0.45）5〜繊維であり、1.06は、筋肉の密度である。 </li></ol>

<ol>
	<li>Barton, E. R., Khurana, T. S., Lynch, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+isometric+force+of+isolated+mouse+muscles+in+vitro.">Measuring isometric force of isolated mouse muscles in vitro.</a> TREAT-NMD. , (2008).</li><li>Barton, E. R., Morris, L., Musaro, A., Rosenthal, N., Sweeney, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle-specific+expression+of+insulin-like+growth+factor+I+counters+muscle+decline+in+mdx+mice.">Muscle-specific expression of insulin-like growth factor I counters muscle decline in mdx mice.</a> J. Cell Biol. 157, 137-148 (2002).</li><li>Barton, E. R., Morris, L., Kawana, M., Bish, L. 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B., Maguire, H. C., Panettieri, R. A., Petrof, B., Narusawa, M., Leferovich, J. M., Sladky, J. T., Kelly, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mdx+mouse+diaphragm+reproduces+the+degenerative+changes+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">The mdx mouse diaphragm reproduces the degenerative changes of Duchenne muscular dystrophy.</a> Nature. 352, 536-539 (1991).</li><li>Welch, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTC124+targets+genetic+disorders+caused+by+nonsense+mutations.">PTC124 targets genetic disorders caused by nonsense mutations.</a> Nature. 447 (7140), 87-91 (2007).</li></ol>

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EDL及びダイアフラム - この記事の目的は、マウスから2筋に孤立筋肉の機能を実行するための指針を提供することである。これらの筋肉の評価は、筋肉疾患の治療薬候補が有益であるか否かについての洞察を提供することができます。両方の筋肉のために、堅牢なデータを得るための重要な要因は、クリーン解剖です。したがって、初期分離ステップを練習し、完成すると、機能テストに移る前に、必要不可欠である。また、通常の筋肉のために機能的なベンチマークを確立することはジストロフィー筋へ、または治療間の比較を行う前に重要です。これは研究結果は、実験を行う人の能力によって与えられる高い変動の対象にはなりませんことが保証されます。膜透過性色素の使用は、染料を含む溶液中で、任意の筋肉のインキュベーションは、ほとんど損傷を受けた繊維をマークしますが、dの指標として役立つことができるため、解剖の準備を最適化することを支援することができますissection成功。筋肉で損傷繊維の数を最小限に抑えることにより、測定を最適化するのに役立ちます。解剖によって損傷繊維が伸張性収縮によって損傷したものよりもはるかに明るく蛍光を発すると、染料はまた力学プロセスの間に使用されていたら、人はダメージの2つのタイプを区別するために、色素の強度を使用することができます。 ダイアフラムストリップの解離はほぼ必ず、繊維の長さ方向に沿って切断することにより、いくつかは必然的に破壊さという理由だけで、繊維の損傷を持つことになります。色素の取り込みは、これらの破損した繊維で強力であり、これらは通常、準備の外縁に制限されています。平均的に、我々は、筋条片の両側に幅約3繊維（〜120μm）であり、破損した繊維のバンドを観察します。損傷したバンドは筋肉の15％以上を含む場合、そのデータは破棄されます。横隔膜標本は、機能の対策の最適なサイズ上の制約があります。我々は、dの部分ことを発見した腱中心のタイは一点のみであるため、5ミリメートルより広いiaphragmは、自分自身に畳むし始める。この結果は、準備のために特定の力を減少させた。我々はまた、狭いストリップはまた、我々は解剖中に破損した繊維の数字は総繊維数の大きな割合を含んでいるためであると考えて下の特定の力を持っていることを発見した。例えば、それぞれの側に0.1ミリメートルが破損している場合、それは、強制的に寄与しない筋標本の5％（2x0.1ミリメートル/ 4ミリメートルストリップ）であるのに対し、ストリップはその後わずか1mm、20の場合筋標本の％が損傷しています。したがって、損傷領域の幅だけでなく、製剤全体の幅の両方を制御するための重要な要因である。 最大等尺性張力の測定は、筋肉内のすべての筋線維が刺激されている必要があります。機能装置の部品の大幅な変動があるので、これは個々のセットのために決定されなければならないアップ。たとえば、お風呂の大きさや刺激の種類は刺激の強度に影響を与えることができる。単収縮刺激は最大上刺激条件を決定するために合理的な方法です。これは特定のセットアップや筋肉のために確立されると、それは、その後の研究のために利用することができる。 これとは対照的に、任意の筋肉の最適な長さは、上記の反復プロセスを使用して、各調製のために測定する必要があります。このことは、厚いと薄いフィラメントの重なりが最適であると発電容量を最大の潜在的な力が測定されることを保証します。代替手順は、筋肉の横紋に関連付けられた回折パターンに依存することができますが、これはここで説明されていない追加の機器が必要です。 我々は日常的にこの分野における他の研究者によって使用され、このパラメータの真ん中範囲内500ミリ秒の刺激の持続時間を使用します。これは明らかである収縮、筋肉の中にいくつかの疲労を引き起こすかもしれませんが最大の力生産の &quot;ダレ&quot;で、これ自体は有益なことができます。例えば、疲労の差が故にアクティブ収縮時の力のたるみは改善のための指標となることができ、その目標カルシウム処理も含めて治療法の異なる種類によって達成することができる。あるいは、力の損失は腱に縫合糸は十分なタイトではないことを示している、と彼らは収縮時に滑っていることでした。筋肉を浴から除去されなければならない、これが発生した場合の縫合糸は、再接続する必要があります。我々はまた、製剤の安定性を評価するのに役立ち3テタヌス収縮のシリーズを使用しています。繰り返しになりますが、縫合スリップは再抱き合わせ縫合を必要と収縮との間の力の喪失につながる。大きな筋肉は、プロトコルの間の力の損失につながる無酸素コアを生成することができる。筋肉のサイズが20より大きい質量を持つEDL筋肉がミリグラム各contracと力を失い孤立した筋機能テストを実行するための制限要因であるると、浴中の灌流でサポートすることはできません。彼らは風呂で長時間生存能力を持つのに十分薄いためダイヤフラムストリップは同じ合併症で苦しむことはない。 他の筋肉は一般的に使用されるが、ここで説明されていないヒラメ筋など、孤立した筋機能のために利用することができます。同じ手順の多くは、準備と機能テストの面でヒラメを採用することができる。しかし、主な相違点は、刺激周波数にあり、エキセントリック収縮のためのパラメータ。関数のヒラメを使用する他の二つの筋肉のことは、補完するものであり、従ってそれはジストロフィーマウス4,7を評価するための&quot;標準パッケージ&quot;の一部として考慮されるべきである。 エキセントリック収縮は、収縮もろさの指標を提供します、そして、それは野生動物からの筋肉の力のささやかな損失との力の大幅な損失をもたらしているプロトコルを使用することが重要です。比較のため、広いダイナミックレンジがあるように未処理ジストロフィー筋。通常の筋肉内の任意の力の損失の欠如は、伸張性収縮があまりにもマイルドであることを示唆し、かつ効果的な治療法はありませんし、真に有益なものを区別するのに十分ではありません。しかし、伸張性収縮を受け、通常の筋肉の力の劇的な損失は、疾患に関連する差異を引き出すには余りにも大きいかもしれません。 EDLとダイヤフラムのための私たちのプロトコルには10％の長さの変化を生成する0.5ロー/秒の伸び率を使用しています。我々は、典型的には5エキセントリック収縮は、正常な筋肉の力の小さい損失およびジストロフィー筋肉の力の大幅な損失に結果を実行します。確かに、これらのパラメータのすべてが病気の、健康的な筋肉の間に、同様の変異の特定のタイプの効果の違いを区別するために、全体の長さ変化、ストレッチのレート、またはエキセントリック収縮の数を増やすために変化させることができるまたはtreatment 1は勉強しています。限り正常と疾患筋肉の間に顕著な違いがあるように、その後の治療の観点からのために達するために、金本位制があります。 要約すると、このプロトコルでは、等尺性とエキセントリック収縮を実行するためのガイドラインを確立し、うまくいけば、あなたのラボでこのテクニックをセットアップするときに回避するために潜在的な落とし穴を識別します。

筋機能の測定は、筋肉病理のための治療の可能性の評価にだけでなく、この組織の生理機能のメカニズムの決定に貢献しています。筋疾患は、マウスモデルを使用することは、潜在的な治療薬の設計とテストにその知識を拡張するための遺伝子型と表現型の間のリンクを理解するための中心的なコンポーネントとなっています。筋ジストロフィーは、特に、これらのエージェントを評価し、患者での臨床試験に進めるために必要な前臨床データを確立するためにマウスに頼ってきた。頻繁なアウトカム指標は、研究の広い範囲に適用される強さを決定するために、隔離された筋肉の機能を使用しています。もう一つの指標は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーを欠損している筋膜の完全性、およびこの疾患のマウスモデル（MDX）の変化を決定するために、偏心、または長く収縮の使用です。したがって、それはmeasuremこれらのタイプのために不可欠である親は高感度で再現性のあることが。 マウス長趾伸筋（EDL）筋肉が均一な繊維配向と決定的腱2、5、6、10、12を含む、理想的なジオメトリやサイズに起因する絶縁型筋機能のために広く使用されてきました。 EDL筋肉アイソメトリック機能測定のための方法は、以前のJove出版物8のと同様に、TREAT-NMDのSOPの1に記載されている。我々は、等尺性とエキセントリック収縮の両方が含まれるように、これらのメソッドの説明を拡張しました。病気の特徴は、変性/再生および減少力出力のheightedサイクルを含む、EDLに明らかである。 マウスの横隔膜は、マウス11の他の筋肉に比べて筋ジストロフィーの中で最も急速な病理の進行を示す。生後6ヶ月までに、累積線維症は、筋肉の約50％を構成している。大幅impaireこの結果、D力出力11。したがって、線維浸入を防ぐことができる治療薬は、横隔膜で効率的に評価することができます。 筋肉中のジストロフィンの損失が増加した脆弱性とすべての筋肉9の高まり収縮損傷につながる。したがってデュシェンヌ型筋ジストロフィーのための多くの治療法はジストロフィンの交換のために連動されています。このように、これらの戦略を評価するために不可欠となっている検定は、同様に収縮ダメージ2、3、4からジストロフィー筋を保護するために特定の戦略を持っているメリットは何かを判断として、正常およびジストロフィー筋を区別することができ伸張性収縮、、です12。この手順では、/レコード長と力、力変換器から急速に別々の長さを調整する方法を調節することができるどちらのデュアルモードサーボモータを必要とします。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬/材料の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td> in vitroでの筋力テスト·システムの </td><td>オーロラ·サイエンティフィック</td><td> 1200A </td><td></td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>ライカ</td><td> MZ6 </td><td></td></tr><tr><td> ACEの光源</td><td> SCHOTT-Fostec </td><td> A20500 </td><td></td></tr><tr><td>解剖用はさみ</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 14060から11 </td><td></td></tr><tr><td>アングルド解剖ハサミ</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 15006から09 </td><td></td></tr><tr><td>スカルペルハンドル</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 10003から12 </td><td>代替解剖ツール</td></tr><tr><td>湾曲したメス刃＃12 </td><td>ファインサイエンスツール</td><td> 10012から00 </td><td>代替解剖ツール</td></tr><tr><td>骨はさみ</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 16044から10 </td><td></td></tr><tr><td> S＆Tの縫合抱き合わせ鉗子</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 00272から13 </td><td></td></tr><tr><td>デュモンSS鉗子 - 角度付き</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 11203から25 </td><td></td></tr><tr><td>編んだ絹縫合サイズ6から0 </td><td>テレフレックスメディカル</td><td> 07-30-10 </td><td></td></tr><tr><td>医療テープ</td><td> Transpore </td><td>スリーエム</td><td></td></tr><tr><td>塩酸ケタミン100 mg / mlの</td><td>ホスピーラ</td><td> NDC 0409-2051-05 </td><td>最終用量は80 mg / kgである</td></tr><tr><td> TranquiVedインジェクション（キシラジン100 mg / ml）を</td><td> Vedco </td><td> NDC 50989-234-11 </td><td>最終用量は10 mg / kgである</td></tr><tr><td>リアクティブオレンジ14 </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> R-8254 </td><td></td></tr><tr><td> ソリューションコンポーネントをリンゲル </td><td></td><td></td><td>解決策は、95％O 2および5％CO 2、最終pH 7.4で平衡化ガスである</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> S7653 </td><td>最終濃度：118ミリメートル</td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> P217-3 </td><td>最終濃度：4.7 mMの</td></tr><tr><td>塩化カルシウム二水和物</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> C79-500 </td><td>最終濃度：2.5mMの</td></tr><tr><td>リン酸二水素カリウム</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> P-285 </td><td>最終濃度：1.2mMの</td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム</td><td> JTベーカー</td><td> 2500から01 </td><td>最終濃度：0.57 mMの</td></tr><tr><td> 4 - （2 - ヒドロキシエチル）パイプrazine-1-エタンスルホン酸（HEPES） </td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> BP310-500 </td><td>最終濃度：5.95 g ​​/ Lの</td></tr><tr><td>グルコース</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> G8270 </td><td>最終濃度：5.5 mMの</td></tr></tbody></table>

isometric and eccentric force generation assessment of skeletal muscles isolated from murine models of muscular dystrophies

筋肉の病気のための潜在的な治療法の評価に重要な筋機能の高感度で再現性の生理学的な評価です。多くの前臨床試験では、これらの疾患のマウスモデルに依存しているため、隔離された筋肉の機能は、患者にまで前方に新薬候補を移動する]の[移動/ NOGO意思決定のための基準の一つとなっている。私たちは、これらの研究のために利用優勢な筋肉である機能テスト用の長趾伸筋（EDL）と横隔膜の筋肉の準備のデモンストレーションを行います。 EDL筋肉のジオメトリは2簡単にアクセス腱、浴中の灌流によってサポートすることができる小型で、隔離された筋肉の準備に最適です。ダイヤフラムは、筋ジストロフィーの動物で深遠な進歩的な病態を示し、線維症に対抗する多くの潜在的な治療法を評価し、筋線維の安定を促進するためのプラットフォームとして機能することができます。アイソメトリックとeccenを含め、定期的なテストのためのプロトコル、TRIC収縮は、表示されます。アイソメトリック力が強さの評価を提供し、エキセントリック収縮は、筋ジストロフィーの多くの種類で破壊されている鞘の安定性を評価するのに役立ちます。野生型およびジストロフィー筋肉から筋肉の間に期待される結果の比較も提供されます。これらの措置は、組織の恒常性の形態学的および生化学的測定と同様に、筋機能の全体の動物アセスメントを補完することができます。

12週齢の動物からEDL筋群の等尺性力に対する期待値を図1に示します。 mdxの筋肉が代償性肥大を呈するため、トータルテタヌス力は年齢一致野生型対照と比較して、MDX筋肉で高くなることがあります。しかし、機能の出力のより適切な尺度は、力は、この値を計算するために断面積のために正規化されている特定の力（ 図2）です。具体的な力は絶対的な力と断面積の両方が考慮されている場合ジストロフィー筋肉の弱さがより明らかである筋肉の本来の機能的な能力に依存します。我々の手で、mdxマウスからEDL筋肉は約20を生成する - 26週齢 - 10から野生型マウスにマッチした時代のものよりも25％低い特定の力を。 準備がdisse依存筋肉の一部であるため、ダイアフラムのは、特定の力は比較のために関連していますction。野生型およびMDX横隔膜の筋肉の間に特定の力の比較では、この組織における進行性の病態を反映している。アイソメトリック力出力は、生後6ヶ月で、mdxマウスから横隔膜の筋肉が年齢をマッチさせた野生型コントロールからダイアフラムストリップの機能出力の半分以上のものを出さないように、（ 図3）加齢とともに減少します。 ダイアフラムテストから偏心収縮の例を図4に示す。後続の各伸張性収縮では、力の出力は、野生型（C57）とmdxマウスの両方からダイアフラムストリップに減少します。しかし、力のロスがあると推測されるジストロフィンとその関連タンパク質の不在から、mdxマウスの筋サンプルでより劇的です。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/50036/50036fig1.jpg" /> 図1野生型とMDXのEDL筋肉fのアイソメトリックテタヌス力<html> ROM 12週齢のマウス。絶対的な力は、代償性肥大のために年齢をマッチさせたMDX EDL筋肉に高くなることがあります。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/50036/50036fig2.jpg" /> 筋肉の断面積で正規化した図2。アイソメトリックテタヌス力は特定の力であり、野生型マウスに比べmdxマウスからEDL筋肉の落ち込んで機能的能力を明らかにする。トレースは図1と同じマウスからです。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/50036/50036fig3.jpg" /> 図3：特定の力によって評価力発電能力の漸進的な損失は、野生型（青線でC57）に比べて（赤いバー）mdxマウスの横隔膜の中で最も明白である。 36/50036fig4.jpg &quot;/&gt; 図4：12週齢C57とmdxマウスから横隔膜の筋肉のための伸張性収縮数の関数としての力の損失。データは平均値である±遺伝子型ごとにN = 4の筋肉のためのSEMである。

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Isometric and Eccentric Force Generation Assessment of Skeletal Muscles Isolated from Murine Models of Muscular Dystrophies

筋機能の測定は、筋肉病理のための潜在的な治療法の評価と同様に、この組織の生理機能のメカニズムの決定に貢献しています。我々は、機能テストのための長趾伸筋と横隔膜の筋肉の準備のデモンストレーションを行います。アイソメトリックとエキセントリック収縮のためのプロトコルは、病理学的状態を表すジストロフィー筋の間で結果の違い、および野生型の筋肉だけでなく、表示されます。

筋ジストロフィーのマウスモデルから分離された骨格筋の等尺性と偏心力発生アセスメント

Critical to the evaluation of potential  therapeutics for muscular disease are sensitive and reproducible physiological  assessments of muscle function. ...

isometric-eccentric-force-generation-assessment-skeletal-muscles

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JoVE Journal

Biology

32.5K ビュー.  School of Dental Medicine, University of Pennsylvania. 筋機能の測定は、筋肉病理のための潜在的な治療法の評価と同様に、この組織の生理機能のメカニズムの決定に貢献しています。我々は、機能テストのための長趾伸筋と横隔膜の筋肉の準備のデモンストレーションを行います。アイソメトリックとエキセントリック収縮のためのプロトコルは、病理学的状態を表すジストロフィー筋の間で結果の違い、?...

ビデオ: Isometric and Eccentric Force Generation Assessment of Skeletal Muscles Isolated from Murine Models of Muscular Dystrophies

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant variants) in order to investigate their endogenous distribution and functional relevance. An interesting approach that has been implemented to fulfill this objective in fully differentiated cells is the in vivo transfection of plasmids by various methods into specific tissues such as liver1, skeletal muscle2,3, and even the brain4. We present here a detailed description of the steps that must be followed in order to efficiently transfect genetic material into fibers of the flexor digitorum brevis (FDB) and interosseus (IO) muscles of adult mice using an in vivo electroporation approach. The experimental parameters have been optimized so as to maximize the number of muscle fibers transfected while minimizing tissue damages that may impair the quality and quantity of the proteins expressed in individual fibers. We have verified that the implementation of the methodology described in this paper results in a high yield of soluble proteins, i.e. EGFP and ECFP3, calpain, FKBP12, &beta;2a-DHPR, etc. ; structural proteins, i.e. minidystrophin and &alpha;-actinin; and membrane proteins, i.e. &alpha;1s-DHPR, RyR1, cardiac Na/Ca2+ exchanger , NaV1.4 Na channel, SERCA1, etc., when applied to FDB, IO and other muscles of mice and rats. The efficient expression of some of these proteins has been verified with biochemical3 and functional evidence5. However, by far the most common confirmatory approach used by us are standard fluorescent microscopy and 2-photon laser scanning microscopy (TPLSM), which permit to identify not only the overall expression, but also the detailed intracellular localization, of fluorescently tagged protein constructs. The method could be equally used to transfect plasmids encoding for the expression of proteins of physiological relevance (as shown here), or for interference RNA (siRNA) aiming to suppress the expression of normally expressed proteins (not tested by us yet). It should be noted that the transfection of FDB and IO muscle fibers is particularly relevant for the investigation of mammalian muscle physiology since fibers enzymatically dissociated from these muscles are currently one of the most suitable models to investigate basic mechanisms of excitability and excitation-contraction coupling under current or voltage clamp conditions2,6-8.

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

We describe detailed procedures for the efficient transfection of plasmid DNA into the fibers of foot muscles of live mice using electroporation and the subsequent visualization of protein expression using fluorescence microscopy.

使用して哺乳類の骨格筋のDNAトランスフェクションインビボでのエレクトロポレーション

 A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant ...

生物学

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes. More than 700 human miRNAs have been identified so far with each having up to hundreds of unique target mRNAs. Computational tools, expression and proteomics assays, and chromatin-immunoprecipitation-based techniques provide important clues for identifying mRNAs that are direct targets of a particular miRNA. In addition, 3'UTR-reporter assays have become an important component of thorough miRNA target studies because they provide functional evidence for and quantitate the effects of specific miRNA-3'UTR interactions in a cell-based system. To enable more researchers to leverage 3'UTR-reporter assays and to support the scale-up of such assays to high-throughput levels, we have created a genome-wide collection of human 3'UTR luciferase reporters in the highly-optimized LightSwitch Luciferase Assay System. The system also includes synthetic miRNA target reporter constructs for use as positive controls, various endogenous 3'UTR reporter constructs, and a series of standardized experimental protocols.
Here we describe a method for co-transfection of individual 3'UTR-reporter constructs along with a miRNA mimic that is efficient, reproducible, and amenable to high-throughput analysis.

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3&#039;UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and have been shown to play a role in numerous biological processes. To better understand miRNA-UTR interactions, we have created a genome-wide collection of 3 UTR luciferase reporters paired with a novel luciferase gene and assay reagent, the LightSwitch system.

3&#39;UTR -レポーターコンストラクトとマイクロRNAを使用してLightSwitchルシフェラーゼアッセイシステムによるヒトマイクロRNAの識別対象は付着細胞へのミミック

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes.  More than 700 human miRNAs have been ...

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

The isolated microvessel preparation is an ex vivo preparation that allows for examination of the different contributions of factors that control vessel diameter, and thus, perfusion resistance1-5. This is a classic experimental preparation that was, in large measure, initially described by Uchida et al.15 several decades ago. This initial description provided the basis for the techniques that was extensively modified and enhanced, primarily in the laboratory of Dr. Brian Duling at the University of Virginia6-8, and we present a current approach in the following pages. This preparation will specifically refer to the gracilis arteriole in a rat as the microvessel of choice, but the basic preparation can readily be applied to vessels isolated from nearly any other tissue or organ across species9-13. Mechanical (i.e., dimensional) changes in the isolated microvessels can easily be evaluated in response to a broad array of physiological (e.g., hypoxia, intravascular pressure, or shear) or pharmacological challenges, and can provide insight into mechanistic elements comprising integrated responses in an intact, although ex vivo, tissue. The significance of this method is that it allows for facile manipulation of the influences on the integrated regulation of microvessel diameter, while also allowing for the control of many of the contributions from other sources, including intravascular pressure (myogenic), autonomic innervation, hemodynamic (e.g., shear stress), endothelial dependent or independent stimuli, hormonal, and parenchymal influences, to provide a partial list. Under appropriate experimental conditions and with appropriate goals, this can serve as an advantage over in vivo or in situ tissue/organ preparations, which do not readily allow for the facile control of broader systemic variables. 
The major limitation of this preparation is essentially the consequence of its strengths. By definition, the behavior of these vessels is being studied under conditions where many of the most significant contributors to the regulation of vascular resistance have been removed, including neural, humoral, metabolic, etc. As such, the investigator is cautioned to avoid over-interpretation and extrapolation of the data that are collected utilizing this preparation. The other significant area of concern with regard to this preparation is that it can be very easy to damage cellular components such as the endothelial lining or the vascular smooth muscle, such that variable source of error can be introduced. It is strongly recommended that the individual investigator utilize appropriate measurements to ensure the quality of the preparation, both at the initiation of the experiment and periodically throughout the course of a protocol.

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

An ex vivo preparation is described for isolation of the largest gracilis muscle resistance arterioles for interrogation of both vascular responses to vasoactive stimuli and the assessment of basic structural properties via passive wall mechanics.

ザ ex vivoで</em血管反応性の調査のために>隔離された骨格微小血管の準備

The isolated  microvessel preparation is an ex vivo preparation that allows for examination of the different contributions of  factors that control vessel ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, fatigability, and recovery after fatigue can be obtained to assess specific aspects of the excitation-contraction coupling (ECC) process such as excitability, contractile machinery and Ca2+ handling ability. This method removes the nerve and blood supply and focuses on the isolated skeletal muscle itself. We routinely use this method to identify genetic components that alter the contractile property of skeletal muscle though modulating Ca2+ signaling pathways. Here, we describe a newly identified skeletal muscle phenotype, i.e., mechanic alternans, as an example of the various and rich information that can be obtained using the in vitro muscle contractility assay. Combination of this assay with single cell assays, genetic approaches and biochemistry assays can provide important insights into the mechanisms of ECC in skeletal muscle.

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

We describe a method to directly measure muscle force, muscle power, contractile kinetics and fatigability of isolated skeletal muscles in an in vitro system using field stimulation. Valuable information on Ca2+ handling properties and contractile machinery of the muscle can be obtained using different stimulating protocols.

隔離された骨格筋の収縮、倦怠感や交互の ex vivo での評価

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in the striated muscle fibers that appear as highly localized Ca2+ release events mediated by ryanodine receptor (RyR) Ca2+ release channels on the sarcoplasmic reticulum (SR) membrane. Proper assessment of muscle Ca2+ sparks could provide information on the intracellular Ca2+&#160;handling properties of healthy and diseased striated muscles. Although Ca2+ sparks events are commonly seen in resting cardiomyocytes, they are rarely observed in resting skeletal muscle fibers; thus there is a need for methods to generate and analyze sparks in skeletal muscle fibers.
Detailed here is an experimental protocol for measuring Ca2+ sparks in isolated flexor digitorm brevis (FDB) muscle fibers using fluorescent Ca2+ indictors and laser scanning confocal microscopy. In this approach, isolated FDB fibers are exposed to transient hypoosmotic stress followed by a return to isotonic physiological solution. Under these conditions, a robust Ca2+ sparks response is detected adjacent to the sarcolemmal membrane in young healthy FDB muscle fibers. Altered Ca2+ sparks response is detected in dystrophic or aged skeletal muscle fibers. This approach has recently demonstrated that membrane-delimited signaling involving cross-talk between inositol (1,4,5)-triphosphate receptor (IP3R) and RyR contributes to Ca2+ spark activation in skeletal muscle. In summary, our studies using osmotic stress induced Ca2+ sparks showed that this intracellular response reflects a muscle signaling mechanism in physiology and aging/disease states, including mouse models of muscle dystrophy (mdx mice) or amyotrophic lateral sclerosis (ALS model).

Described here is a method to directly measure calcium sparks, the elementary units of Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum&#160;in intact skeletal muscle fibers. This method utilizes osmotic-stress-mediated triggering of Ca2+ release from ryanodine receptor in isolated muscle fibers. The dynamics and homeostatic capacity of intracellular Ca2+ signaling can be employed to assess muscle function in health and disease.

無傷骨格筋線維内のカルシウムスパークスの評価

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which requires specific protocols for tissue collection to obtain optimal results from functional, cellular, molecular, and pathological evaluations. Due to the subtlety of some pathological abnormalities seen in congenital muscle disorders and the potential for fixation to interfere with the recognition of these features, pathological evaluation of frozen muscle is preferable to fixed muscle when evaluating skeletal muscle for congenital muscle disease. Additionally, the potential to produce severe freezing artifacts in muscle requires specific precautions when freezing skeletal muscle for histological examination that are not commonly used when freezing other tissues. This manuscript describes a protocol for rapid freezing of skeletal muscle using isopentane (2-methylbutane) cooled with liquid nitrogen to preserve optimal skeletal muscle morphology. This procedure is also effective for freezing tissue intended for genetic or protein expression studies. Furthermore, we have integrated our freezing protocol into a broader procedure that also describes preferred methods for the short term triage of tissue for (1) single fiber functional studies and (2) myoblast cell culture, with a focus on the minimum effort necessary to collect tissue and transport it to specialized research or reference labs to complete these studies. Overall, this manuscript provides an outline of how fresh tissue can be effectively distributed for a variety of phenotypic studies and thereby provides standard operating procedures (SOPs) for pathological studies related to congenital muscle disease.

The analysis of skeletal muscle tissues to determine structural, functional, and biochemical properties is greatly facilitated by appropriate preparation. This protocol describes appropriate methods to prepare skeletal muscle tissue for a broad range of phenotyping studies.

組織トリアージや骨格筋疾患のモデルのために凍結

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which requires specific protocols for tissue collection to obtain optimal ...

Design and Development of Aptamer&#8211;Gold Nanoparticle Based Colorimetric Assays for In-the-field Applications

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle (AuNP) colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field applications was examined. Target selective AuNP based color assays have been developed in controlled proof-of-concept laboratory settings. However, these schemes have not been exerted to a point of failure to determine their practical use beyond laboratory settings. This work describes a generic approach to design, develop, and troubleshoot an aptamer-AuNP colorimetric assay for small molecule analytes and using the assay for in-the-field settings. The assay is advantageous because adsorbed aptamers passivate the nanoparticle surfaces and provide a means to reduce and eliminate false positive responses to non-target analytes. Transitioning this system to practical uses required defining not only the shelf-life of the aptamer-AuNP assay, but establishing methods and procedures for extending the long-term storage capabilities. Also, one of the recognized concerns with colorimetric readout is the burden placed on analysts to accurately identify often subtle changes in color. To lessen the responsibility on analysts in the field, a color analysis protocol was designed to perform the color identification duties without the need for performing this task on laboratory grade equipment. The method for creating and testing the data analysis protocol is described. However to understand and influence the design of adsorbed aptamer assays, the interactions associated with the aptamer, target, and AuNPs require further study. The knowledge gained could lead to tailoring aptamers for improved functionality.

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field applications was examined. Additionally, a smart-device colorimetric application (app) was validated and long-term storage of the assay was established for use in the field.

インフィールドアプリケーションの設計およびアプタマー金ナノ粒子基づく比色アッセイの開発

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle (AuNP) colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field ...

Isolating Myofibrils from Skeletal Muscle Biopsies and Determining Contractile Function with a Nano-Newton Resolution Force Transducer

Striated muscle cells are indispensable for the activity of humans and animals. Single muscle fibers are comprised of myofibrils, which consist of serially linked sarcomeres, the smallest contractile units in muscle. Sarcomeric dysfunction contributes to muscle weakness in patients with mutations in genes encoding for sarcomeric proteins. The study of myofibril mechanics allows for the assessment of actin-myosin interactions without potential confounding effects of damaged, adjacent myofibrils when measuring the contractility of single muscle fibers. Ultrastructural damage and misalignment of myofibrils might contribute to impaired contractility. If structural damage is present in the myofibrils, they likely break during the isolation procedure or during the experiment. Furthermore, studies in myofibrils provide the assessment of actin-myosin interactions in the presence of the geometrical constraints of the sarcomeres. For instance, measurements in myofibrils can elucidate whether myofibrillar dysfunction is the primary effect of a mutation in a sarcomeric protein. In addition, perfusion with calcium solutions or compounds is almost instant due to the small diameter of the myofibril. This makes myofibrils eminently suitable to measure the rates of activation and relaxation during force production. The protocol described in this paper employs an optical force probe based on the principle of a Fabry-P&#233;rot interferometer capable of measuring forces in the nano-Newton range, coupled to a piezo length motor and a fast-step perfusion system. This setup enables the study of myofibril mechanics with high resolution force measurements.

Presented here is a protocol to assess the contractile properties of striated muscle myofibrils with nano-Newton resolution. The protocol employs a setup with an interferometry-based, optical force probe. This setup generates data with a high signal-to-noise ratio and enables the assessment of the contractile kinetics of myofibrils.

骨格筋生検からミオフィブリルを分離し、ナノニュートン分解力トランスデューサーによる収縮機能を決定する

Striated muscle cells are indispensable for the activity of humans and animals. Single muscle fibers are comprised of myofibrils, which consist of ...

Measurement of Insulin- and Contraction-Stimulated Glucose Uptake in Isolated and Incubated Mature Skeletal Muscle from Mice

Skeletal muscle is an insulin-responsive tissue and typically takes up most of the glucose that enters the blood after a meal. Moreover, it has been reported that skeletal muscle may increase the extraction of glucose from the blood by up to 50-fold during exercise compared to resting conditions. The increase in muscle glucose uptake during exercise and insulin stimulation is dependent on the translocation of glucose transporter 4 (GLUT4) from intracellular compartments to the muscle cell surface membrane, as well as phosphorylation of glucose to glucose-6-phosphate by hexokinase II. Isolation and incubation of mouse muscles such as m. soleus and m. extensor digitorum longus (EDL) is an appropriate ex vivo model to study the effects of insulin and electrically-induced contraction (a model for exercise) on glucose uptake in mature skeletal muscle. Thus, the ex vivo model permits evaluation of muscle insulin sensitivity and makes it possible to match muscle force production during contraction ensuring uniform recruitment of muscle fibers during measurements of muscle glucose uptake. Moreover, the described model is suitable for pharmacological compound testing that may have an impact on muscle insulin sensitivity or may be of help when trying to delineate the regulatory complexity of skeletal muscle glucose uptake.
Here we describe and provide a detailed protocol on how to measure insulin- and contraction-stimulated glucose uptake in isolated and incubated soleus and EDL muscle preparations from mice using radiolabeled [3H]2-deoxy-D-glucose and [14C]mannitol as an extracellular marker. This allows accurate assessment of glucose uptake in mature skeletal muscle in the absence of confounding factors that may interfere in the intact animal model. In addition, we provide information on metabolic viability of incubated mouse skeletal muscle suggesting that the method&#160;applied possesses some caveats under certain conditions when studying muscle energy metabolism.

Intact regulation of muscle glucose uptake is important for maintaining whole body glucose homeostasis. This protocol presents assessment of insulin- and contraction-stimulated glucose uptake in isolated and incubated mature skeletal muscle when delineating the impact of various physiological interventions on whole body glucose metabolism.

マウスから単離およびインキュベートされた成熟骨格筋におけるインスリンおよび収縮刺激グルコース取り込みの測定

Skeletal muscle is an insulin-responsive tissue and typically takes up most of the glucose that enters the blood after a meal. Moreover, it has been ...

Generation of Murine Primary Colon Epithelial Monolayers from Intestinal Crypts

The intestinal epithelium is comprised of a single layer of cells that act as a barrier between the gut lumen and the interior of the body. Disruption in the continuity of this barrier can result in inflammatory disorders such as inflammatory bowel disease. One of the limitations in the study of intestinal epithelial biology has been the lack of primary cell culture models, which has obliged researchers to use model cell lines derived from carcinomas. The advent of three dimensional (3D) enteroids has given epithelial biologists a powerful tool to generate primary cell cultures, nevertheless, these structures are embedded in extracellular matrix and lack the maturity characteristic of differentiated intestinal epithelial cells. Several techniques to generate intestinal epithelial monolayers have been published, but most are derived from established 3D enteroids making the process laborious and expensive. Here we describe a protocol to generate primary epithelial colon monolayers directly from murine intestinal crypts. We also detail experimental approaches that can be used with this model such as the generation of confluent cultures on permeable filters, confluent monolayer for scratch wound healing studies and sparse and confluent monolayers for immunofluorescence analysis.

In this protocol, we describe how to generate murine primary epithelial colon monolayers directly from intestinal crypts. We provide experimental approaches to generate confluent monolayers on permeable filters, confluent monolayers for scratch wound healing and biochemical studies, and sparse and confluent monolayers for immunofluorescence analysis.

腸管内窩からのネズミ原発結上皮単層の生成

The intestinal epithelium is comprised of a single layer of cells that act as a barrier between the gut lumen and the interior of the body. Disruption in ...