米国国立衛生研究所からの資金調達は、CIMITプロジェクト第12から1732と感謝して認識されているシュライナーズ子ども病院（R01EB008678、R01DK096075、R01DK084053、R00DK088962とF32のDK103500を付与）。私たちは感謝して、この作業を支援するためのニューイングランドオルガン銀行を承認したいと思います。

ヒト組織の使用は、治験審査委員会（IRB）または同等によって審査されなければならない。ここで説明する作業は、承認され、マサチューセッツ総合病院施設内倫理委員会（第2011P001496）による免除宣言されました。 1.溶液の調製<ol><li>無菌的には、 表1に概説するようにレッド無ウィリアムズ培地Eをフェノールサプリメントを追加します。ソリューションは、使用前に新鮮な準備する必要があります。インスリンは、使用直前に追加する必要があります。 </li></ol>肝臓の2.バック表の準備<ol><li>無菌の、ドレープ表面に氷で満たされた臓器のボウルを置きます。冷たい保存液の袋に入れて残して、箱から肝臓を取り出します。ほとんどが水没肝臓にしてください。 </li><li>大動脈パッチの遠位に位置するであろう肝動脈（HA）を、特定します。 Metzenbaumはさみを使って長さに沿った様々なカットの枝を明らかにするために自由に動脈を解剖。慎重ディッセctの動脈の全長は、肝臓を供給する血管を切断防止する。目に見えるの端を持っていない枝を切断したり、結んだりしないでください。 </li><li>容器のサイズに応じて、サイズ0から4-0までの絹縫合糸を使用して肝臓を供給していないすべての動脈枝を結ぶ。 7-0プロレンのステッチと動脈の穴に結びつけるには短すぎるか、[閉じる支店。タイとは、腹腔トランク上での原点に近い脾臓、左胃動脈を切った。 </li><li>パッチの下に直接腹腔動脈を切断して、大動脈パッチを削除します。大動脈カニューレを用いて腹腔動脈にカニューレを挿入。 </li><li>門脈（PV）を特定し、ぶっきらぼうに無料でそれを分析。すべての枝を縛るとサイズ24チューブの準備セグメントとPVにカニューレを挿入。 </li><li>静脈自体を切断することなく、肝上大静脈からのダイヤフラムのセクションを削除します。直接臓器チャンバーに大静脈のドレインから流出する。 </li><li> 2フル周TIをカットssueサンプルを総胆管の端部から（2-3 mmの長さ）。スナップ液体窒素（-80℃で保存）で1を凍結し、それぞれ、組織と組織学的分析のために、10％緩衝ホルマリンに他の格納します。血管カニューレおよび膜型人工肺管からなるドレイン管と総胆管にカニューレを挿入。 </li><li> 0絹のネクタイと胆嚢管を識別し、連結する。胆嚢管は、総胆管と胆嚢の間に見出される。 </li><li>すべての空気を除去し、乳酸リンゲル（LR）ソリューションとプライムの氷冷袋チューブにフラッシュチューブセットを接続します。 </li><li>ゆっくり細流へのフラッシュの管に流量調整を設定します。門脈カニューレにフラッシュチューブを接続する前に、へそに指で門脈を閉塞し、門脈から空気を除去するためにフラッシュでカニューレと静脈を埋める。上の過度の圧力を避けるために、冷たい洗浄中に袋に肝臓の高さ以上の20以上のセンチ上昇させない静脈。 </li><li>フラッシュ簡潔時の最低点でのPVを閉塞する。漏れのPVを調べます。上記のように、血管枝は閉鎖することができる。氷のように冷たいLRの2 Lの合計PVを通して肝臓をフラッシュします。 </li><li>繰り返しますLR 1Lで2.10、HAのために2.11を繰り返します。 </li></ol> 3. SNMPシステムのプライミング<ol><li>プライム器官ボウルに灌流液の2 L（21℃）を添加し、プラ​​イムチューブにデバイスを起動することにより潅流装置。 21℃に温度を設定する、灌流の準備のために、デバイスの指示に従ってください。それぞれ、3 20mmHgの圧力とPVとHAに30 mmHgので始まります。ガソリンタンクを開き、3L /分の流量に設定されています。 </li><li>サンプルポートから0.3ミリリットルサンプルを吸引し、製造業者の説明書に従って、血液ガス分析装置でそれを実行して、HAおよびPV流入​​の両方からの血液ガスサンプルを取る。十分な酸素化を確認してください（PO 2&gt; 700 mmHg）で、pHを（7.35から7.45）。 </li><li>肝臓が接続される前に-80℃でエッペンドルフチュー​​ブとストアに= 0測定時のように灌流液の1.0ミリリットルのサンプルを取る。片刃鋼の刃を使用して肝臓から二±250mgのウェッジ検を切断し、スナップ液体窒素（-80℃で保存）で1を凍結し、10％緩衝ホルマリンに他の格納します。灌流前に肝臓を計量。 </li></ol> 4.ヒト肝灌流<ol><li>デバイスに肝臓を転送します。ステップ2.10のようにPVから空気を除去した後、PVカニューレにPV流入を接続します。同様の方法でHAを接続します。 3と30 mmHgのにPVとHA圧力を設定します。肝臓はほぼ灌流液によって水没する必要があります。脱水症状を防ぐために、湿った滅菌ガーゼで、流入血管を含む任意のドライ表面を覆う</li><li>胆汁チューブが回収容器に排出しましょう​​。胆汁ドレインの開口部がO実行す​​るために胆汁を可能にするために肝臓のレベルで以下であることを確認してください自由にUT。 </li><li>肝臓は21℃に温めた後、目標流量は、それぞれのPVとHAのために275〜325ミリリットル/ min.kg 50〜100ミリリットル/ min.kgです。すべての肝臓は灌流に異なって反応するので、最初の数分間の間に密接な流れを監視。目標流量に達していない場合、容器のいずれかの圧力を増加または減少させる。 HA上の50 mmHgのとPVで5 mmHgのを超えないようにしてください。 </li><li>試料は、研究者の好みで肝組織、灌流液および胆汁から得ることができる。私たちは、灌流の間に、最低でも次のサンプル収集レジメンをお勧めします。 <ol><li>組織生検、N = 2×250mgを、毎時間。ストレージ：-80°C、長期液体窒素とストア内の1を凍結スナップ。さらに、灌流の前および後に別の生検を取り、10％緩衝ホルマリンで固定した（n = 1） </li><li>灌流サンプル、N = 2X 1ミリリットル、最初の1時間は15分毎、その後30分ごと。 PVのINFからサンプルを描く低サンプルポート。ストレージ：-80°C長期的。 </li><li> PVおよびHA流入、及び大静脈流出の血液ガス分析。 N = 3×0.3ミリリットル、30分ごと。 PVとHA試料ポートの両方からサンプルを描画します。静脈に注射器を挿入することにより、大静脈から0.3ミリリットルのサンプルを描画し、直接血液ガス分析装置で実行されます。適切な酸素およびpHを確実にするために出力を使用してください。 </li><li>胆汁生産、N = 1×1ミリリットル、すべての時間。視覚胆汁生産を時間ごとに定量化し、回収容器からサンプルを取る。サンプリング後の容器を更新。ストレージ：ドライアイスと-80℃の長期的。 </li></ol></li><li> 3時間灌流を続けます。圧力、pHおよび酸素化を監視し、全体でサンプルを取る。灌流液に炭酸水素ナトリウムを添加することにより、彼のpHを調整します。 </li><li>肝臓が灌流されている間灌流の終わりには、最終的なサンプルを取る。肝臓を外し、胆管カニューレを削除します。 2ポスト灌流組織サンプルを取る-80℃で、10％緩衝ホルマリンに保存するために、前述したように、胆管。 </li><li>適切なバイオハザード処分ガイドラインに従ってヒト肝臓を捨てる。 </li></ol>

<ol>
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博士。 Uygun、K UygunとYarmushは、この研究（WO / 2011/002926）、および博士に関連する特許出願中の上の発明者であること。 Uygun、K UygunとYarmushは（35223分の2011 / WO）、本研究に関連する特許出願中の上の発明者であること。博士。 K Uygunとブルインスマはこの仕事に関連する仮特許出願を持っている。博士K UygunとBE Uygunはオルガンソリューションで経済的利害関係を持っている、同社は臓器保存技術の開発に注力しました。博士K UygunとUygunの利益は、金利政策の彼らの紛争に従ってMGHとパートナーズヘルスケアによって管理されていること。

虚血中に負傷した肝臓を回復しようとすると、我々は低温貯蔵の期間後に使用することができるSNMPシステムを開発しました。 Subnormothermicマシン灌流は、従来の低温貯蔵のほか、低体温と正常体温マシン灌流モダリティに対する実行可能な代替手段を提供しています。様々な異なるシステムが存在しています。すべてが異なる長所と短所の3,9,20を提供します。 SNMPは、21時の代謝酸素要求として、酸素運搬体なしで灌流を可能にし °Cは、灌流液の活発な酸素化によって満たされる。 subnormothermic条件下で還元するが、代謝が充実していると栄養豊富な灌流液のサポートが必要です。このようベルザー機械灌流液などの従来の灌流液は、組成物中で一般的に最小であると冷潅流のために設計されている。ウィリアムズE培地は、長年にわたって肝細胞培養培地として用い、及びcが含まれている暖かいex vivoでの条件の下で、特に、細胞機能をサポートするための普遍的であるomponents。 機械灌流中に行われた測定は、器官の機能を反映している。胆汁産生および酸素摂取量として直接観察可能なパラメータは、肝臓移植前に評価するために用いることができるリアルタイムの測定値である。同様に、細胞の損傷および虚血（K +、乳酸放出）のマーカーは、灌流液中に直接測定することができ、臓器機能20を示すことができる。機械灌流技術がさらに開発し、より広範な臨床応用を実現するように、ex vivoでの機能と臨床転帰との間の正確な相関関係を行うことができ、灌流パラメータは、移植または限界品質の肝臓を拒絶する決定を補助するのに有用であろう。また、ポイントオブケア分析ツールの進歩として、より洗練された分析では、マシンの間に直接利用できるようになりますperfuシオン21。 本研究では、肝臓組織学およびALTの放出によって反射された、肝臓に最小の損傷にSNMPシステムでサポートすることができることを示している。肝臓の機能回復は最高の肝臓の生存率に相関することが示されており、動物モデルでの移植の成功を強く示唆するものであるされたATP、によって反射される22。ex vivoでの肝臓移植片の移植前の回復は、ドナーの大幅な拡大を可能にする移植におけるドナーの肝臓の供給と需要の間に格差を補正し、肝プール、。

肝移植は、数十末期肝疾患に苦しむ患者の数千のための唯一の根治治療で​​ある。移植の成功は、それが移植片の急速な悪化を防止する必要があるレシピエントに移植されるまでドナーから調達された時点から、肝臓の最適な保護を容易にする。肝臓保存のための現在の標準は、「静的冷蔵」と呼ばれている：肝臓、それによって肝臓の代謝を低減し、虚血の有害な影響を減速、氷冷保存液で冷却される。この冷蔵技術は、そのような暖かい虚血や脂肪肝のショーによって損傷DCD器官としての限界品質劣る患者の転帰1の移植の成功、臓器に許可されているが。肝臓移植片の証拠そのex vivoでの機械灌流の急速に拡大ボディは、代替保存モダリティができ、潜在的にイムとしてありますこれらの限界臓器2,3のための成果を証明する。 肝移植は、自身の成功の犠牲者となっています。はるかに多くの患者が利用できる肝臓があるよりも、移植のために呼ばれ、何千人もが毎年米国で待機リストに死ぬ。ドナーの肝臓不足の現実と貧しい受信者の次善の品質の肝臓移植の増加利用を考えると、それは広く移植前に肝臓移植片のex vivoでのマシン灌流は肝移植におけるパラダイムシフトの約束を保持していることを保持されている。近年4-8のこのトピックの研究の関心が著しく増加している。様々なヨーロッパと北米センターでは低体温マシン灌流は、生理的温度での臨床導入8と正常体温マシン灌流は、最近捨て、人間の肝臓に適用されていると臨床的使用にも9に翻訳されてきた。連続的な最適化は、最適な灌流パラメータ10-12を識別しながら、大規模な開発は、様々なプロトコルが開発された。周縁質の移植片の使用は、過去10年間にわたって13 10倍以上増加している。肝臓保存（静的冷蔵）の現在の標準と比較すると、ex vivoでのマシン灌流は、臓器プールの待望の拡張につながるのすべては非常に多くの潜在的な利点を提供し、潜在的に移植後の合併症の発生率の減少。特に、現在、移植後の次善の品質の肝臓移植片を悩ま胆管合併症はかなりの問題14-18残る。 subnormothermic条件でのマシン灌流は客観的に移植19のための適合性などの移植片機能を評価するために時間ウィンドウを提供します。肝臓は、両方の灌流液aを、 エキソビボ回路で灌流されている間ndは、灌流の間に生成胆汁は臓器機能のマーカーの測定のためにサンプリングすることができる。このように、現在の基準の下での移植のために破棄され肝臓を客観的に移植に対する適性であると評価することができる「厳しく妥協」。これらの器官の多くは移植のために利用されるの生存能力評価が潜在的に可能にする。機械灌流の均等に強力な利点は、温かい/冷たい虚血により損傷を受けた肝臓の修復と改善である。 ATPは暖かく、その後の冷間虚血中非常に急速に枯渇していると前に肝臓20の移植に機械灌流の期間中にrepletedすることができます。肝臓は、そのエネルギー貯蔵及び代謝状態を補給して、予め調整され、レシピエントにおける移植後の再灌流障害の有害な影響のためのより良い準備。 この研究は、ヒトの肝臓にgrafのエクスビボ機械灌流する方法を記載技術とex vivoでの機械灌流の有益な効果の両方を勉強したい研究者にとって有用であろう研究室でTS、。我々は、移植のために減少され、その後、研究目的のために割り当てられたヒトのドナー肝臓を利用する。 標準の肝臓の調達技術は脳死ドナー（DBD）、または他の場所20でより詳細に説明循環死ドナー（DCD）で循環停止後の大動脈クロスクランプ後の肝臓の in situ動脈フラッシュに伴う。さらに、肝臓を氷ドナーの腹腔内に充填することにより、調達時に冷却される。フラッシュ液の好みは、ウィスコンシン大学またはヒスチジン - トリプトファン - ケトグルタル酸（HTK）溶液を使用して調達の大部分は、地域間で異なる。門脈の追加のバックテーブルのフラッシュは残留血液の洗い出しを向上させます。肝臓は、多くの場合、大動脈セグメントシュールを残して調達している腹腔トランクを丸め。胆嚢は、胆汁が吸引され、切開され、胆管がフラッシュされる。肝臓を氷冷保存液を含有する無菌袋に包装し、指定されたボックスまたは冷却器に輸送される。代表的な結果を得るには暖かく、冷たい虚血時間はそれぞれ、60分および12時間に制限する必要があります。人間の臓器、人間の臓器から得られた試​​料、および任意の老廃物を渡す際に伝染性の病原体のために日常的血清学的スクリーニングにもかかわらず、標準予防策が取られなければならない。 ここで、プロトコルは、市販の肝臓灌流装置を用いてsubnormothermic機械灌流を記載している。このような装置の使用は、臨床環境および研究グループおよび移植センターの間で、異なるプロトコルおよびデバイス設定の相互検証をより迅速翻訳を可能にする。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Liver Assist perfusion device</td>
			<td>Organ Assist B.V.</td>
			<td>Liver Assist</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liver Assist disposable set</td>
			<td>Organ Assist B.V.</td>
			<td>Liver Assist disposable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Williams&#8217; Medium E</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W1878&#8211;6x500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Eli Lilly &#38; Co</td>
			<td>Humulin R U-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin 5,000 U/ml</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030-156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>MGH pharmacy</td>
			<td>7750500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbogen gas tank 95% O2/5% CO2</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>ZO2OX9522000043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specialty gas regulator</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>Y11244D580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactated Ringer&#8217;s solution</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>2B2324X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% neutral buffered formalin</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>316-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toothed Adson forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Debakey tissue forceps, 7.75&#8221;, 2.25 mm</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-7562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metzenbaum Scissors 7&#34; Curved SureCut Tungsten</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6965SC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Castroviejo Needle holder 5.5&#8211;7&#8221;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12565-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0 blackbraided silk sutures</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>SA66G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 nylon suture, Nurolon RB1</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>C554D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood gas analysis machine</td>
			<td>Siemens</td>
			<td>RapidPoint 500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balance scale</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-10000-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure display box</td>
			<td>Medtronic</td>
			<td>66000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable pressure display sets</td>
			<td>Medtronic</td>
			<td>61000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handheld thermocouple thermometer and probe</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td colspan="2">EW-91500-04 and EW-08516-55</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acorn-tipped vessel cannula, 4 mm</td>
			<td>Medtronic</td>
			<td>30005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Irrigation set flush tubing</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>06543-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixing bowl, 4L</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-07300-40</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional human liver preservation and recovery by means of subnormothermic machine perfusion

There is currently a severe shortage of liver grafts available for transplantation. Novel organ preservation techniques are needed to expand the pool of donor livers. Machine perfusion of donor liver grafts is an alternative to traditional cold storage of livers and holds much promise as a modality to expand the donor organ pool. We have recently described the potential benefit of subnormothermic machine perfusion of human livers. Machine perfused livers showed improving function and restoration of tissue ATP levels. Additionally, machine perfusion of liver grafts at subnormothermic temperatures allows for objective assessment of the functionality and suitability of a liver for transplantation. In these ways a great many livers that were previously discarded due to their suboptimal quality can be rescued via the restorative effects of machine perfusion and utilized for transplantation. Here we describe this technique of subnormothermic machine perfusion in detail. Human liver grafts allocated for research are perfused via the hepatic artery and portal vein with an acellular oxygenated perfusate at 21 &#176;C.

観察および分析の数は、流量および胆汁産生の直接リアルタイム観察、を含む、潅流中に、肝臓で行うことができる。そのような灌流液のガス分析、および生化学的灌流液の分析および組織学的分析を含むサンプル収集後に行われる事後測定のようなリアルタイム測定、。ここに述べた結果は、22灌流し、人間の肝臓からである。肝臓は、ドナーの年齢、過度の温阻血時間、生検の結果（脂肪症、炎症、線維症）と物流上の理由からなど、さまざまな理由から、移植のために拒絶された。 18肝臓を心臓死、次の調達、及び4脳死下記た。両方の場合において、ドナーは、ヘパリン30,000単位で前処理し、UW溶液でその場で、バックテーブルの上にフラッシュ。冷たい虚血時間は平均値は531±237（SD）分、平均温阻血時間は人生の撤退から測定し、27±10（SD）分であった冷たいフラッシュにサポート。事後測定を灌流した後明らかにされている間のリアルタイム観察及び測定は、潅流中に、肝臓を評価するために使用することができる。 リアルタイムの観測 肝臓を通る流れは冷たい肝臓における高抵抗の結果として、目標流量より低く始まる。肝臓は21まで温めた後、ターゲット·フローは、一般的に達成することができPV上の3 mmHgのとHA上の30 mmHgでの圧力を利用して&#160;灌流の60分（図1A）後のC°。胆汁の流れは、一般に、灌流の10分以内に観察することができ、灌流（図1B）の間に確実に生成される。胆汁量は肝臓の品質に依存し、18 ml /分/ kgの0.3ミリリットル/時間/ kgの肝臓の範囲である。より一層安定したまたはより短い温阻血時間の結果を向上させながら、より長い温阻血時間と肝臓では、胆汁流量は、先細りする傾向がある胆汁生産。 リアルタイム測定 両方の実験の目的には必須で血液ガス分析による灌流の直接的かつ頻繁な測定と同様に維持する十分な灌流状態、重要な酸素およびpH。溶存酸素分圧は、PVとHAの両方の流入に700 mmHgのよりも大きくなければならない。大静脈で測定流出酸素圧は、一般的に増加する酸素摂取量を反映して、より長い灌流低下する。以前は13であり、t = 3時間（図1C）で2.4〜9.7ミリリットルO 2 /分/ kgの灌流の開始時に0.5〜2.2ミリリットルO 2 /分/ kgの範囲であった説明したように、酸素摂取速度を算出することができる。 pHの低下は、主に、灌流液中の乳酸放出の結果として、最初の30分（図1D）において観察される。これは8.4％のナトリウムbicarboで補充によって支持することができるネイトは、約90分後にpHが戻って正常範囲に収まる。一般的に、8.4％の重炭酸ナトリウム30〜50ミリリットルを必要とされている。乳酸第一15〜30分で急速に濃度が増加するが、最初の時間（図1E）の後に死亡し始めます。 事後測定 そのようなALTなどの肝トランスアミナーゼは灌流液で測定することができる。最初の30分ではALTの大幅な増加は、一般的に虚血（図1F）の間にリリースされたALTの洗い出しを反映して観察される。 ALTは、温阻血時間13とよく相関することが示された。マシン灌流は回復エネルギー状態（図1G）を反映して、ATPのコンテンツを2.8倍に増加した。 H＆E組織学的分析は、マシン灌流（ 図1H、I）の間に持続的な追加の傷害を明らかにしなかった。これは、このプロトコルで提案検レジメンは解像度のためのものであることに留意すべきであるearchが目的や臨床目的のために適用できない場合があります。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52777/52777fig1.jpg" /> 図1：機械灌流中のヒトの肝臓の評価灌流（B）、酸素UPRATE速度（OUR）、流入の差から算出した（PVの時間当たりの定量化PVおよびHA SNMP（A）中、胆汁生産、フロースルー+ HA）および流出（大静脈）は、ラインが灌流液（F）、ATPへの灌流の間の灌流（C）、pHおよび乳酸中の入口および流出内の酸素分圧（D、E）、ALTの放出を示す中断（H）とした後（I）灌流の前に肝臓（54才DCD、19分温虚血、559分冷たい虚血）の毎時生検（G）とH＆E汚れから組織で測定されたコンテンツ。結果は、平均±SEMとして提示されている。 <aHREF = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/52777/52777fig1large.jpg&quot;ターゲット= &quot;_空白&quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Functional Human Liver Preservation and Recovery by Means of Subnormothermic Machine Perfusion

我々はsubnormothermic温度（21℃）で、ヒト肝臓移植片のex vivoでの機械灌流法を説明する。

Subnormothermicマシン灌流によって機能的なヒト肝臓保全と回復

There is currently a severe shortage of liver grafts available for transplantation.  Novel organ preservation techniques are needed to expand the pool of ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

16.7K ビュー.  Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School. 我々はsubnormothermic温度（21℃）で、ヒト肝臓移植片のex vivoでの機械灌流法を説明する。 

ビデオ: Functional Human Liver Preservation and Recovery by Means of Subnormothermic Machine Perfusion

Technique of Subnormothermic Ex Vivo Liver Perfusion for the Storage, Assessment, and Repair of Marginal Liver Grafts

The success of liver transplantation has resulted in a dramatic organ shortage. In most transplant regions 20-30% of patients on the waiting list for liver transplantation die without receiving an organ transplant or are delisted for disease progression. One strategy to increase the donor pool is the utilization of marginal grafts, such as fatty livers, grafts from older donors, or donation after cardiac death (DCD). The current preservation technique of cold static storage is only poorly tolerated by marginal livers resulting in significant organ damage. In addition, cold static organ storage does not allow graft assessment or repair prior to transplantation.
These shortcomings of cold static preservation have triggered an interest in warm perfused organ preservation to reduce cold ischemic injury, assess liver grafts during preservation, and explore the opportunity to repair marginal livers prior to transplantation. The optimal pressure and flow conditions, perfusion temperature, composition of the perfusion solution and the need for an oxygen carrier has been controversial in the past.
In spite of promising results in several animal studies, the complexity and the costs have prevented a broader clinical application so far. Recently, with enhanced technology and a better understanding of liver physiology during ex vivo perfusion the outcome of warm liver perfusion has improved and consistently good results can be achieved.
This paper will provide information about liver retrieval, storage techniques, and isolated liver perfusion in pigs. We will illustrate a) the requirements to ensure sufficient oxygen supply to the organ, b) technical considerations about the perfusion machine and the perfusion solution, and c) biochemical aspects of isolated organs.

Technique of Subnormothermic Ex Vivo Liver Perfusion for the Storage, Assessment, and Repair of Marginal Liver Grafts

Marginal grafts, such as fatty livers, grafts from older donors, or livers retrieved after cardiac death (DCD) tolerate conventional, cold static storage only poorly. We developed a novel model of subnormothermic ex vivo liver perfusion for preservation, assessment, and repair of marginal liver grafts prior to transplantation.

Subnormothermicのテクニック<em&gt;生体外</em&gt;肝臓ストレージ、評価のための灌流、およびマージナル肝移植片の修復

The success of liver transplantation has resulted in a dramatic organ shortage. In most transplant regions 20-30% of patients on the waiting list for ...

医学

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

The mainstay of contemporary therapies for extensive occlusive arterial disease is venous bypass graft. However, its durability is threatened by intimal hyperplasia (IH) that eventually leads to vessel occlusion and graft failure. Mechanical forces, particularly low shear stress and high wall tension, are thought to initiate and to sustain these cellular and molecular changes, but their exact contribution remains to be unraveled. To selectively evaluate the role of pressure and shear stress on the biology of IH, an ex&#160;vivo perfusion system (EVPS) was created to perfuse segments of human saphenous veins under arterial regimen (high shear stress and high pressure). Further technical innovations allowed the simultaneous perfusion of two segments from the same vein, one reinforced with an external mesh. Veins were harvested using a no-touch technique and immediately transferred to the laboratory for assembly in the EVPS. One segment of the freshly isolated vein was not perfused (control, day 0). The two others segments were perfused for up to 7 days, one being completely sheltered with a 4 mm (diameter) external mesh. The pressure, flow velocity, and pulse rate were continuously monitored and adjusted to mimic the hemodynamic conditions prevailing in the femoral artery. Upon completion of the perfusion, veins were dismounted and used for histological and molecular analysis. Under ex&#160;vivo conditions, high pressure perfusion (arterial, mean = 100 mm Hg) is sufficient to generate IH and remodeling of human veins. These alterations are reduced in the presence of an external polyester mesh.

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

The mechanisms leading to the development of intimal hyperplasia (IH) and vein graft failure are still poorly understood. This study describes an ex&#160;vivo system to perfuse human veins under controlled flow and pressure. Furthermore the efficiency of external mesh reinforcement to limit the development of IH was evaluated.

人間の伏在静脈のための手順<em&gt;生体外</em&gt;灌流および外部補強

The mainstay of contemporary therapies for extensive occlusive arterial disease is venous bypass graft. However, its durability is threatened by intimal ...

Isolated Hepatic Perfusion as a Treatment for Liver Metastases of Uveal Melanoma

Isolated hepatic perfusion (IHP) is a procedure where the liver is surgically isolated and perfused with a high concentration of the chemotherapeutic agent melphalan. Briefly, the procedure starts with the setup of a percutaneous veno-venous bypass from the femoral vein to the external jugular vein. Via a laparotomy, catheters are then inserted into the proper hepatic artery and the caval vein. The portal vein and the caval vein, both supra- and infrahepatically, are then clamped. The arterial and venous catheters are connected to a heart lung machine and the liver is perfused with melphalan (1 mg/kg body weight) for 60 min. This way it is possible to locally perfuse the liver with a high dose of a chemotherapeutic agent, without leakage to the systemic circulation.
In previous studies including patients with isolated liver metastases of uveal melanoma, an overall response rate of 33-100% and a median survival between 9 and 13 months, have been reported. The aim of this protocol is to give a clear description of how to perform the procedure and to discuss IHP as a treatment option for liver metastases of uveal melanoma.

Here, we present a protocol how to perform an isolated liver perfusion (IHP) with melphalan and we also discuss IHP as a treatment option for liver metastases of uveal melanoma.

ブドウ膜黒色腫の肝転移の治療として単離した肝灌流

Isolated hepatic perfusion (IHP) is a procedure where the liver is surgically isolated and perfused with a high concentration of the chemotherapeutic ...

Ex Situ Normothermic Machine Perfusion of Donor Livers

In contrast to conventional static cold preservation (0-4 &#176;C), ex situ machine perfusion may provide better preservation of donor livers. Continuous perfusion of organs provides the opportunity to improve organ quality and allows ex situ viability assessment of donor livers prior to transplantation. This video article provides a step by step protocol for ex situ normothermic machine perfusion (37 &#176;C) of human donor livers using a device that provides a pressure and temperature controlled pulsatile perfusion of the hepatic artery and continuous perfusion of the portal vein. The perfusion fluid is oxygenated by two hollow fiber membrane oxygenators and the temperature can be regulated between 10 &#176;C and 37 &#176;C. During perfusion, the metabolic activity of the liver as well as the degree of injury can be assessed by biochemical analysis of samples taken from the perfusion fluid. Machine perfusion is a very promising tool to increase the number of livers that are suitable for transplantation.

Ex Situ Normothermic Machine Perfusion of Donor Livers

Here we present a protocol describing oxygenated ex situ machine perfusion of donor liver grafts. This article contains a step by step protocol to procure and prepare the liver graft for machine perfusion, prepare the perfusion fluid, prime the perfusion machine and perform oxygenated normothermic machine perfusion of the liver graft.

In contrast to conventional static cold preservation (0-4 &#176;C), ex situ machine perfusion may provide better preservation of donor livers. Continuous ...

Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation

Kidney transplantation has become a well-established treatment option for patients with end-stage renal failure. The persisting organ shortage remains a serious problem. Therefore, the acceptance criteria for organ donors have been extended leading to the usage of marginal kidney grafts. These marginal organs tolerate cold storage poorly resulting in increased preservation injury and higher rates of delayed graft function. To overcome the limitations of cold storage, extensive research is focused on alternative normothermic preservation methods.
Ex vivo normothermic organ perfusion is an innovative preservation technique. The first experimental and clinical trials for ex vivo lung, liver, and kidney perfusions demonstrated favorable outcomes.
In addition to the reduction of cold ischemic injury, the method of normothermic kidney storage offers the opportunity for organ assessment and repair. This manuscript provides information about kidney retrieval, organ preservation techniques, and isolated ex vivo normothermic kidney perfusion (NEVKP) in a porcine model. Surgical techniques, set up for the perfusion solution and the circuit, potential assessment options, and representative results are demonstrated.

Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation

The severe organ shortage has resulted in increased use of marginal kidney grafts for transplantation. This has triggered interest in alternative storage methods, since marginal grafts especially tolerate cold storage poorly. The technique of normothermic ex vivo kidney perfusion (NEVKP) represents a novel preservation method for kidney grafts prior to &#160;transplantation.

正常温度の<em&gt;エクスビボ</em&gt;腎臓の保全のための腎臓の灌流は移植前の移植片

Kidney transplantation has become a well-established treatment option for patients with end-stage renal failure. The persisting organ shortage remains a ...

Generation of a Humanized Mouse Liver Using Human Hepatic Stem Cells

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in which the liver has been repopulated with functional human hepatocytes, could serve as a useful tool for investigating human hepatic cell biology, drug metabolism, and other preclinical applications. One of the key factors required for successful transplantation of human hepatocytes into mice is the elimination of the endogenous hepatocytes to prevent competition with the human cells and provide a suitable space and microenvironment for promoting human donor cell expansion and differentiation. To date, two major liver injury mouse models utilizing fumarylacetoacetate hydrolase (Fah) and uroplasminogen activator (uPA) mice have been established. However, Fah mice are used mainly with mature hepatocytes and the application of the uPA model is limited by decreased breeding. To overcome these limitations, Alb-toxin receptor mediated cell knockout (TRECK)/SCID mice were used for in vivo differentiation of immature human hepatocytes and humanized liver generation. Human hepatic stem cells (HpSCs) successfully repopulated the livers of Alb-TRECK/SCID mice that had developed lethal fulminant hepatic failure following diphtheria toxin (DT) treatment. This model of a humanized liver in Alb-TRECK/SCID mice will have functional applications in studies involving drug metabolism and drug-drug interactions and will promote other in vivo and in vitro studies.

Here, we present a novel humanized mouse liver model generated in Alb-toxin receptor mediated cell knockout (TRECK)/SCID mice following the transplantation of immature and expandable human hepatic stem cells.

ヒト肝幹細胞を用いたヒト化マウス肝臓の生成

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in ...

Method of Direct Segmental Intra-hepatic Delivery Using a Rat Liver Hilar Clamp Model

Major hepatic surgery with inflow occlusion, and liver transplantation, necessitate a period of warm ischemia, and a period of reperfusion leading to ischemia/reperfusion (I/R) injury with myriad negative consequences. Potential I/R injury in marginal organs destined for liver transplantation contributes to the current donor shortage secondary to a decreased organ utilization rate. A significant need exists to explore hepatic I/R injury in order to mediate its impact on graft function in transplantation. Rat liver hilar clamp models are used to investigate the impact of different molecules on hepatic I/R injury. Depending on the model, these molecules have been delivered using inhalation, epidural infusion, intraperitoneal injection, intravenous administration or injection into the peripheral superior mesenteric vein. A rat liver hilar clamp model has been developed for use in studying the impact of pharmacologic molecules in ameliorating I/R injury. The described model for rat liver hilar clamp includes direct cannulation of the portal supply to the ischemic hepatic segment via a side branch of the portal vein, allowing for direct segmental hepatic delivery. Our approach is to induce ischemia in the left lateral and median lobes for 60 min, during which time the substance under study is infused. In this case, pegylated-superoxide dismutase (PEG-SOD), a free radical scavenger, is infused directly into the ischemic segment. This series of experiments demonstrates that infusion of PEG-SOD is protective against hepatic I/R injury. Advantages of this approach include direct injection of the molecule into the ischemic segment with consequent decrease in volume of distribution and reduction in systemic side effects.

A unique rat liver hilar clamp model was developed for studying the impact of pharmacologic molecules in ameliorating ischemia-reperfusion injury. This model includes direct cannulation of the portal supply to the ischemic liver segment via a branch of the portal vein, allowing for direct hepatic delivery.

ラット肝臓肝門部クランプモデルを用いたダイレクトセグメント別肝臓内送達方法

Major hepatic surgery with inflow occlusion, and liver transplantation, necessitate a period of warm ischemia, and a period of reperfusion leading to ...

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, normothermic ex vivo liver perfusion (NEVLP) has been introduced as a method to evaluate and modify organ function. NEVLP has many advantages in comparison to hypothermic and subnormothermic perfusion including reduced preservation injury, restoration of normal organ function under physiologic conditions, assessment of organ performance, and as a platform for organ repair, remodeling, and modification. Both murine and porcine NEVLP models have been described. We demonstrate a rat model of NEVLP and use this model to show one of its important applications &#8212; the use of a therapeutic molecule added to liver perfusate. Catalase is an endogenous reactive oxygen species (ROS) scavenger and has been demonstrated to decrease ischemia-reperfusion in the eye, brain, and lung. Pegylation has been shown to target catalase to the endothelium. Here, we added pegylated-catalase (PEG-CAT) to the base perfusate and demonstrated its ability to mitigate liver preservation injury. An advantage of our rodent NEVLP model is that it is inexpensive in comparison to larger animal models. A limitation of this study is that it does not currently include post-perfusion liver transplantation. Therefore, prediction of the function of the organ post-transplantation cannot be made with certainty. However, the rat liver transplant model is well established and certainly could be used in conjunction with this model. In conclusion, we have demonstrated an inexpensive, simple, easily replicable NEVLP model using rats. Applications of this model can include testing novel perfusates and perfusate additives, testing software designed for organ evaluation, and experiments designed to repair organs.

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

There is a significant liver donor shortage, and criteria for liver donors have been expanded. Normothermic ex vivo liver perfusion (NEVLP) has been developed to evaluate and modify organ function. This study demonstrates a rat model of NEVLP and tests the ability of pegylated-catalase, to mitigate liver preservation injury.

Ex Vivo常温肝灌流の小さな動物モデル

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, ...

Functional Characterization of Endogenously Expressed Human RYR1 Variants

More than 700 variants in the RYR1 gene have been identified in patients with different neuromuscular disorders including malignant hyperthermia susceptibility, core myopathies and centronuclear myopathy. Because of the diverse phenotypes linked to RYR1 mutations it is fundamental to characterize their functional effects to classify variants carried by patients for future therapeutic interventions and identify non-pathogenic variants. Many laboratories have been interested in developing methods to functionally characterize RYR1 mutations expressed in patients&#39; cells. This approach has numerous advantages, including: mutations are endogenously expressed, RyR1 is not over-expressed, use of heterologous RyR1 expressing cells is avoided. However, since patients may present mutations in different genes aside RYR1, it is important to compare results from biological material from individuals harboring the same mutation, with different genetic backgrounds. The present manuscript describes methods developed to study the functional effects of endogenously expressed RYR1 variants in: (a) Epstein Barr virus immortalized human B-lymphocytes and (b) satellite cells derived from muscle biopsies and differentiated into myotubes. Changes in the intracellular calcium concentration triggered by the addition of a pharmacological RyR1 activators are then monitored. The selected cell type is loaded with a ratiometric fluorescent calcium indicator and intracellular [Ca2+] changes are monitored either at the single cell level by fluorescence microscopy or in cell populations using a spectrofluorometer. The resting [Ca2+], agonist dose response curves are then compared between cells from healthy controls and patients harboring RYR1 variants leading to insight into the functional effect of a given variant.

Here methods used to study the functional effect of RYR1 mutations endogenously expressed in Epstein Barr Virus immortalized human B-lymphocytes and muscle biopsy derived satellite cells differentiated into myotubes are described.

内在的に発現したヒトRYR1変異体の機能特性評価

More than 700 variants in the RYR1 gene have been identified in patients with different neuromuscular disorders including malignant hyperthermia ...

Dynamic Navigation in Endodontics: Guided Access Cavity Preparation by Means of a Miniaturized Navigation System

In the case of teeth with pulp canal calcification (PCC) and apical pathology or pulpitis, root canal treatment can be very challenging. PCC are common sequelae of dental trauma but can also occur with stimuli such as caries, bruxism, or after placing a restoration. In order to access the root canal as minimally invasive as possible in case of a necessary root canal treatment, dynamic navigation has recently been introduced in endodontics in addition to static navigation. The use of a dynamic navigation system (DNS) requires pre-operative cone-beam computed tomography (CBCT) imaging and a digital surface scan. If necessary, reference markers must be placed on the teeth before the CBCT scan; with some systems, these can also be planned and created digitally afterward. By means of a stereo camera connected to the planning software, the drill can now be coordinated with the help of reference markers and virtual planning. As a result, the position of the drill can be displayed on the monitor in real-time during preparation in different planes. In addition, the spatial displacement, the angular deviation, and the depth position are also displayed separately. The few commercially available DNS mostly consist of relatively large camera-marker-systems. Here, the DNS contains miniaturized components: a low-weight camera (97 g) mounted on the micromotor of the electric handpiece utilizing a manufacturer-specific connecting mechanism and a small marker (10 mm x 15 mm), which can be easily attached to an individually manufactured intraoral tray. For research purposes, a post-operative CBCT scan can be matched with the pre-operative one, and the volume of tooth structure removed can be calculated by the software. This work aims to present the technique of guided access cavity preparation by means of a miniaturized navigation system from imaging to clinical implementation.

Dynamic navigation systems (DNS) provide real-time visualization and guidance to the operator during endodontic access cavities preparation. The planning of the procedure requires three-dimensional imaging utilizing cone beam computed tomography and surface scans. After the export of the planning data to the DNS, access cavities can be prepared with minimal invasion.

歯内療法におけるダイナミックナビゲーション:小型ナビゲーションシステムによるガイド付きアクセスキャビティ準備

In the case of teeth with pulp canal calcification (PCC) and apical pathology or pulpitis, root canal treatment can be very challenging. PCC are common ...