マウスにおけるノルマザーミックなex vivo肝機械灌流。ノルマザーの酸素化肝灌流は、辺縁臓器を救済するための有望な戦略であり、最近臨床診療で導入されています。しかし、その根底にある分子メカニズムはよくわかっていません。
トランスジェニックマウスなどの遺伝子改変動物を利用して、分子経路をさらに研究するにはマウスモデルが必要であり、マウス肝臓の正常体温酸素化機械灌流システムの確立が待たれています。これが私たちのシステム全体のスキームです。まず、システム全体は、水循環によるサーモスタットコントローラーによって摂氏37度に制御されます。
灌流液は、蠕動ポンプによってリザーバーから酸素発生器にポンプで送られます。酸素発生器には、95%の酸素と5%の二酸化炭素の途切れることのないガスの流れがあります。その後、灌流液はバブルトラップを通過します。
気泡を含む灌流液は、加圧下でリザーバーにポンプで戻されます。残りの灌流液は臓器室に流れ、そこでチューブは門脈に接続されます。灌流液は肝臓から肝上カバを通って臓器腔に排出されます。
臓器室からの灌流液の流出は、蠕動ポンプによってリザーバーに戻されます。胆汁を集めるために胆汁排液チューブが臓器室に接続されています。これが私たちの手術台です。
すべての手術は顕微鏡下で行われます。私たちは、外科的処置を通して半滅菌操作条件を維持します。フレンチチューブカニューレを鉗子で持ちます。
カニューレの端から1センチメートルの距離で30Gの針でカニューレ壁を貫通します。針の先端が見えるようになるまで、針をカニューレに通します。これは26Gカテーテルと自作カニューレの比較写真です。どちらもマウスポータルカニュレーションに適しています。
1ミリリットルあたり2, 500国際単位の最終濃度で25ミリリットルのヘパリン化生理食塩水を調製し、摂氏40度に設定したインキュベーターにシリンジを置く。これがex-vivo標準体温機械灌流システムの主なコンポーネントです。コンポーネントには、主に臓器室、サーモスタットマシン、ローラーポンプ、酸素発生器、およびリザーバーが含まれます。
ここでは、私たちの臓器室の詳細なセットアップを見ることができます。基本的には、臓器室本体、圧力センサー、熱交換器、バブルトラップで構成されています。灌流入口、灌流出口、胆汁排出口を設置しました。
これは、門脈圧のモニタリングに使用するアナログ・デバイセズのモニタリング・システムです。アナログ・デバイセズのシステムは、圧力センサー、中央コントローラ、ディスプレイで構成されています。圧力監視のためにLabChartプログラムをオンにします。
圧力センサーを使用する前に、校正とゼロ調整が必要です。ゼロミリメートル水銀と20ミリメートル水銀をマークとして使用して、2段階校正用の圧力センサーを校正します。門脈圧の常時監視に基づいて、圧力変化に応じて門脈フルランを調整することができます。
システムをプライミングするためにリザーバーと臓器室に同量の灌流液を供給する場合、充填プロセス中に無菌性を維持するために特別な注意を払う必要があります。誘導室を壁のコンセントに接続します。酸素を毎分0.5リットルにします。
イソフルランを3%に回します深い麻酔に達するまで動物をチャンバーに入れます。マイクロシリンジを使用して、体重に適合した用量の鎮痛剤を適用します。ここでは、7マイクロリットルのブプレノルフィン。
さあ、手術を始めます。マウスの腹部を横切開します。皮膚切開は両側の両側肉腋窩線まで伸びています。
慎重にラインアルバに沿って縦方向の切開を行います。電気凝固とはさみで腹筋層を切ります。肝臓を電気凝固から保護するために、湿ったガーゼを慎重に置きます。
マウスの腹腔を完全に露出させる。湿った綿棒で小腸を腹腔から慎重に移動させ、丘を完全に露出させます。ここに示すのは、門脈カニュレーションと胆管カニュレーションの模式図です。
基本的にはマウスの大きさに合わせて適切なカニューレを選び、カニューレの固定には6-0のシルク縫合糸を使用します。歯のない細かい湾曲した鉗子を使用して、総胆管を慎重に解放します。総胆管は非常に簡単に損傷して壊れます。
一度壊れると、カニューレ挿入することはできません。解剖学的位置の方向により、湾曲した鉗子は操作が簡単です。次のステップに備えて、2つの6-0シルク縫合ループを総胆管の上に置きます。
30Gの針で胆管を慎重に穿刺します。先のとがった湾曲した鉗子を使用して小さな穴を拡大し、胆管カニュレーションを供給できるようにします。胆管カニューレを横切って血管カニューレ鉗子を使用し、胆管に押し込みます。手記。
カニュレーションの瞬間に、あなたは胆汁によってもたらされる抵抗を感じるでしょう。力が十分に制御されていない場合、カニューレは胆汁流出の圧力によって胆道から押し出されます。カニューレの深さを慎重に調整します。
深すぎると胆管を傷つけたり、深すぎると抜け落ちたりすることがあります。カニューレ挿入が成功した後、カニューレに胆汁の流れが観察されます。平らな鉗子で門脈を固定し、湾曲した鉗子で結合組織を慎重に解放します。
門脈の裂け目を引き起こさないように、ここで強く引っ張らないでください。門脈が損傷すると、門脈をカニューレ挿入することは困難です。2つの6-0シルク縫合糸ループを無料の門脈の上に置きます。
動脈クリップを使用して遠位門脈を閉じます。上記の門脈カニューレのいずれかで門脈を非常に慎重に穿刺します。穿刺が成功した後、カニューレ内の血流がはっきりと観察できます。
インキュベーターから予熱したヘパリン生理食塩水を取ります。気泡をすべて取り除きます。予熱したヘパリン化生理食塩水でシリンジをシリンジポンプに固定します。
シリンジポンプの延長チューブを門脈のカニューレに接続します。速度を毎分2ミリリットルに調整し、肝臓の紅潮を開始します。イソフルランを5%に増やし、過剰摂取のイソフルラン吸入でマウスを安楽死させる。
紅潮手順の最後に肝臓の色を観察します。色が均一な黄色に変わったら肝臓を切除します。ペトリ皿を使用して肝臓を臓器室に慎重に移します。
肝臓がつぶれるのを防ぐために、ペトリ皿に少量の生理食塩水を保管してください。手記。門脈と胆管はこの手順中に簡単にねじれる可能性があり、肝灌流と胆汁収集に影響を与える可能性があります。通常の生理食塩水を注射器で門脈カニューレにゆっくりと注入し、カニューレ内の気泡を排出します。
門脈カニューレを臓器室の灌流液流出チューブに接続します。マウス胆管カニューレは、ゴム製のキャップで閉じられている臓器室の弁を通して導かれる。次に、胆汁チューブを、リードに小さな穴を開けた事前に準備された0.5ミリリットルのマイクロチューブに挿入します。
すべてが接続されたら、蠕動ポンプをオンにします。門脈圧の読み取り値をチェックして、流量を調整します。流量を調整して、門脈圧を7〜10ミリメートル水銀柱に維持します。手記。
公称流量は、チューブの年齢や位置によってわずかに異なる場合があります。これは、正常体温酸素化ラット肝機械灌流研究の文献精密検査に基づく灌流液媒体、灌流液量、および灌流圧力の選択です。これは、マウス灌流モデルを確立するための段階的な試行です。
最適なカテーテルを選択するのに約14回の実験が必要でした。私たちの手では、門脈に2つのフランスのゴム製カテーテルを使用し、胆管に1つのフランスのゴム製カテーテルを使用することは、すべてのカテーテルを所定の位置に置いた状態で均一な灌流を達成するための最良の組み合わせです。pHレベルおよびカリウムレベルは、12時間の灌流を通して安定していた。
pHレベルは7.26〜7.71の範囲であり、カリウムレベルは1リットルあたり5.9〜6.8ミリモルの範囲でした。HE染色は、12時間の灌流後、マウス肝臓の組織学的完全性が比較的良好に保存されたことを示している。まとめると、マウス肝臓用の恒温酸素化機械灌流システムの確立に成功しました。
マウス肝臓を12時間灌流すると、肝臓の形態が良好に保存されましたが、臓器全体ではありませんでした。より長い期間にわたって完全な均質灌流を達成するには、さらなる努力が必要である。これが達成されると、炎症の役割を調べるためにIL-2-ノックアウトマウスを使用するなど、遺伝子組み換え動物の使用を検討することができます。
