O financiamento dos Institutos Nacionais de Saúde (concede R01EB008678, R01DK096075, R01DK084053, R00DK088962 e F32 DK103500), Projeto CIMIT No. 12-1732 e os Shriners Hospitals for Children é reconhecido agradecimento. Gostaríamos de agradecer também à New England Organ Banco para apoiar este trabalho.

O uso de tecidos humanos deve ser revista por um conselho de revisão institucional (IRB) ou equivalente. O trabalho aqui descrito foi aprovado e declarado isento pelo Hospital Institutional Review Board Geral de Massachusetts (No. 2011P001496). 1. Preparação de Solução <ol><li> Adicionar assepticamente suplementos para vermelho de fenol Williams &#39;medium E, conforme descrito na Tabela 1. A solução deve ser preparada antes da utilização. A insulina deve ser adicionado imediatamente antes da utilização. </li></ol> 2. Voltar Tabela Preparação do Fígado <ol><li> Coloque uma tigela órgão cheio de gelo em uma superfície estéril, drapeado. Retire o fígado a partir da caixa, deixando-o no saco de solução de preservação frio. Mantenha o fígado principalmente submerso. </li><li> Identificar a artéria hepática (HA), que será localizada distalmente ao remendo aórtico. Dissecar livre da artéria para revelar vários ramos cortados ao longo do comprimento com uma tesoura Metzenbaum. Cuidadosamente Dissect todo o comprimento da artéria para evitar cortar um vaso que alimenta o fígado. Não corte ou amarrar ramos que não têm um fim visível. </li><li> Tie fora todos os ramos arteriais que não fornecem o fígado usando sutura de seda de tamanho variando de 0 a 4-0, dependendo do tamanho do vaso. Fechar filiais que são demasiado curto para amarrar ou buracos na artéria com um ponto de prolene 7-0. Tie e cortar as artérias esplênica e gástrica esquerda perto de sua origem no tronco celíaco. </li><li> Remova o sistema da aorta cortando o tronco celíaco diretamente sob o patch. Canular tronco celíaco utilizando a cânula aórtica. </li><li> Identifique a veia porta (PV) e sem rodeios dissecá-lo livre. Empate fora quaisquer ramos e cannulate o PV com o segmento preparado de tamanho 24 tubos. </li><li> Remover seções do diafragma da veia cava supra-hepática, sem cortar a própria veia. Do fluxo de saída a partir dos drenos da veia cava directamente para dentro da câmara de órgãos. </li><li> Corte 2 full-ti circunferênciassue amostras (2-3 mm de comprimento) a partir da extremidade do ducto biliar comum; congelar uma pressão em azoto líquido (armazenar a -80 ° C) e armazenar o outro em formalina tamponada a 10%, de tecidos e para análise histológica, respectivamente. Canular do ducto biliar comum com a cânula navio e um tubo de drenagem feita de tubos de oxigenador de membrana. </li><li> Identificar e ligadura do ducto cístico com um empate 0 seda. O ducto cístico é encontrada entre o ducto biliar comum e da vesícula biliar. </li><li> Conecte o flush tubo definido para sacos de gelo-frio de solução de Ringer com lactato (LR) e prepare o tubo, retirando todo o ar. </li><li> Ajuste o regulador de fluxo na tubulação de descarga a um gotejamento lento. Antes de ligar o tubo de descarga para a cânula na veia portal, oclusão da veia porta com os dedos no hilo e encher a cânula e veia com descarga para remover o ar a partir da veia porta. Não elevar o saco mais de 20 cm acima da altura do fígado durante a lavagem frio a fim de evitar uma pressão excessiva sobre oveia. </li><li> Durante o flush brevemente ocluir o PV no ponto mais baixo. Examine o PV se há vazamentos. Ramos do navio pode ser fechado como descrito acima. Lavar o fígado através da PV com um total de 2 L de gelo-LR frio. </li><li> Repita os passos de 2.10, 2.11 para o HA com 1 L de LR. </li></ol> 3. Operação do sistema SNMP <ol><li> Primeiro o aparelho de perfusão através da adição de 2 L de perfusato (21 ° C) para a bacia de órgãos e de iniciar o dispositivo para preparar o tubo. Seguir as instruções do dispositivo para preparar a perfusão, ajustando a temperatura para 21 ° C. Comece com pressões de 3 mmHg e 30 mmHg no PV e HA, respectivamente. Abra o tanque de gás e ajustado para um caudal de 3 L / min. </li><li> Tomar uma amostra de gás no sangue, tanto do ingresso HA e PV desenhando uma amostra a partir dos portos de amostra de 0,3 ml e executá-lo na máquina de gasometria de acordo com as instruções do fabricante. Confirme oxigenação adequada (pO 2&gt; 700 mmHg) e pH (7,35-7,45). </li><li> Antes do fígado está ligado tomar uma amostra de 1,0 ml de solução de perfusão como a = 0 a medição em um tubo eppendorf e armazenar a -80 ° C. Corte duas ± 250 biópsias cunha mg do fígado usando uma lâmina de aço único gumes; congelar uma pressão em azoto líquido (armazenar a -80 ° C) e armazenar o outro em formalina a 10% tamponada. Pesa-se o fígado antes da perfusão. </li></ol> 4. Human Liver Perfusão <ol><li> Transferir o fígado para o dispositivo. Ligue a entrada PV à cânula PV, após a remoção de ar do PV como na etapa 2.10. Ligue o HA de um modo semelhante. Definir PV e pressão HA para 3 e 30 mmHg. O fígado deve ser quase submerso por perfusato. Cubra todas as superfícies secas, incluindo os navios de afluência, com gaze estéril molhado para evitar a desidratação </li><li> Deixe o dreno tubulação bile em um recipiente de coleta. Certifique-se a abertura do ralo biliar é ao nível do fígado ou inferior para permitir que a bile para executar out livremente. </li><li> As taxas de fluxo alvo são 275-325 ml / min.kg e 50-100 ml / min.kg para a PV e HA respectivamente uma vez que o fígado tem aquecido a 21 ° C. Uma vez que cada fígado reage de forma diferente à perfusão, monitorar o fluxo de perto durante os primeiros minutos. Aumentar ou diminuir a pressão em qualquer um dos recipientes, se as taxas de fluxo alvo não são atingidos. Não exceda 50 mmHg na HA e 5 mmHg no PV. </li><li> As amostras podem ser tomadas a partir do tecido do fígado, do perfusato e biliar no preferência investigadores. Recomendamos, no mínimo, o seguinte esquema de coleta de amostras durante a perfusão. <ol><li> Biópsias de tecidos, n = 2 x 250 mg, a cada hora. Armazenamento: tirar congelar um em nitrogênio líquido e armazenar a -80 ° C a longo prazo. Além disso, tomar outra biópsia antes e após a perfusão e corrigir em formalina a 10% tamponada (n = 1) </li><li> As amostras de perfusado, n = 2 x 1 ml, cada 15 minutos durante a primeira hora e, posteriormente, a cada 30 min. Desenhe amostras da inf PVbaixo porta amostra. Armazenagem: -80 ° C a longo prazo. </li><li> Gasometria do PV e HA ingresso e saída da veia cava. n = 3 X 0,3 ml, cada 30 minutos. Desenhe amostras, tanto do PV e portas de amostra de HA. Desenhar uma amostra a partir da veia cava de 0,3 ml por inserção de uma seringa na veia e executado directamente no analisador de gás do sangue. Através da saída para assegurar a oxigenação e pH adequado. </li><li> Produção de bílis, n = 1 x 1 ml, a cada hora. Visualmente quantificar a produção de bile a cada hora e tirar uma amostra do recipiente de coleta. Renove o recipiente após a colheita. Armazenamento: gelo seco e -80 ° C a longo prazo. </li></ol></li><li> Continuar a perfusão durante 3 horas. Controlo da pressão, pH e da oxigenação e da colheita de amostras por toda parte. Ajuste o pH se por adição de bicarbonato de sódio à solução de perfusão. </li><li> No final da perfusão tomar as amostras finais, enquanto o fígado é perfundido. Desligue o fígado e retirar a cânula do canal biliar. Tome 2 amostras de tecido pós-perfusão doducto biliar, tal como descrito antes, para armazenamento a -80 ° C e em 10% de formalina tamponada. </li><li> Descartar o fígado humano seguindo orientações de material biológico adequado. </li></ol>

<ol>
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Drs. SER Uygun, K Uygun e Yarmush são inventores sobre a patente pendente que é relevante para este estudo (WO / 2011/002926), e os Drs. SER Uygun, K Uygun e Yarmush são inventores sobre a patente pendente que é relevante para este estudo (WO / 2011/35223). Drs. K Uygun e Bruinsma ter um pedido provisório de patente relacionada a este trabalho. Dr. K Uygun e BE Uygun têm um interesse financeiro em órgão Solutions, uma empresa focada no desenvolvimento de tecnologia de preservação de órgãos. Dr. K Uygun e BE interesses da uygun são geridos pelo MGH and Partners HealthCare, de acordo com o seu conflito de políticas de juros.

Em uma tentativa de recuperar fígados feridos durante a isquemia, desenvolvemos um sistema SNMP que pode ser empregada após um período de armazenamento refrigerado. Máquina de perfusão Subnormothermic oferece uma alternativa viável para o armazenamento refrigerado convencional, assim como as modalidades de perfusão máquina hipotérmicos e normotérmicas. Existem vários sistemas diferentes; todos oferecem diferentes vantagens e desvantagens 3,9,20. SNMP permite a perfusão sem uma transportadora de oxigênio, como demanda de oxigênio metabólicas em 21 ° C são atendidas por oxigenação ativa do perfusato. Embora reduzido em condições subnormothermic, o metabolismo é substancial e requer o apoio de uma solução de perfusão rico em nutrientes. Soluções para perfusão tradicionais, tais como a solução de perfusão máquina Belzer, são geralmente mínima na composição e são projetados para perfusão frio. Williams Meio E tem sido utilizado como um meio de cultura de hepatócitos por muitos anos, e contém componentes que são universais para suportar a função celular, em especial no âmbito ex vivo condições quentes. As medições efectuadas durante a perfusão máquina são o reflexo da função do órgão. Parâmetros diretamente observáveis, como a produção de bílis e consumo de oxigênio são medições em tempo real que podem ser usados ​​para avaliar a pré-transplante de fígado. Similarmente, os marcadores de isquemia e lesão celular (K +, libertação de lactato) pode ser medida directamente na solução de perfusão e pode ser indicativo de função do órgão 20. Como a tecnologia de máquina de perfusão desenvolve e atinge aplicação clínica mais ampla, as correlações precisas entre ex vivo função e evolução clínica pode ser feito e parâmetros de perfusão será útil em ajudar decisões para transplante ou rejeitam fígados marginal qualidade. Além disso, como ponto-de ferramentas analíticas cuidados de antecedência, a análise mais sofisticada ficará disponível diretamente durante máquina perfusion 21. Neste trabalho, mostramos que os fígados podem ser suportados no sistema SNMP com lesão mínima para o fígado, refletida pela histologia e liberação de ALT. A recuperação funcional do fígado é melhor reflectida pela ATP, o que foi mostrado para correlacionar a viabilidade fígado e é fortemente sugestiva de sucesso do transplante em modelos animais 22. Ex vivo e recuperação de pré-transplante de enxertos de fígado iria permitir uma expansão significativa do dador piscina fígado, corrigir a disparidade entre a oferta e demanda de fígados de doadores no transplante.

O transplante de fígado é o único tratamento curativo para dezenas de milhares de pacientes que sofrem de estágio final da doença hepática. Para facilitar o transplante bem sucedido, preservação óptima do fígado a partir do momento em que é obtido a partir do dador, até o momento em que são implantadas no receptor é necessário para evitar a deterioração rápida do enxerto. A norma actual para preservação fígado é denominado «armazenamento frio estático &#39;: o fígado é arrefecida numa solução de preservação gelada, reduzindo, assim, o metabolismo do fígado e abrandar os efeitos deletérios da isquemia. Embora esta técnica de armazenamento a frio tem permitido para transplante bem-sucedido, os órgãos de qualidade marginal, como órgãos DCD danificadas por isquemia quente ou esteatose mostra paciente inferior resultados 1. Há um corpo em rápida expansão de evidências de que ex vivo máquina de perfusão de enxertos de fígado como uma modalidade alternativa de preservação pode, potencialmente, improvar os resultados para esses órgãos marginais 2,3. O transplante de fígado tornou-se vítima do seu próprio sucesso. Far mais pacientes são encaminhados para transplante do que há fígados disponíveis, e milhares morrem na lista de espera nos Estados Unidos a cada ano. Dada a realidade da escassez de doadores de fígado e à crescente utilização de enxertos de fígado de qualidade abaixo do ideal para os destinatários carentes, é amplamente difundida de que ex vivo máquina de perfusão de enxertos de fígado antes da implantação mantém a promessa de uma mudança de paradigma no transplante de fígado. Houve um aumento acentuado no interesse em pesquisas sobre este tema nos últimos anos 08/04. Em vários centros europeus e norte-americanos máquina de perfusão hipotérmica fez uma introdução 8 e normotérmica perfusão clínica máquina a temperaturas fisiológicas foi recentemente aplicada aos fígados humanos descartados e está sendo traduzido para o uso clínico, bem 9.Extenso desenvolvimento conduziu ao desenvolvimento de vários protocolos, enquanto a optimização contínua identifica a perfusão óptima parâmetros 10-12. O uso de enxertos marginal de qualidade aumentou mais de 10 vezes ao longo da última década 13. Quando comparado com o padrão atual para a preservação do fígado (armazenamento a frio estático), ex vivo máquina de perfusão proporciona inúmeros benefícios potenciais, os quais resultam em expansão muito necessária para a piscina do órgão e um potencial diminuição na incidência de complicações pós-transplante. Em particular, as complicações biliares que atualmente afligem enxertos hepáticos abaixo do ideal de qualidade após o transplante continuam a ser um problema substancial 14-18. Máquina de perfusão em condições subnormothermic fornece uma janela de tempo para avaliar a função do enxerto objetivamente como a aptidão para o transplante de 19. Enquanto o fígado está a ser perfundido num circuito ex vivo, tanto a um perfusadond a bile produzida durante a perfusão podem ser degustados para medição de marcadores de função do órgão. Desta forma &quot;gravemente comprometida&quot; fígados que são descartados para transplante de acordo com os critérios atuais podem ser objetivamente avaliados quanto à sua adequação para transplante. Avaliação da viabilidade permite potencialmente que para muitos destes órgãos a serem utilizadas para o transplante. Um igualmente poderoso benefício da máquina de perfusão é o reparo e melhoria de fígados que foram danificados por isquemia quente / frio. ATP está esgotado muito rapidamente durante a isquemia fria quente e posterior e pode ser repleted durante um período de máquina de perfusão antes da implantação do fígado 20. O fígado, com suas reservas de energia e estado metabólico reabastecido, está pré-condicionado e melhor preparados para os efeitos prejudiciais de lesão de reperfusão após o implante no receptor. Este trabalho descreve um método de máquina de perfusão ex vivo de fígado humano grafts em laboratório, o que será útil para pesquisadores que desejam estudar tanto a técnica e os efeitos benéficos do ex vivo máquina de perfusão. Nós fazemos uso de fígados de doadores humanos que tenham sido recusados ​​para o transplante e depois são alocados para fins de investigação. Norma técnica procurement fígado envolve em resplendor arterial situ do fígado após o pinçamento no cérebro doadores mortos (DBD) ou após a parada circulatória em doadores circulatórios morte (DCD), descritos em mais detalhes em outro lugar 20. Além disso, o fígado é resfriado durante a aquisição através do preenchimento da cavidade abdominal do doador com gelo. Lavar as preferências soluções variar entre regiões, com a maioria dos processos de aquisições utilizando a Universidade de solução de histidina-triptofano-cetoglutarato (HTK) ou Wisconsin. Uma descarga adicional back-mesa da veia portal melhora a lavagem de sangue residual. Os fígados são muitas vezes adquiridos no deixando um segmento de aorta surarredondamento do tronco celíaco. A vesícula biliar é entalhada, bile é aspirado, e do ducto biliar é liberado. Os fígados são embalados em sacos estéreis contendo solução de conservação gelada e transportados em caixas designadas ou refrigeradores. Para obter resultados representativos tempo de isquemia quente e frio deve ser limitado a 60 minutos e 12 horas, respectivamente. Apesar de triagem sorológica de rotina para patógenos transmissíveis, devem ser tomadas precauções padrão quando da entrega órgãos humanos, as amostras obtidas a partir de órgãos humanos, e quaisquer produtos residuais. O protocolo aqui descreve máquina de perfusão subnormothermic utilizando um dispositivo de perfusão do fígado disponível comercialmente. O uso de tal dispositivo permite mais rápida tradução para o contexto clínico e validação cruzada de diferentes protocolos e configurações do dispositivo, entre grupos de pesquisa e centros de transplante.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Liver Assist perfusion device</td>
			<td>Organ Assist B.V.</td>
			<td>Liver Assist</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liver Assist disposable set</td>
			<td>Organ Assist B.V.</td>
			<td>Liver Assist disposable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Williams&#8217; Medium E</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W1878&#8211;6x500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Eli Lilly &#38; Co</td>
			<td>Humulin R U-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin 5,000 U/ml</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030-156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>MGH pharmacy</td>
			<td>7750500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbogen gas tank 95% O2/5% CO2</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>ZO2OX9522000043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specialty gas regulator</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>Y11244D580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactated Ringer&#8217;s solution</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>2B2324X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% neutral buffered formalin</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>316-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toothed Adson forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Debakey tissue forceps, 7.75&#8221;, 2.25 mm</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-7562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metzenbaum Scissors 7&#34; Curved SureCut Tungsten</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6965SC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Castroviejo Needle holder 5.5&#8211;7&#8221;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12565-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0 blackbraided silk sutures</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>SA66G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 nylon suture, Nurolon RB1</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>C554D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood gas analysis machine</td>
			<td>Siemens</td>
			<td>RapidPoint 500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balance scale</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-10000-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure display box</td>
			<td>Medtronic</td>
			<td>66000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable pressure display sets</td>
			<td>Medtronic</td>
			<td>61000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handheld thermocouple thermometer and probe</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td colspan="2">EW-91500-04 and EW-08516-55</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acorn-tipped vessel cannula, 4 mm</td>
			<td>Medtronic</td>
			<td>30005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Irrigation set flush tubing</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>06543-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixing bowl, 4L</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-07300-40</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional human liver preservation and recovery by means of subnormothermic machine perfusion

There is currently a severe shortage of liver grafts available for transplantation. Novel organ preservation techniques are needed to expand the pool of donor livers. Machine perfusion of donor liver grafts is an alternative to traditional cold storage of livers and holds much promise as a modality to expand the donor organ pool. We have recently described the potential benefit of subnormothermic machine perfusion of human livers. Machine perfused livers showed improving function and restoration of tissue ATP levels. Additionally, machine perfusion of liver grafts at subnormothermic temperatures allows for objective assessment of the functionality and suitability of a liver for transplantation. In these ways a great many livers that were previously discarded due to their suboptimal quality can be rescued via the restorative effects of machine perfusion and utilized for transplantation. Here we describe this technique of subnormothermic machine perfusion in detail. Human liver grafts allocated for research are perfused via the hepatic artery and portal vein with an acellular oxygenated perfusate at 21 &#176;C.

Uma série de observações e análises podem ser executadas no fígado durante a perfusão, incluindo observações directas tempo real, tais como as taxas de fluxo e a produção de bílis; medições em tempo real, tais como análise de gases do perfusato, e as medidas pós-hoc que são feitas após a coleta da amostra, incluindo a análise bioquímica do perfusato e tecido e análise histológica. Os resultados mencionados aqui são de 22 fígados humanos perfundidos. Os fígados foram rejeitados para transplante, por várias razões, incluindo a idade do doador, tempo de isquemia quente excessiva, os resultados da biópsia (esteatose, inflamação, fibrose) e por razões logísticas. 18 fígados foram adquiridos após a morte cardíaca, e 4, após a morte encefálica. Em ambos os casos, os dadores foram pré-tratados com 30.000 unidades de heparina e lavado in situ e na tabela da volta com uma solução de UW. Tempo de isquemia fria foi em média de 531 ± 237 (SD) min e o tempo de isquemia quente média foi de 27 ± 10 (SD) min, medido a partir de retirada da vidaapoio ao rubor frio. Observações e medições em tempo real pode ser utilizado para avaliar o fígado durante a perfusão, enquanto que as medições pós-hoc são reveladas após a perfusão. Observações em tempo real Fluxo através do fígado começa inferiores às taxas de fluxo alvo, como um resultado de uma resistência mais elevada no fígado frio. Utilizando uma pressão de 3 mm Hg sobre o PV e 30 mmHg sobre a HA os fluxos alvo podem geralmente ser obtidos uma vez que o fígado tenha sido aquecida até 21 &#160; ° C após 60 minutos de perfusão (Figura 1A). O fluxo biliar geralmente pode ser observado dentro de 10 min de perfusão e é produzido de forma constante durante a perfusão (Figura 1B). Bile quantidade depende da qualidade do fígado e varia de 0,3 ml / h / kg de fígado a 18 ml / min / kg. Em fígados com tempo de isquemia quente por mais tempo, o fluxo biliar tenderá a desaparecer, enquanto mais curtos quentes isquêmicos tempo resulta em um mais estável ou até mesmo aumentarprodução de bile. As medições do tempo real A medição direta e freqüente do perfusato por gasometria no essencial, tanto para fins experimentais, bem como a manutenção de condições de perfusão adequada, importante oxigenação e pH. A pressão parcial de oxigénio dissolvido deve ser superior a 700 mmHg, no fluxo, tanto da PV e HA. Pressão de oxigênio Vazão, medido na veia cava, geralmente diminui com o tempo de perfusão, refletindo um aumento de consumo de oxigênio. As taxas de captação de oxigénio pode ser calculada tal como descrito anteriormente e 13 variou 0,5-2,2 ml de O 2 / min / kg no início da perfusão de 2,4-9,7 ml de O 2 / min / kg em t = 3 horas (Figura 1C). A queda no pH é observado nos primeiros 30 min (Figura 1D), principalmente como um resultado da libertação de lactato no perfusado. Isto pode ser apoiado por suplementação com bicarbo de sódio a 8,4%nate e depois de cerca de 90 min o pH cai para trás na faixa normal. Comumente, 30-50 mL de bicarbonato de sódio a 8,4% é necessário. Aumento da concentração de lactato rapidamente na primeira 15-30 min, mas começa a falecimento após a primeira hora (Figura 1E). Medições Post-hoc Transaminases hepáticas, tais como ALT pode ser medido no perfusado. Nos primeiros 30 min de um grande aumento dos níveis de ALT é geralmente observado que reflecte a lavagem de ALT que foi lançado durante a isquemia (Figura 1F). ALT mostrou boa correlação com o tempo de isquemia quente 13. Máquina de perfusão aumentou o teor de ATP 2,8 vezes, refletindo um estado de energia de recuperação (Figura 1G). H &amp; E análise histológica revela nenhuma lesão adicional sofridos durante máquina de perfusão (Figura 1H, I). Deve notar-se que o regime de biópsia proposto no presente protocolo é a resfins earch e podem não ser aplicáveis ​​para fins clínicos. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52777/52777fig1.jpg" /> Figura 1:. Avaliação de fígados humanos durante a perfusão máquina de fluxo através da PV e HA durante SNMP (A), a produção de bílis, quantificado por hora de perfusão (B), a taxa de uprate oxigénio (OUR), calculado a partir da diferença de influxo (PV + HA) e saída (veia cava), interrompeu linhas mostram pressões parciais de oxigênio na entrada e saída durante a perfusão (C), pH e lactato durante a perfusão (D, E), liberação de ALT no perfusato (F), ATP teor medido em tecido de biópsias de hora em hora (G) e H &amp; E as manchas do fígado (54 anos de idade DCD, 19 min de isquemia quente, 559 min de isquemia fria) antes de (H) e depois (I) perfusão. Os resultados são apresentados como média ± SEM. <ahref = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/52777/52777fig1large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Functional Human Liver Preservation and Recovery by Means of Subnormothermic Machine Perfusion

Descreve-se um método de perfusão ex vivo máquina de enxertos de fígado humano à temperatura subnormothermic (21 ° C).

Fígado Preservação Human Funcional e cobrança através de Subnormothermic Máquina de Perfusão

There is currently a severe shortage of liver grafts available for transplantation.  Novel organ preservation techniques are needed to expand the pool of ...

functional-human-liver-preservation-recovery-means-subnormothermic

Research

JoVE Journal

Medicine

16.7K visualizações.  Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School.  Descreve-se um método de perfusão ex vivo máquina de enxertos de fígado humano à temperatura subnormothermic (21 ° C). 

Vídeo: Functional Human Liver Preservation and Recovery by Means of Subnormothermic Machine Perfusion

Technique of Subnormothermic Ex Vivo Liver Perfusion for the Storage, Assessment, and Repair of Marginal Liver Grafts

The success of liver transplantation has resulted in a dramatic organ shortage. In most transplant regions 20-30% of patients on the waiting list for liver transplantation die without receiving an organ transplant or are delisted for disease progression. One strategy to increase the donor pool is the utilization of marginal grafts, such as fatty livers, grafts from older donors, or donation after cardiac death (DCD). The current preservation technique of cold static storage is only poorly tolerated by marginal livers resulting in significant organ damage. In addition, cold static organ storage does not allow graft assessment or repair prior to transplantation.
These shortcomings of cold static preservation have triggered an interest in warm perfused organ preservation to reduce cold ischemic injury, assess liver grafts during preservation, and explore the opportunity to repair marginal livers prior to transplantation. The optimal pressure and flow conditions, perfusion temperature, composition of the perfusion solution and the need for an oxygen carrier has been controversial in the past.
In spite of promising results in several animal studies, the complexity and the costs have prevented a broader clinical application so far. Recently, with enhanced technology and a better understanding of liver physiology during ex vivo perfusion the outcome of warm liver perfusion has improved and consistently good results can be achieved.
This paper will provide information about liver retrieval, storage techniques, and isolated liver perfusion in pigs. We will illustrate a) the requirements to ensure sufficient oxygen supply to the organ, b) technical considerations about the perfusion machine and the perfusion solution, and c) biochemical aspects of isolated organs.

Technique of Subnormothermic Ex Vivo Liver Perfusion for the Storage, Assessment, and Repair of Marginal Liver Grafts

Marginal grafts, such as fatty livers, grafts from older donors, or livers retrieved after cardiac death (DCD) tolerate conventional, cold static storage only poorly. We developed a novel model of subnormothermic ex vivo liver perfusion for preservation, assessment, and repair of marginal liver grafts prior to transplantation.

Técnica de Subnormothermic<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Fígado de Perfusão para o armazenamento, Avaliação e Reparação de enxertos de fígado Marginal

The success of liver transplantation has resulted in a dramatic organ shortage. In most transplant regions 20-30% of patients on the waiting list for ...

Medicina

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

The mainstay of contemporary therapies for extensive occlusive arterial disease is venous bypass graft. However, its durability is threatened by intimal hyperplasia (IH) that eventually leads to vessel occlusion and graft failure. Mechanical forces, particularly low shear stress and high wall tension, are thought to initiate and to sustain these cellular and molecular changes, but their exact contribution remains to be unraveled. To selectively evaluate the role of pressure and shear stress on the biology of IH, an ex&#160;vivo perfusion system (EVPS) was created to perfuse segments of human saphenous veins under arterial regimen (high shear stress and high pressure). Further technical innovations allowed the simultaneous perfusion of two segments from the same vein, one reinforced with an external mesh. Veins were harvested using a no-touch technique and immediately transferred to the laboratory for assembly in the EVPS. One segment of the freshly isolated vein was not perfused (control, day 0). The two others segments were perfused for up to 7 days, one being completely sheltered with a 4 mm (diameter) external mesh. The pressure, flow velocity, and pulse rate were continuously monitored and adjusted to mimic the hemodynamic conditions prevailing in the femoral artery. Upon completion of the perfusion, veins were dismounted and used for histological and molecular analysis. Under ex&#160;vivo conditions, high pressure perfusion (arterial, mean = 100 mm Hg) is sufficient to generate IH and remodeling of human veins. These alterations are reduced in the presence of an external polyester mesh.

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

The mechanisms leading to the development of intimal hyperplasia (IH) and vein graft failure are still poorly understood. This study describes an ex&#160;vivo system to perfuse human veins under controlled flow and pressure. Furthermore the efficiency of external mesh reinforcement to limit the development of IH was evaluated.

Procedimento para safenas humanas Veias<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Perfusão e reforço externo

The mainstay of contemporary therapies for extensive occlusive arterial disease is venous bypass graft. However, its durability is threatened by intimal ...

Isolated Hepatic Perfusion as a Treatment for Liver Metastases of Uveal Melanoma

Isolated hepatic perfusion (IHP) is a procedure where the liver is surgically isolated and perfused with a high concentration of the chemotherapeutic agent melphalan. Briefly, the procedure starts with the setup of a percutaneous veno-venous bypass from the femoral vein to the external jugular vein. Via a laparotomy, catheters are then inserted into the proper hepatic artery and the caval vein. The portal vein and the caval vein, both supra- and infrahepatically, are then clamped. The arterial and venous catheters are connected to a heart lung machine and the liver is perfused with melphalan (1 mg/kg body weight) for 60 min. This way it is possible to locally perfuse the liver with a high dose of a chemotherapeutic agent, without leakage to the systemic circulation.
In previous studies including patients with isolated liver metastases of uveal melanoma, an overall response rate of 33-100% and a median survival between 9 and 13 months, have been reported. The aim of this protocol is to give a clear description of how to perform the procedure and to discuss IHP as a treatment option for liver metastases of uveal melanoma.

Here, we present a protocol how to perform an isolated liver perfusion (IHP) with melphalan and we also discuss IHP as a treatment option for liver metastases of uveal melanoma.

Isolado hepática Perfusão como um tratamento para o fígado Metástases de Uveal Melanoma

Isolated hepatic perfusion (IHP) is a procedure where the liver is surgically isolated and perfused with a high concentration of the chemotherapeutic ...

Ex Situ Normothermic Machine Perfusion of Donor Livers

In contrast to conventional static cold preservation (0-4 &#176;C), ex situ machine perfusion may provide better preservation of donor livers. Continuous perfusion of organs provides the opportunity to improve organ quality and allows ex situ viability assessment of donor livers prior to transplantation. This video article provides a step by step protocol for ex situ normothermic machine perfusion (37 &#176;C) of human donor livers using a device that provides a pressure and temperature controlled pulsatile perfusion of the hepatic artery and continuous perfusion of the portal vein. The perfusion fluid is oxygenated by two hollow fiber membrane oxygenators and the temperature can be regulated between 10 &#176;C and 37 &#176;C. During perfusion, the metabolic activity of the liver as well as the degree of injury can be assessed by biochemical analysis of samples taken from the perfusion fluid. Machine perfusion is a very promising tool to increase the number of livers that are suitable for transplantation.

Ex Situ Normothermic Machine Perfusion of Donor Livers

Here we present a protocol describing oxygenated ex situ machine perfusion of donor liver grafts. This article contains a step by step protocol to procure and prepare the liver graft for machine perfusion, prepare the perfusion fluid, prime the perfusion machine and perform oxygenated normothermic machine perfusion of the liver graft.

Ex Situ Normotérmica máquina de perfusão de fígados doados

In contrast to conventional static cold preservation (0-4 &#176;C), ex situ machine perfusion may provide better preservation of donor livers. Continuous ...

Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation

Kidney transplantation has become a well-established treatment option for patients with end-stage renal failure. The persisting organ shortage remains a serious problem. Therefore, the acceptance criteria for organ donors have been extended leading to the usage of marginal kidney grafts. These marginal organs tolerate cold storage poorly resulting in increased preservation injury and higher rates of delayed graft function. To overcome the limitations of cold storage, extensive research is focused on alternative normothermic preservation methods.
Ex vivo normothermic organ perfusion is an innovative preservation technique. The first experimental and clinical trials for ex vivo lung, liver, and kidney perfusions demonstrated favorable outcomes.
In addition to the reduction of cold ischemic injury, the method of normothermic kidney storage offers the opportunity for organ assessment and repair. This manuscript provides information about kidney retrieval, organ preservation techniques, and isolated ex vivo normothermic kidney perfusion (NEVKP) in a porcine model. Surgical techniques, set up for the perfusion solution and the circuit, potential assessment options, and representative results are demonstrated.

Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation

The severe organ shortage has resulted in increased use of marginal kidney grafts for transplantation. This has triggered interest in alternative storage methods, since marginal grafts especially tolerate cold storage poorly. The technique of normothermic ex vivo kidney perfusion (NEVKP) represents a novel preservation method for kidney grafts prior to &#160;transplantation.

Normotérmica<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Perfusão rim para a Preservação do rim Os enxertos antes do transplante

Kidney transplantation has become a well-established treatment option for patients with end-stage renal failure. The persisting organ shortage remains a ...

Generation of a Humanized Mouse Liver Using Human Hepatic Stem Cells

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in which the liver has been repopulated with functional human hepatocytes, could serve as a useful tool for investigating human hepatic cell biology, drug metabolism, and other preclinical applications. One of the key factors required for successful transplantation of human hepatocytes into mice is the elimination of the endogenous hepatocytes to prevent competition with the human cells and provide a suitable space and microenvironment for promoting human donor cell expansion and differentiation. To date, two major liver injury mouse models utilizing fumarylacetoacetate hydrolase (Fah) and uroplasminogen activator (uPA) mice have been established. However, Fah mice are used mainly with mature hepatocytes and the application of the uPA model is limited by decreased breeding. To overcome these limitations, Alb-toxin receptor mediated cell knockout (TRECK)/SCID mice were used for in vivo differentiation of immature human hepatocytes and humanized liver generation. Human hepatic stem cells (HpSCs) successfully repopulated the livers of Alb-TRECK/SCID mice that had developed lethal fulminant hepatic failure following diphtheria toxin (DT) treatment. This model of a humanized liver in Alb-TRECK/SCID mice will have functional applications in studies involving drug metabolism and drug-drug interactions and will promote other in vivo and in vitro studies.

Here, we present a novel humanized mouse liver model generated in Alb-toxin receptor mediated cell knockout (TRECK)/SCID mice following the transplantation of immature and expandable human hepatic stem cells.

Geração de um humanizado rato Liver Usando células-tronco hepáticas humanas

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in ...

Method of Direct Segmental Intra-hepatic Delivery Using a Rat Liver Hilar Clamp Model

Major hepatic surgery with inflow occlusion, and liver transplantation, necessitate a period of warm ischemia, and a period of reperfusion leading to ischemia/reperfusion (I/R) injury with myriad negative consequences. Potential I/R injury in marginal organs destined for liver transplantation contributes to the current donor shortage secondary to a decreased organ utilization rate. A significant need exists to explore hepatic I/R injury in order to mediate its impact on graft function in transplantation. Rat liver hilar clamp models are used to investigate the impact of different molecules on hepatic I/R injury. Depending on the model, these molecules have been delivered using inhalation, epidural infusion, intraperitoneal injection, intravenous administration or injection into the peripheral superior mesenteric vein. A rat liver hilar clamp model has been developed for use in studying the impact of pharmacologic molecules in ameliorating I/R injury. The described model for rat liver hilar clamp includes direct cannulation of the portal supply to the ischemic hepatic segment via a side branch of the portal vein, allowing for direct segmental hepatic delivery. Our approach is to induce ischemia in the left lateral and median lobes for 60 min, during which time the substance under study is infused. In this case, pegylated-superoxide dismutase (PEG-SOD), a free radical scavenger, is infused directly into the ischemic segment. This series of experiments demonstrates that infusion of PEG-SOD is protective against hepatic I/R injury. Advantages of this approach include direct injection of the molecule into the ischemic segment with consequent decrease in volume of distribution and reduction in systemic side effects.

A unique rat liver hilar clamp model was developed for studying the impact of pharmacologic molecules in ameliorating ischemia-reperfusion injury. This model includes direct cannulation of the portal supply to the ischemic liver segment via a branch of the portal vein, allowing for direct hepatic delivery.

Método de entrega directa segmentos intra-hepática Usando um modelo de rato Liver Hilar Grampo

Major hepatic surgery with inflow occlusion, and liver transplantation, necessitate a period of warm ischemia, and a period of reperfusion leading to ...

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, normothermic ex vivo liver perfusion (NEVLP) has been introduced as a method to evaluate and modify organ function. NEVLP has many advantages in comparison to hypothermic and subnormothermic perfusion including reduced preservation injury, restoration of normal organ function under physiologic conditions, assessment of organ performance, and as a platform for organ repair, remodeling, and modification. Both murine and porcine NEVLP models have been described. We demonstrate a rat model of NEVLP and use this model to show one of its important applications &#8212; the use of a therapeutic molecule added to liver perfusate. Catalase is an endogenous reactive oxygen species (ROS) scavenger and has been demonstrated to decrease ischemia-reperfusion in the eye, brain, and lung. Pegylation has been shown to target catalase to the endothelium. Here, we added pegylated-catalase (PEG-CAT) to the base perfusate and demonstrated its ability to mitigate liver preservation injury. An advantage of our rodent NEVLP model is that it is inexpensive in comparison to larger animal models. A limitation of this study is that it does not currently include post-perfusion liver transplantation. Therefore, prediction of the function of the organ post-transplantation cannot be made with certainty. However, the rat liver transplant model is well established and certainly could be used in conjunction with this model. In conclusion, we have demonstrated an inexpensive, simple, easily replicable NEVLP model using rats. Applications of this model can include testing novel perfusates and perfusate additives, testing software designed for organ evaluation, and experiments designed to repair organs.

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

There is a significant liver donor shortage, and criteria for liver donors have been expanded. Normothermic ex vivo liver perfusion (NEVLP) has been developed to evaluate and modify organ function. This study demonstrates a rat model of NEVLP and tests the ability of pegylated-catalase, to mitigate liver preservation injury.

Um pequeno modelo Animal de perfusão de fígado normotérmica Ex Vivo

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, ...

Functional Characterization of Endogenously Expressed Human RYR1 Variants

More than 700 variants in the RYR1 gene have been identified in patients with different neuromuscular disorders including malignant hyperthermia susceptibility, core myopathies and centronuclear myopathy. Because of the diverse phenotypes linked to RYR1 mutations it is fundamental to characterize their functional effects to classify variants carried by patients for future therapeutic interventions and identify non-pathogenic variants. Many laboratories have been interested in developing methods to functionally characterize RYR1 mutations expressed in patients&#39; cells. This approach has numerous advantages, including: mutations are endogenously expressed, RyR1 is not over-expressed, use of heterologous RyR1 expressing cells is avoided. However, since patients may present mutations in different genes aside RYR1, it is important to compare results from biological material from individuals harboring the same mutation, with different genetic backgrounds. The present manuscript describes methods developed to study the functional effects of endogenously expressed RYR1 variants in: (a) Epstein Barr virus immortalized human B-lymphocytes and (b) satellite cells derived from muscle biopsies and differentiated into myotubes. Changes in the intracellular calcium concentration triggered by the addition of a pharmacological RyR1 activators are then monitored. The selected cell type is loaded with a ratiometric fluorescent calcium indicator and intracellular [Ca2+] changes are monitored either at the single cell level by fluorescence microscopy or in cell populations using a spectrofluorometer. The resting [Ca2+], agonist dose response curves are then compared between cells from healthy controls and patients harboring RYR1 variants leading to insight into the functional effect of a given variant.

Here methods used to study the functional effect of RYR1 mutations endogenously expressed in Epstein Barr Virus immortalized human B-lymphocytes and muscle biopsy derived satellite cells differentiated into myotubes are described.

Caracterização funcional de variantes ryr1 humanas expressas e endógenas

More than 700 variants in the RYR1 gene have been identified in patients with different neuromuscular disorders including malignant hyperthermia ...

Dynamic Navigation in Endodontics: Guided Access Cavity Preparation by Means of a Miniaturized Navigation System

In the case of teeth with pulp canal calcification (PCC) and apical pathology or pulpitis, root canal treatment can be very challenging. PCC are common sequelae of dental trauma but can also occur with stimuli such as caries, bruxism, or after placing a restoration. In order to access the root canal as minimally invasive as possible in case of a necessary root canal treatment, dynamic navigation has recently been introduced in endodontics in addition to static navigation. The use of a dynamic navigation system (DNS) requires pre-operative cone-beam computed tomography (CBCT) imaging and a digital surface scan. If necessary, reference markers must be placed on the teeth before the CBCT scan; with some systems, these can also be planned and created digitally afterward. By means of a stereo camera connected to the planning software, the drill can now be coordinated with the help of reference markers and virtual planning. As a result, the position of the drill can be displayed on the monitor in real-time during preparation in different planes. In addition, the spatial displacement, the angular deviation, and the depth position are also displayed separately. The few commercially available DNS mostly consist of relatively large camera-marker-systems. Here, the DNS contains miniaturized components: a low-weight camera (97 g) mounted on the micromotor of the electric handpiece utilizing a manufacturer-specific connecting mechanism and a small marker (10 mm x 15 mm), which can be easily attached to an individually manufactured intraoral tray. For research purposes, a post-operative CBCT scan can be matched with the pre-operative one, and the volume of tooth structure removed can be calculated by the software. This work aims to present the technique of guided access cavity preparation by means of a miniaturized navigation system from imaging to clinical implementation.

Dynamic navigation systems (DNS) provide real-time visualization and guidance to the operator during endodontic access cavities preparation. The planning of the procedure requires three-dimensional imaging utilizing cone beam computed tomography and surface scans. After the export of the planning data to the DNS, access cavities can be prepared with minimal invasion.

Navegação Dinâmica em Endodontia: Preparação de Cavidade de Acesso Guiado por Meio de um Sistema de Navegação Miniaturizado

In the case of teeth with pulp canal calcification (PCC) and apical pathology or pulpitis, root canal treatment can be very challenging. PCC are common ...