この作品は、ヘルスリサーチとハートとBC＆ユーコンの脳卒中財団（JCC）のカナダの研究所からの助成金によってサポートされていました。

この研究におけるすべてのプロトコルを見直し、サイモンフレーザー大学の動物のケア倫理委員会によって承認されました。使用したBalb / cYJ（H2 d）はドナーマウス及びC57BL / 6（H2 b）はレシピエントマウスは、同種の反応を調べました。マウスは、8〜12週齢の間で実験に使用されています。女性または男性のいずれかのマウスを使用してください。同系のコントロールは、C57BL / 6レシピエントにC57BL / 6ドナーからの大動脈のセグメントで構成されています。 1.ドナーとレシピエントの準備注：ドナーとレシピエントの両方を麻酔し、移植片の虚血を最小にするために手術前に用意されています。注射用麻酔薬は、吸入麻酔薬の送達のために必要な機器によって、動物の閉塞を防止するためのプロトコルで使用されています。しかし、所望ならば、吸入麻酔薬は、適切な代替手段です。麻酔薬の最初の注射から、全体の手順が完了するのに約90分かかります。移植片の虚血性時間が少ない股関節ですnは30分。 <ol><li>ケタミンの腹腔内注射でマウス麻酔た（100mg / kgで、10 mg / mlで）およびキシラジン（10mg / kgの、1 mg / mlで）。マウスは、10〜15分以内に鎮静剤を投与されます。動物フットパッドの脂肪部分をつまんで麻酔の深さを評価します。必要に応じて、動物が引っ込め反射を示さなくなるまで、麻酔薬カクテルの元の量の1/3を管理します。すべてのカクテルを投与された後に密接に呼吸速度を監視します。手術中に、ピンセットで前腹壁をつまんで麻酔のレベルを15分ごとに評価します。マウスは、60〜90分間、深く麻酔をかけままにしてください。 </li><li>麻酔下ながら乾燥を防ぐために、眼軟膏とマウスの目に注油してください。 </li><li>恥骨に半ば胸部から腹部腹側領域上にできるだけ皮膚に近い髪を剃ります。任意の皮膚ではないニックに特に注意してください。それは私に吸収することができるので、脱毛クリームを使用しないでください皮膚NTOおよび炎症性である可能性があります。 </li><li>加熱テーブルまたはパッド上記のタオルの上に仰臥位で動物を置きます。 </li><li> 2％クロルヘキシジンを用いた予備スクラブで手術部位を清掃してください。手術野を最大化するために大規模な作業領域を準備します。手術部位の中心にスクラブ起動し、直鎖状または環状に外側に移動します。ガーゼを処分。この手順を少なくとも5回以上繰り返します。同じ領域にアルコール準備パッドを適用します。アルコールが乾燥した後、滅菌ガーゼでベタジン溶液とドレープで清潔な場所を準備します。 </li></ol> 2.エンドツーエンドの吻合手順<ol><li>ドナー操作<ol><li>操作を通して無菌技術を維持します。使用前に0.5％に加速過酸化水素溶液とのすべてのカウンターと手術台の表面を清掃してください。使用前にすべての手術器具、ガーゼ、ドレープやガウンを包み、オートクレーブ。スチームで楽器の無菌性を確認各パックに入れ滅菌インジケータストリップ。無菌手術用手袋を使用し、手術の間の配置されています。複数の手術のために、高温のガラスビーズ滅菌器での使用の間に手術器具を滅菌します。 </li><li> 8-30Xの倍率で手術用顕微鏡下で滅菌ドレープで包み、きれいな薄いプレキシガラスボード上の仰臥位でドナーマウスを置きます。 </li><li>セクション1.1に概説されるように、適切な外科的麻酔を確認した後、手術を続行します。 </li><li>滅菌はさみを使用して、恥骨から剣状突起に、単一正中線下縦腹部切開を行います。 </li><li>小さなリトラクタを使用して、空洞を露出するために腹壁を開きます。 </li><li>滅菌綿を使用すると、静かに、動物の左に上方腸を撤回し、生理食塩水で湿らせたガーゼでカバーし、アプリケーターをひっくり返しました。下方生殖器官を移動し、腎臓下の大動脈と下大静脈（IVC）を見つけます。 Moisの定期的に生理食塩水で10露出した組織。 </li><li>医療号5鉗子を使用して、分岐部に左腎動脈のレベルから、IVCから大動脈を分離します。大動脈近くの小さな枝を結紮する10-0ポリアミドモノフィラメント縫合糸を使用してください。 </li><li>ドナーの大動脈は、IVCから分離された後、湿らせたガーゼで露出キャビティを覆い、無菌領域に別にドナーセット、生理食塩水で容器を飽和させます。ドナー（呼吸と心臓血管機能、および麻酔深度）15分毎の状態を確認してください。 （ステップ2.2.7へ2.2.1）以下に説明するように、大動脈を単離し、レシピエントで動作を開始します。 </li><li>受信者の大動脈は、IVCから分離し、別に設定された後、顕微鏡下でドナーを返します。 2つの4ミリの微小血管クランプで約5mmのクロスクランプ（興味のあるセグメントの近位および遠位）ドナー大動脈、。 </li><li> Vannas-テュービンゲンmicroscissorsを使用して、腹部大動脈の小さなグラフトセグメント（長さ3〜4ミリメートル）を横断します。 </li><li>注射器に取り付けられた25 G 5/8針を用いて、ヘパリン化（100 U / ml）で切除された大動脈をフラッシュ食塩水。針の先端が血管に接触しないことを確認してください。 </li><li>氷上ヘパリン化に入れ大動脈（100 U / ml）を生理食塩水、脇に置きます。まだ深い麻酔下で、微小血管クランプを解除している間。瀉血によってドナーを安楽死させます。 </li><li>切除の30分以内にドナー血管を移植します。それは大動脈の大きい長さを切り出すことにより、複数の受信者のための1つのドナー容器を使用することも可能ですが、30分未満に虚血時間を保ちます。 </li></ol></li><li>受信者の操作<ol><li>ドナー動作と同様に、操作全体で無菌技術を維持します。 </li><li> 8-30Xの倍率で手術用顕微鏡下で滅菌ドレープで包まれ薄いプレキシグラスボード上の仰臥位でレシピエントマウスを置きます。 </li><li> AF動物が引っ込め反射を示さないときに、十分な麻酔を確保terを、手術を進めます。 </li><li>滅菌はさみを使用して、恥骨から剣状突起に、単一正中線下縦腹部切開を行います。 </li><li>小さなリトラクタを使用して、空洞を露出するために腹壁を開きます。 </li><li>滅菌綿を使用すると、静かに、動物の左に上方腸を撤回し、生理食塩水で湿らせたガーゼでカバーし、アプリケーターをひっくり返しました。下方生殖器官を移動し、腎臓下の大動脈とIVCを探します。食塩水で定期的に露出した組織を湿ら。 </li><li>分岐部に左腎動脈のレベルから、IVCから大動脈を分離します。必要に応じて、大動脈近くの小さな枝を結紮する10-0ポリアミドモノフィラメント縫合糸を使用しています。 </li><li> 2つの4ミリの微小血管クランプで約5mmのクロスクランプ（興味のあるセグメントの近位および遠位）大動脈、。 </li><li> Vannas-テュービンゲンmicroscissorsを使用して、単一の水平大動脈切開を行い、ドナー大動脈移植片を収容するために腹部大動脈の小セグメント（0.5mm以下）を切除します。 </li><li>ヘパリン化（100 U / ml）を生理食塩水で摘出した大動脈をフラッシュします。ドナー大動脈移植片は、受信者の横切大動脈端部を接続するために適切な長さのものであるべきです。 </li><li>同所の位置にドナー大動脈移植片を配置し、受信者のそれとのそれぞれの移植片の解剖学的向きに一致する、受信者の最後に、ドナーの移植片の端を吻合。 </li><li>静かに容器の外膜をつかみ、少し医学5番の鉗子を使用してそれを裏返します。ピンセットを使用して、受信者の切除容器にドナー大動脈グラフトを確保するために、血管壁の全厚を通して10-0ポリアミドモノフィラメント縫合糸に取り付けられた針を駆動します。容器の開口部がオフによるT閉じられていないことを確認するために注意してください容器の後壁のO不注意ステッチ。 </li><li>連続ステッチのために、移植片の上端と下端の両方で9時位置にステー縫合糸を配置します。 3時からの移植片の上端から開始し、2ランニング縫合糸で切除端を吻合し、ステー縫合糸に縫合糸を固定します。 <ol><li>以上の移植片を裏返して、容器の一部を背ために実行している縫合糸を続け、原点ステー縫合糸を満たします。容器に多くの圧力を適用せずに固定します。下の吻合のための縫合を繰り返します。 注：結節縫合容器に、ステー縫合糸の間に3つの分離されたステッチと吻合していることを除いて連続縫合と同じように起動します。吻合時間は通常20分です。 </li></ol></li><li>吻合が完了すると、逆行性血が流れ、吻合部位の漏れをチェックできるようにするために、遠位微小血管クランプを解放します。漏れがある場合、immediatelyは欠陥部位を閉じるためにステッチを配置します。部位で出血がない場合は、近位クランプを解放。 </li><li>移植を調べて、移植片には、血液障害、および受信者の血管の近位および遠位部分がないことを確認してください。ドナーのと受信者の両方の容器内の積極的なパルスパターンは、血液が自由に流れていることが主な指標です。ピンセットを使用して、穏やかにステー縫合糸の一端を把持し、少し容器の後壁を検査するための容器を裏返します。 注：吻合部位の両端に血管壁のないパッカリングがあってはなりません。クランプの除去後の貧しい血流が血栓症の兆候です。 </li><li>綿先端のアプリケーターを用いて、腹腔内に腸を返します。 </li><li> Castroviejo針ホルダとグレーフェの鉗子で、連続縫いを使用して5-0ポリプロピレン縫合糸で腹壁を閉じます。同じでスキン層を閉じます皮内クロージャを使用して、縫合糸。 </li><li>移植が完了するとすぐにTorbugesic（1ミリグラム/ kg）の筋肉を管理します。 </li><li>ためには、すぐに与え、アチパメゾール（1mgの/ kg）を、ケトプロフェン（5mg / kg）および乳酸リンゲル液を皮下に温めました。 </li><li>手術直後に、水ブランケット一晩（12時間）下で加熱し、ケージにマウスを置きます。麻酔回復期間中は、清潔で乾燥した障害物のない領域に一人で動物を配置します。清潔なペーパータオルでラインケージ（オートクレーブ処理）と約20℃から22℃まで水ブランケットの温度を調整します。ケージの床の乾燥および湿潤キブルを自由に提供します。 注：手術後のケアの重要な要素は、麻酔や手術からの回復時に、必要に応じて、動物と適切な介入の観察です。監視の必要な強度は動物によって異なり、COなどの即時麻酔回復期間中に高くなることがあります後で術後の回復にmpared。 </li><li>継続的に、彼らは完全に回復するまでモニター施さ麻酔を持つ動物を監視します。動物は、補助なし胸骨横臥位を維持できるようにする必要があり、それが放置される前に、それは穏やかで、痛みのない表示される必要があります。 </li><li>両方の皮下に、3日間の期間、ブプレノルフィン（0.1 mgの/ kgのBID）とケトプロフェン（5ミリグラム/ kgのSID）を得ました。 </li><li> 3日間の最低麻酔からの回復中に心血管および呼吸機能、体温、および術後の痛みや不快感を監視します。その他の手入れは、脱水や電解質の損失を最小限に抑えるために、このような鎮痛剤および他の薬剤の投与、および非経口流体として、必要になることがあります。 </li><li>後肢の運動機能を観察することにより、移植手術の成功を評価します。移植の完全な成功は、アニメーションの回復時に即時でなければならない後肢と尾に遮るもののない血流を伴いますら、2日目に後肢のない麻痺との完全な回復</li></ol></li></ol> 3.組織収集注：予め定めエンドポイントは、所望の分析の種類および抗原ミスマッチの性質に応じて3-60日の範囲です。一般的には、内膜肥厚は、完全なMHCミスマッチのマウス系統全体の移植後30日目に堅牢です。 <ol><li>ケタミンの腹腔内注射でマウス麻酔た（100mg / kgで、10 mg / mlで）およびキシラジン（10mg / kgの、1 mg / mlで）。動物フットパッドの脂肪部分をつまんで麻酔の深さを評価します。動物が引っ込め反射を示さないときに手術を続行します。 </li><li>水で手術部位を清掃し、70％アルコールで終わります。 </li><li>吸収パッドを敷いたトレイの上に仰臥位で動物を置きます。 </li><li>大きな正中縦切開して腹腔を開きます。空洞を露出させる自己保持リトラクターを配置し、IVC AN腹部大動脈をdは。 </li><li>静か医療号5ピンセットを使用して、隣接IVCから移植ドナー大動脈セグメントを分離します。移植血管の外膜を除去しないように特に注意してください。 </li><li>胸椎の両側に沿ってリブを介して胸郭入口にすべての方法を切断して胸腔を公開します。心膜を露出させ、止血鉗子のペアで胸郭を確保するために上方に前胸壁を反映しています。 </li><li>心臓が露出されると、左心室に（注射器に取り付けられている）25 G 5/8針を挿入し、ヘパリン化（100 U / ml）を0.1mlの生理食塩水でフラッシュ。 </li><li>ハサミを使用して、血液、ヘパリン化生理食塩水、および固定液は、灌流中に身体を残すことができるように、右心房を削除します。 4％パラホルムアルデヒド5mlで又は流体ラン透明になるまで動物を灌流。安楽死を確実にするために心を削除します。 </li><li>物品血管セグメントを移植し、4％パラに浸します1時間を超えないため、ホルムアルデヒド。 10月（最適切断温度）行列とフラッシュ凍結に移植血管を設定します。セクション8ええと厚に設定クライオスタット下容器。ヘマトキシリン​​＆エオシンおよび/またはVerhoeff-ファン·ギーソン（ファン·ギーソン）弾性染色で染色切片。 </li></ol>移植片の4形態素解析注：TAは、内膜肥厚13によって特徴付けられます。このモデルでは、内膜肥厚及び内腔の大きさの減少は、結果として得られる免疫媒介血管損傷の重症度を反映しています。同種移植片コントロールは同種免疫応答の非存在下での血管のベースライン特性を決定するために使用されます。これらの制御はまた、外科的処置の結果として生じる、動脈損傷の評価を可能にします。 syngraftsには内膜肥厚があってはなりません。 <ol><li>内膜肥厚と管腔閉塞を調べるために、内皮細胞内の面積を測定層、弾性ファン·ギーソンに内部弾性板（IEL）及び外弾性板（EEL）は、画像解析ソフトを用いて動脈セグメントを染色しました。以下のパラメータは、TAの反射動脈の変化を決定することができます。 <ol><li> - 内皮細胞層内の領域内弾性板内の面積：絶対内膜面積を測定します。これは、TAの特徴である内膜の膨張の絶対測定を提供します。 </li><li>内弾性板内の領域 - 外弾性板内の面積：絶対内側の領域を測定します。これは、時折血管壁のこの領域への免疫媒介性変化の結果として発生する可能性があります内側の低下や成長の絶対測定を提供します。 </li><li>外弾性板内の領域として全血管面積を測定します。これは、免疫学的損傷の結果として動脈の膨張や収縮を伴う血管リモデリングの測定を提供します。 </li><li>メジャー（内弾性板内の領域 - 内皮細胞層内の領域）/（外弾性板内の領域 - 内部弾性板内の領域）：内膜/メディア。これは、内膜増殖の相対的な尺度を提供し、容器の大きさの差を正規化します。 </li><li> ％腔ナローイングを測定します：[（内弾性板内の領域 - 内皮細胞層内の領域）内弾性板と/面積）] * 100。これは、血管壁の内膜の拡大と改造（内側または外側）の組み合わせから生じる管腔閉塞の程度の尺度を提供します。 </li></ol></li></ol>

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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dramatic+remodeling+of+advanced+atherosclerotic+plaques+of+the+apolipoprotein+E-deficient+mouse+in+a+novel+transplantation+model.">Dramatic remodeling of advanced atherosclerotic plaques of the apolipoprotein E-deficient mouse in a novel transplantation model.</a> Journal of vascular surgery. 34, 541-547 (2001).</li><li>Potteaux, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppressed+monocyte+recruitment+drives+macrophage+removal+from+atherosclerotic+plaques+of+Apoe-/-+mice+during+disease+regression.">Suppressed monocyte recruitment drives macrophage removal from atherosclerotic plaques of Apoe-/- mice during disease regression.</a> J Clin Invest. 121, 2025-2036 (2011).</li></ol>

我々は、免疫介在性血管拒絶反応やTAを研究するために有用であるマウスにおける大動脈介在移植するためのプロトコルを記述しています。このモデルは、TAの原因だけでなく、新規治療戦略の開発を研究するために使用することができます。これは、適応免疫、細胞傷害性T細胞応答、サイトカイン媒介性CD4 T細胞エフェクター応答、およびTA 14,17-21における抗体媒介性移植片損傷の?...

過去30年以上にわたり、免疫抑制剤の進歩は、急性拒絶反応に移植片拒絶反応を減少しているが、慢性拒絶反応は、主な課題のままです。慢性心臓移植拒絶反応の主な症状は、移植動脈硬化（TA）1,2です。この状態は、同種移植片の動脈の内膜過形成および血管運動機能障害を特徴とし、レシピエントの免疫系による内皮および平滑筋細胞の免疫学的標的化の結果として発生されます。ホスト容器3を温存しつつ、外来ペプチド主要組織適合遺伝子複合体（MHC）の認識にグラフト血管系の特定の標的化は、排他的に移植動脈におけるTAの開発によって強調表示されます。これを踏まえて、レシピエントがドナー場合や、受信者は、T細胞とB細胞4を欠くと遺伝的に同一である場合にTAが実験的に発生しない観察です。免疫媒介血管損傷とdysfunctionがTA 5に、内膜肥厚や線維症の発症、ならびに脂質およびECMタンパク質の異常な蓄積を引き起こします。内膜肥厚は、全動脈樹の4-6を通して同心になる傾向があります。移植片喪失と死は通常、同種移植片の動脈4の管腔閉塞に起因する進行性虚血の結果として発生します。 1991年には、Mennander ら 7は、TAをモデル化するために、ラットにおいて大動脈介在モデルを開拓してきました。いくつかのグループが、その後、マウスで使用するために、この手順を適応しています。このモデルでは、同種移植片の大動脈セグメントは、臨床移植において観察されたTAと同等の機能を持っている病変を発症します。これは、平滑筋様細胞とレシピエントの白血球7の蓄積を特徴と内膜肥厚が含まれています。過去20年にわたり、このモデルは、血管損傷、拒絶反応及びTAのメカニズムに重要な洞察を生成するために使用されてきました。それは私たちすることができますEDは動脈病態中の免疫および血管応答に関連した質問を調べました。抗原のミスマッチの影響の選択適切にこれらの質問に対処する能力。 完全なMHCバリヤーを横切る移植は、臓器移植拒絶反応に関与することが知られている免疫応答の総合的な評価を可能にします。これは、移植片由来の細胞によって提示直接CD4とCD8 T細胞認識と外国ペプチドMHCの標的を含み、間接的CD4（および場合によってはCD8）T細胞認識および細胞を提示レシピエント抗原によって提示された移植片由来のアロ抗原の標的化、および抗体血管細胞表面8上の同種抗原の媒介認識。しかし、完全MHC不適合実験における損傷に対する血管反応は、臨床的に観察されるものとは異なる場合があります。ジョンソンら 9は示したが、その中で最も完全なMHCミスマッチ関門を移植大動脈介在移植片、内新生内膜細胞は、レシピエント由来ではなく、ドナー由来のものです。これは、ほとんどの内膜平滑筋細胞がドナー由来9,10であるヒト移植において観察されるものとは異なります。この制限を考慮するために、マイナー組織適合抗原不一致を横断グラフト伴う代替の実験モデルは、より密接に臨床移植11で観察されるものに似ている血管の応答を誘発するように開発されてきました。これらの代替モデルは重要な結論を可能にしながら、TA、完全に臨床設定で発生するものを再降伏しないマイナー組織適合抗原不一致の移植片における血管拒絶反応を引き起こす免疫学的プロセスの開発を推進血管応答について行われます。例えば、マイナー組織適合性抗原は、グラフト反応する抗体12によって不十分認識されています。上記の注意事項を考えると、それは病的クエスティを考慮することが重要です大動脈介在モデルで使用する抗原のミスマッチの種類を選択する際には、検査されています。ここでは、マウスの大動脈介在移植のための詳細なプロトコルを記述します。我々は完全MHC不適合マウスが、同じプロトコルが他の抗原不一致のマウス系統全体でグラフト化のために使用されている間の介在移植について説明します。

<table><tbody><tr><td>C57BL/6J (H-2b)</td><td>Jackson Laboratories, Bar Harbour ME</td><td>Strain# 000664</td><td></td></tr><tr><td>Balb/cBYJ</td><td>Jackson Laboratories, Bar Harbour ME</td><td>Strain# 001026</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine Hydrochloride Injection USP 100 mg/ml</td><td>Ketalean</td><td>DIN 00612316</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylazine Injection 20 mg/ml</td><td>Rompum</td><td>DIN 02169592</td><td></td></tr><tr><td>Ketoprofen Injection 100 mg/ml</td><td>Anafen</td><td>DIN 01938126</td><td></td></tr><tr><td>Butorphanol Tartrate&amp;nbsp;injection 10 mg/ml</td><td>Torbugesic</td><td>DIN 008450000</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphine Injection 0.3 mg/ml</td><td>Reckitt Benckiser</td><td>B.N. 5241</td><td></td></tr><tr><td>Atipamezole hydrochloride sterile injectable solution</td><td>Antisedan</td><td>DIN 02237744</td><td></td></tr><tr><td>Heparin Sodium Injection, USP, 1,000 units/ml</td><td>McKesson Distribution</td><td>DIN 02264315</td><td></td></tr><tr><td>Tears naturale ophthalmic ointment</td><td>Alcon</td><td>DIN 02082519</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Leica</td><td>M80</td><td></td></tr><tr><td>0.9% Sodium Chloride, sterile</td><td>Baxter Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lactated Ringer&amp;rsquo;s solution, sterile</td><td>Baxter Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.9% Sodium Chloride Injection, sterile, 10 ml</td><td>Baxter Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alcohol Prep Pads</td><td>Loris</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Povidone Iodine</td><td>Betadine</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorohexidine Gluconate 4% w/v</td><td>Germi-Stat</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Black Polyamide Monofilament</td><td>AROSurgical Instruments</td><td>T4A10Q07</td><td></td></tr><tr><td>Suture, 10-0 suture, 70 microns</td><td>Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blue monofilament suture 5-0, P3 needle</td><td>Ethicon</td><td>8698G</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Syringe</td><td>BD</td><td>REF 309659</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Syringe</td><td>BD</td><td>REF 309604</td><td></td></tr><tr><td>1cc TB insulin syringe with 28 G 1/2</td><td>BD</td><td>REF 309309</td><td></td></tr><tr><td>25 G 7/8, hypodermic needle</td><td>BD</td><td>REF 305124</td><td></td></tr><tr><td>27 G 1/2, hypodermic needle</td><td>BD</td><td>REF 305109</td><td></td></tr><tr><td>Colibri Retractor- 1.5 cm spread 4 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>17000-04</td><td></td></tr><tr><td>S&amp;amp;T CAF-4 Clip applying forceps, without lock</td><td>Fine Science Tools</td><td>00072-14</td><td></td></tr><tr><td>Supergrip forceps, S&amp;amp;T</td><td>Fine Science Tools</td><td>00632-11</td><td></td></tr><tr><td>Medical No.5 forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11253-20</td><td></td></tr><tr><td>Lexer Baby Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14078-10</td><td></td></tr><tr><td>Micro Adson forceps serrated</td><td>Fine Science Tools</td><td>11018-12</td><td></td></tr><tr><td>Vannas-Tubingen microscissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>Micro clamps, b-1; 3.5mm x 1mm; 7mm length</td><td>Fine Science Tools</td><td>00396-01</td><td></td></tr><tr><td>Graefe-forceps, 10cm 1x2 teeth</td><td>Fine Science Tools</td><td>11054-10</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo with lock and tungsten jaws</td><td>Fine Science Tools</td><td>12565-14</td><td></td></tr><tr><td>Hot glass bead sterilizer</td><td>Inotech 250</td><td>IS-250 - Steri-250</td><td></td></tr><tr><td>Non-woven gauzes</td><td>Progene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cotton Tipped Applicators</td><td>Puritan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beard Trimmer</td><td>Wahl</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heating pad</td><td>Sunbeam</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mouse model of alloimmune-induced vascular rejection and transplant arteriosclerosis

Vascular rejection that leads to transplant arteriosclerosis (TA) is the leading representation of chronic heart transplant failure. In TA, the immune system of the recipient causes damage of the arterial wall and dysfunction of endothelial cells and smooth muscle cells. This triggers a pathological repair response that is characterized by intimal thickening and luminal occlusion. Understanding the mechanisms by which the immune system causes vasculature rejection and TA may inform the development of novel ways to manage graft failure. Here, we describe a mouse aortic interposition model that can be used to study the pathogenic mechanisms of vascular rejection and TA. The model involves grafting of an aortic segment from a donor animal into an allogeneic recipient. Rejection of the artery segment involves alloimmune reactions and results in arterial changes that resemble vascular rejection. The basic technical approach we describe can be used with different mouse strains and targeted interventions to answer specific questions related to vascular rejection and TA.

このモデルでは、のBalb / cYJマウスの腹部大動脈を、C57BL / 6レシピエントの腎臓下の大動脈に介在されています。これは、同種移植片の動脈を対象と同種免疫応答の総合的な評価を可能にします。このモデルにおいて、免疫媒介血管損傷は内膜肥厚、管腔狭窄および免疫細胞の動員に終わる血管修復応答を開始（ 図1および2）。これらの基準は、その後、同種免疫応?...

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Mouse Model of Alloimmune-induced Vascular Rejection and Transplant Arteriosclerosis

We describe a protocol for aortic interposition grafting in mice. The goal of the protocol is to provide a model with which to study pathological processes and therapeutic strategies relevant to alloimmune reactions in arteries and the resultant arterial changes that contribute to organ transplant failure.

同種免疫により誘導される血管拒絶反応および移植動脈硬化症のマウスモデル

Vascular rejection that leads to transplant arteriosclerosis (TA) is the leading representation of chronic heart transplant failure. In TA, the immune ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

8.4K ビュー.  Simon Fraser University. We describe a protocol for aortic interposition grafting in mice. The goal of the protocol is to provide a model with which to study pathological processes and therapeutic strategies relevant to alloimmune reactions in arteries and the resultant arterial changes that contribute to organ transplant failure. 

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Orthotopic Aortic Transplantation: A Rat Model to Study the Development of Chronic Vasculopathy

Research models of chronic rejection are essential to investigate pathobiological and pathophysiological processes during the development of transplant vasculopathy (TVP).
The commonly used animal model for cardiovascular chronic rejection studies is the heterotopic heart transplant model performed in laboratory rodents. This model is used widely in experiments since Ono and Lindsey (3) published their technique. To analyze the findings in the blood vessels, the heart has to be sectioned and all vessels have to be measured.
Another method to investigate chronic rejection in cardiovascular questionings is the aortic transplant model (1, 2). In the orthotopic aortic transplant model, the aorta can easily be histologically evaluated (2). The PVG-to-ACI model is especially useful for CAV studies, since acute vascular rejection is not a major confounding factor and Cyclosporin A (CsA) treatment does not prevent the development of CAV, similar to what we find in the clinical setting (4). A7-day period of CsA is required in this model to prevent acute rejection and to achieve long-term survival with the development of TVP.
This model can also be used to investigate acute cellular rejection and media necrosis in xenogeneic models (5).

This video demonstrates the orthotopic aortic transplant model as a simple model to study the development of transplant vasculopathy (TVP) in rats.

同所性大動脈移植：慢性血管障害の発生研究のラットモデル

Research models of chronic rejection are essential to investigate pathobiological and pathophysiological processes during the development of transplant ...

医学

Orthotopic Aortic Transplantation in Mice for the Study of Vascular Disease

Vascular procedures involving anastomoses in the mouse are generally thought to be difficult and highly dependent on the skill of the individual surgeon. This is largely true, but there are a number of important principles that can reduce the difficulty of these procedures and enhance reproducibility. Orthotopic aortic transplantation is an excellent procedure in which to learn these principles because it involves only two end-to-end anastomoses, but requires good suturing technique and handling of the vessels for consistent success. This procedure begins with the procurement of a length of abdominal aorta from a donor animal, followed by division of the native aorta in the recipient. The procured aorta is then placed between the divided ends of the recipient aorta and sutured into place using end-to-end anastomoses. To accomplish this objective successfully requires a high degree of concentration, good tools, a steady hand, and an appreciation of how easily the vasculature of a mouse can be damaged, resulting in thrombosis. Learning these important principles is what occupies most of the beginner's time when learning microsurgery in small rodents. Throughout this protocol, we refer to these important points. This model can be used to study vascular disease in a variety of different experimental systems1-8. In the context shown here, it is most often used for the study of post-transplant vascular disease, a common long-term complication of solid organ transplantation in which intimal hyperplasia occurs within the allograft. The primary advantage of the model is that it facilitates quantitative morphometric analyses and the transplanted vessel lies contiguous to the endogenous vessel, which can serve as an additional control9. The technique shown here is most often used for mice weighing 18-25 grams. We have accumulated most of our experience using the C57BL/6J, BALB/cJ, and C3H/HeJ strains.

We describe a technique in which a section of the abdominal aorta from a mouse is transplanted orthotopically to just below the renal arteries in an allogeneic or syngeneic recipient. This technique can be useful in studies in which transplantation of large arteries of uniform size is deemed advantageous.

血管疾患の研究のためのマウスにおける同所性大動脈移植

Vascular procedures involving anastomoses in the mouse are generally thought to be difficult and highly dependent on the skill of the individual surgeon. ...

Mouse Models for Graft Arteriosclerosis

Graft arteriosclerois (GA), also called allograft vasculopathy, is a pathologic lesion that develops over months to years in transplanted organs characterized by diffuse, circumferential stenosis of the entire graft vascular tree. The most critical component of GA pathogenesis is the proliferation of smooth muscle-like cells within the intima. When a human coronary artery segment is interposed into the infra-renal aortae of immunodeficient mice, the intimas could be expand in response to adoptively transferred human T cells allogeneic to the artery donor or exogenous human IFN-&gamma; in the absence of human T cells. Interposition of a mouse aorta from one strain into another mouse strain recipient is limited as a model for chronic rejection in humans because the acute cell-mediated rejection response in this mouse model completely eliminates all donor-derived vascular cells from the graft within two-three weeks. We have recently developed two new mouse models to circumvent these problems. The first model involves interposition of a vessel segment from a male mouse into a female recipient of the same inbred strain (C57BL/6J). Graft rejection in this case is directed only against minor histocompatibility antigens encoded by the Y chromosome (present in the male but not the female) and the rejection response that ensues is sufficiently indolent to preserve donor-derived smooth muscle cells for several weeks. The second model involves interposing an artery segment from a wild type C57BL/6J mouse donor into a host mouse of the same strain and gender that lacks the receptor for IFN-&gamma; followed by administration of mouse IFN-&gamma; (delivered via infection of the mouse liver with an adenoviral vector. There is no rejection in this case as both donor and recipient mice are of the same strain and gender but donor smooth muscle cells proliferate in response to the cytokine while host-derived cells, lacking receptor for this cytokine, are unresponsive. By backcrossing additional genetic changes into the vessel donor, both models can be used to assess the effect of specific genes on GA progression. Here, we describe detailed protocols for our mouse GA models.

We describe protocols for our mouse graft arteriosclerois (GA) models which involve interposition of a mouse vessel segment into a recipient of the same inbred strain. By backcrossing additional genetic changes into the vessel donor, the model can assess the effect of specific genes on GA.

グラフト動脈硬化のマウスモデル

Graft arteriosclerois (GA),  also called allograft vasculopathy, is a pathologic lesion that develops over  months to years in transplanted organs ...

Mouse Kidney Transplantation: Models of Allograft Rejection

Rejection of the transplanted kidney in humans is still a major cause of morbidity and mortality. The mouse model of renal transplantation closely replicates both the technical and pathological processes that occur in human renal transplantation. Although mouse models of allogeneic rejection in organs other than the kidney exist, and are more technically feasible, there is evidence that different organs elicit disparate rejection modes and dynamics, for instance the time course of rejection in cardiac and renal allograft differs significantly in certain strain combinations. This model is an attractive tool for many reasons despite its technical challenges. As inbred mouse strain haplotypes are well characterized it is possible to choose donor and recipient combinations to model acute allograft rejection by transplanting across MHC class I and II loci. Conversely by transplanting between strains with similar haplotypes a chronic process can be elicited were the allograft kidney develops interstitial fibrosis and tubular atrophy. We have modified the surgical technique to reduce operating time and improve ease of surgery, however a learning curve still needs to be overcome in order to faithfully replicate the model. This study will provide key points in the surgical procedure and aid the process of establishing this technique.

Here, we present a protocol to study the immunology of rejection. The surgical model presented reports a short operating time and a concise technique. Depending on the donor-recipient strain combination, the transplanted kidney may develop acute cellular rejection or chronic allograft damage, defined by interstitial fibrosis and tubular atrophy.

マウス腎臓移植：同種移植片拒絶のモデル

Rejection of the transplanted kidney in humans is still a major cause of morbidity and mortality. The mouse model of renal transplantation closely ...

In Vitro and In Vivo Assessment of T, B and Myeloid Cells Suppressive Activity and Humoral Responses from Transplant Recipients

The main concern in transplantation is to achieve specific tolerance through induction of regulatory cells. The understanding of tolerance mechanisms requires reliable models. Here, we describe models of tolerance to cardiac allograft in rat, induced by blockade of costimulation signals or by upregulation of immunoregulatory molecules through gene transfer. Each of these models allowed in vivo generation of regulatory cells such as regulatory T cells (Tregs), regulatory B cells (Bregs) or regulatory myeloid cells (RegMCs). In this manuscript, we describe two complementary protocols that have been used to identify and define in vitro and in vivo regulatory cell activity to determine their responsibility in tolerance induction and maintenance. First, an in vitro suppressive assay allowed rapid identification of cells with suppressive capacity on effector immune responses in a dose dependent manner, and can be used for further analysis such as cytokine measurement or cytotoxicity. Second, the adoptive transfer of cells from a tolerant treated recipient to a newly irradiated grafted recipient, highlighted the tolerogenic properties of these cells in controlling graft directed immune responses and/or converting new regulatory cells (termed infectious tolerance). These methods are not restricted to cells with known phenotypic markers and can be extended to any cell population. Furthermore, donor directed allospecificity of regulatory cells (an important goal in the field) can be assessed by using third party donor cells or graft either in vitro or in vivo. Finally, to determine the specific tolerogenic capacity of these regulatory cells, we provide protocols to assess the humoral anti-donor antibody responses and the capacity of the recipient to develop humoral responses against new or former known antigens. The models of tolerance described can be used to further characterize regulatory cells, to identify new biomarkers, and immunoregulatory molecules, and are adaptable to other transplantation models or autoimmune diseases in rodent or human.

In Vitro and In Vivo Assessment of T, B and Myeloid Cells Suppressive Activity and Humoral Responses from Transplant Recipients

Here, we present a protocol to induce tolerance in transplantation, and assess in vitro and in vivo the suppressive capacity of distinct cell subsets from the recipient and the immune status of the recipient toward donor or exogenous antigens.

体外と体内の T, B, 骨髄細胞の抑制活性と移植から体液性応答の評価

The main concern in transplantation is to achieve specific tolerance through induction of regulatory cells. The understanding of tolerance mechanisms ...

免疫・感染学

A Novel Microsurgical Model for Heterotopic, En Bloc Chest Wall, Thymus, and Heart Transplantation in Mice

Exploration of novel strategies in organ transplantation to prolong allograft survival and minimizing the need for long-term maintenance immunosuppression must be pursued. Employing vascularized bone marrow transplantation and co-transplantation of the thymus have shown promise in this regard in various animal models.1-11 Vascularized bone marrow transplantation allows for the uninterrupted transfer of donor bone marrow cells within the preserved donor microenvironment, and the incorporation of thymus tissue with vascularized bone marrow transplantation has shown to increase T-cell chimerism ultimately playing a supportive role in the induction of immune regulation. The combination of solid organ and vascularized composite allotransplantation can uniquely combine these strategies in the form of a novel transplant model. Murine models serve as an excellent paradigm to explore the mechanisms of acute and chronic rejection, chimerism, and tolerance induction, thus providing the foundation to propagate superior allograft survival strategies for larger animal models and future clinical application. Herein, we developed a novel heterotopic en bloc chest wall, thymus, and heart transplant model in mice using a cervical non-suture cuff technique. The experience in syngeneic and allogeneic transplant settings is described for future broader immunological investigations via an instructional manuscript and video supplement.

To study combined solid organ and vascularized composite allotransplantation, we describe a novel heterotopic en bloc chest wall, thymus, and heart transplant model in mice using a cervical non-suture cuff technique.

マウスにおける異所のための新しい顕微モデル、エン圏胸壁、胸腺、および心臓移植

Exploration of novel strategies in organ transplantation to prolong allograft survival and minimizing the need for long-term maintenance immunosuppression ...

Orthotopic Hind Limb Transplantation in the Mouse

In vivo animal model systems, and in particular mouse models, have evolved into powerful and versatile scientific tools indispensable to basic and translational research in the field of transplantation medicine. A vast array of reagents is available exclusively in this setting, including mono- and polyclonal antibodies for both diagnostic and interventional applications. In addition, a vast number of genotyped, inbred, transgenic, and knock out strains allow detailed investigation of the individual contributions of humoral and cellular components to the complex interplay of an immune response and make the mouse the gold standard for immunological research. 
Vascularized Composite Allotransplantation (VCA) delineates a novel field of transplantation using allografts to replace "like with like" in patients suffering traumatic or congenital tissue loss. This surgical methodological protocol shows the use of a non-suture cuff technique for super-microvascular anastomosis in an orthotopic mouse hind limb transplantation model. The model specifically allows for comparison between established paradigms in solid organ transplantation with a novel form of transplants consisting of various different tissue components. Uniquely, this model allows for the transplantation of a viable vascularized bone marrow compartment and niche that have the potential to exert a beneficial effect on the balance of immune acceptance and rejection. This technique provides a tool to investigate alloantigen recognition and allograft rejection and acceptance, as well as enables the pursuit of functional nerve regeneration studies to further advance this novel field of transplantation.

This novel model for orthotopic hind limb transplantation in the mouse, applying a non-suture cuff technique for super-microvascular anastomosis, provides a powerful tool for in&#160;vivo mechanistic immunological research related to vascularized composite allotransplantation (VCA).

マウスで同所後肢移植

In vivo animal model systems, and in particular mouse models, have evolved into powerful and versatile scientific tools indispensable to basic and ...

Modified Heterotopic Hindlimb Osteomyocutaneous Flap Model in the Rat for Translational Vascularized Composite Allotransplantation Research

Vascularized composite allotransplantation (VCA) is a relatively new field in the reconstructive surgery. Clinical achievements in human VCA include hand and face transplants and, more recently, abdominal wall, uterus, and urogenital transplants. Functional outcomes have exceeded initial expectations, and most recipients enjoy an improved quality of life. However, as clinical experience accumulates, chronic rejection and complications from the immunosuppression must be addressed. In many cases where grafts have failed, the causative pathology has been ischemic vasculopathy. <span style="font-size: 11pt; line-height: 115%; font-family: Arial, sans-serif; color: rgb(41, 43, 49); background-image: initial; background-position: initial; background-size: initial; background-repeat: initial; background-attachment: initial; background-origin: initial; background-clip: initial;">The biological mechanisms of the acute and chronic rejection associated with VCA, especially ischemic vasculopathy, are important areas of research. However, due to the very small number of VCA patients, the evaluation of proposed mechanisms is better addressed in an experimental model. Multiple groups have used animal models to address some of the relevant unsolved questions in VCA rejection and vasculopathy. Several model designs involving a variety of species are described in the literature. Here we present a reproducible model of VCA heterotopic hindlimb osteomyocutaneous flap in the rat that can be utilized for translational VCA research. This model allows for the serial evaluation of the graft, including biopsies and different imaging modalities, while maintaining a low level of morbidity.

Vascularized composite allograft offers life-altering benefits to transplant recipients, but the biological causes of graft rejection and vasculopathy remain poorly understood. The rodent surgical model presented here offers a reproducible, clinically relevant model of transplantation, allowing researchers to evaluate rejection events and potential therapeutic strategies to prevent their occurrence.

トランスレーショナル血管化複合体他家移植研究のためのラットにおける修正 Heterotopic 後肢 Osteomyocutaneous フラップモデル

Vascularized composite allotransplantation (VCA) is a relatively new field in the reconstructive surgery. Clinical achievements in human VCA include hand ...

Murine Cervical Aortic Transplantation Model using a Modified Non-Suture Cuff Technique

With the introduction of powerful immunosuppressive protocols, distinct advances are possible in the prevention and therapy of acute rejection episodes. However, only minor improvement in the long-term results of transplanted solid organs could be observed over the past decades. In this context, chronic allograft vasculopathy (CAV) still represents the leading cause of late organ failure in cardiac, renal and pulmonary transplantation.
Thus far, the underlying pathogenesis of CAV development remains unclear, explaining why effective treatment strategies are presently missing and emphasizing a need for relevant experimental models in order to study the underlying pathophysiology leading to CAV formation. The following protocol describes a murine heterotopic cervical aortic transplantation model using a modified non-suture cuff technique. In this technique, a segment of the thoracic aorta is interpositioned in the right common carotid artery. With the use of the non-suture cuff technique, an easy to learn and reproducible model can be established, minimizing the possible heterogeneity of sutured vascular micro anastomoses.

Here, we present a protocol of heterotopic aortic transplantation in mice using the non-suture cuff technique in a cervical murine model. This model can be used to study the underlying pathology of chronic allograft vasculopathy (CAV) and can help evaluate new therapeutic agents in order to prevent its formation.

改変非縫合カフ技術を用いたマウス子宮頸動脈大動脈移植モデル

With the introduction of powerful immunosuppressive protocols, distinct advances are possible in the prevention and therapy of acute rejection episodes. ...

A Rat Orthotopic Renal Transplantation Model for Renal Allograft Rejection

Renal allograft rejection limits the long-term survival of patients after renal transplantation. Rat orthotopic renal transplantation is an essential model to investigate the mechanism of renal allograft rejection in pre-clinical studies and could aid in the development of novel approaches to improve the long-term survival of renal allografts. Donor kidney implantation in rat orthotopic renal transplantation is commonly performed by end-to-side anastomosis to recipients' aorta and inferior vena cava. In this model, the donor's kidney was implanted using end-to-end anastomosis to the recipients' renal artery and renal vein. The donor's ureter was anastomosed to the recipient's bladder in an end-to-side 'tunnel' method. This model contributes to better healing of ureter-bladder anastomosis and increases the recipients' survival by avoiding interference with blood supply and venous reflux of the lower body. This model can be used to investigate the mechanisms of acute and chronic immune and pathologic rejection of renal allografts. Here, the study describes the detailed protocols of this orthotopic renal transplantation between rats.

The rat orthotopic renal transplantation model contributes to investigating the mechanism of renal allograft rejection. The current model increases the recipients' survival without interference with blood supply and venous reflux of the lower body using an end-to-end anastomosis of kidney implantation and an end-to-side "tunnel" method of ureter-bladder anastomosis.

腎同種移植片拒絶反応のためのラット同所性腎移植モデル

Renal allograft rejection limits the long-term survival of patients after renal transplantation. Rat orthotopic renal transplantation is an essential ...