Name: mouse model of alloimmune-induced vascular rejection and transplant arteriosclerosis
Uploaded: 2015-05-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
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Este trabajo fue apoyado por becas de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud y Heart and Stroke Foundation de BC &amp; Yukon (JCC).

Todos los protocolos en este estudio fueron revisados ​​y aprobados por el comité de ética del cuidado de animales de la Universidad Simon Fraser. Uso Balb / CYJ (H2 d) los ratones donantes y / 6 ratones (H2 b) receptores C57Bl para examinar las reacciones alogénicos. Los ratones se utilizan para los experimentos entre las edades de 8 a 12 semanas. Utilice los ratones, ya sea hombre o mujer. Controles singénicos consisten en segmentos aórticos de ratones C57BL / 6 donantes en ratones C57BL / 6 destinatarios. 1. donante y el receptor Preparación Nota: Tanto el donante y el receptor son anestesiados y preparados antes de la cirugía para minimizar la isquemia del injerto. Anestésicos inyectables se utilizan en el protocolo para evitar la obstrucción del animal por el equipo necesario para la entrega de los anestésicos inhalados. Sin embargo, si se desea, anestésico inhalado es una alternativa apropiada. A partir de la inyección inicial de los anestésicos, todo el procedimiento dura aproximadamente 90 min para completar. Tiempo de isquemia del injerto es menos than 30 min. <ol><li> Anestesiar al ratón con inyecciones intraperitoneales de ketamina (100 mg / kg; 10 mg / ml) y xilazina (10 mg / kg; 1 mg / ml). El ratón será sedado dentro de 10 a 15 min. Evaluar la profundidad de la anestesia pellizcando la parte grasa de la almohadilla de la pata animal. Administrar un tercio de la dosis original del cóctel anestésico, según sea necesario, hasta que el animal no presenta reflejo de retirada. Monitorear la frecuencia respiratoria de cerca después se administra cada cóctel. Durante la cirugía, evaluar el nivel de anestesia cada 15 min pellizcando la pared abdominal anterior con un par de fórceps. Los ratones debe permanecer profundamente anestesiado durante 60 a 90 min. </li><li> Lubrique los ojos del ratón con una pomada oftálmica para evitar la sequedad mientras que bajo anestesia. </li><li> Afeitarse el pelo tan cerca de la piel como sea posible en la región ventral del abdomen de la mitad del tórax hasta el pubis. Tenga especial cuidado de no nick cualquier piel. No utilice crema depilatoria, ya que puede ser absorbida inPara la piel y puede ser inflamatoria. </li><li> Colocar el animal en posición supina sobre una toalla encima de la mesa de la calefacción o almohadilla. </li><li> Limpie el sitio de la cirugía con un exfoliante preliminar con 2% de clorhexidina. Prepare un área de trabajo grande para maximizar el campo quirúrgico. Iniciar fregar en el centro de la zona quirúrgica y mover hacia el exterior de una manera lineal o circular. Deseche la gasa. Repita este procedimiento al menos 5 veces más. Aplique una almohadilla con alcohol a la misma área. Una vez que el alcohol es seco, preparar el área limpia con una solución de Betadine y la caída con una gasa estéril. </li></ol> 2. Procedimiento de extremo a extremo anastomosis <ol><li> Donantes de Operación <ol><li> Mantener una técnica aséptica durante toda la operación. Limpie todas las superficies de la encimera y mesa quirúrgica con solución de peróxido de hidrógeno acelerado 0,5% antes de su uso. Envuelva y autoclave todos los instrumentos quirúrgicos, gasas, cortinas y vestidos antes de su uso. Verifique la esterilidad de los instrumentos con un vaportira indicadora esterilizador colocado en cada paquete. Guantes quirúrgicos estériles se utilizan y eliminarse entre cirugías. Para múltiples cirugías, esterilizar los instrumentos quirúrgicos entre los usos con el esterilizador de cuentas de vidrio caliente. </li><li> Coloque el ratón donante en una posición supina sobre una tabla limpia, delgada Plexiglas envuelto con paño estéril bajo el microscopio de operación con una ampliación de 8-30X. </li><li> Después de asegurarse de anestesia quirúrgica adecuadas tal como se indica en la sección 1.1, proceder con la cirugía. </li><li> Con unas tijeras estériles, hacer una sola línea media inferior incisión abdominal longitudinal, desde el pubis hasta el proceso xifoides. </li><li> Usando un pequeño retractor, abra las paredes abdominales para exponer la cavidad. </li><li> El uso de algodón estéril con punta aplicadores, retraer con suavidad los intestinos superiormente al animal de izquierda y cubrir con una gasa humedecida con solución salina. Mueva los órganos reproductivos inferior y localizar la aorta infrarrenal y la vena cava inferior (VCI). Moisdiez los tejidos expuestos periódicamente con solución salina. </li><li> Usando los fórceps No. médica 5, separar la aorta de la IVC, desde el nivel de la arteria renal izquierda a la bifurcación. Utilice 10-0 suturas de monofilamento de poliamida para ligar las ramas pequeñas cerca de la aorta. </li><li> Una vez aorta del donante se ha separado de la IVC, saturar el recipiente con solución salina, cubrir la cavidad expuesta con una gasa humedecida y establecer el donante a un lado en un área estéril. Compruebe el estado del donante (respiratoria y la función cardiovascular, y la profundidad de la anestesia) cada 15 minutos. Comenzará a operar en el destinatario, aislar la aorta, como se describe a continuación (Pasos 2.2.1 a 2.2.7). </li><li> Una vez que la aorta destinatario se ha separado de la VCI y dejar de lado, devuelva el donante en el microscopio. Cross abrazadera (proximal y distal al segmento de interés) de la aorta de donantes, aproximadamente 5 mm aparte, con dos pinzas microvasculares 4 mm. </li><li> Utilizando los microtijeras Vannas-Tübingen,seccionar un segmento de injerto pequeña (3 a 4 mm de longitud) de la aorta abdominal. </li><li> El uso de un 25 G 5/8 aguja unida a una jeringa, lave la aorta extirpada con heparinizada (100 U / ml) solución salina. Asegúrese de que la punta de la aguja no entra en contacto con el buque. </li><li> Coloque aorta en heparinizada (100 U / ml) de solución salina en el hielo y dejar de lado. Si bien todavía bajo anestesia profunda, suelta las pinzas microvasculares. La eutanasia del donante por desangramiento. </li><li> Implante el buque cedente dentro de los 30 min de la escisión. Aunque es posible usar un recipiente de donante para varios destinatarios mediante la escisión de una longitud mayor de aorta, mantener el tiempo de isquemia a menos de 30 min. </li></ol></li><li> Operación Receptor <ol><li> Mantener una técnica aséptica durante toda la operación, como en la operación de los donantes. </li><li> Coloque el ratón receptor en una posición supina sobre una tabla delgada Plexiglas envuelto con paño estéril bajo el microscopio de operación con una ampliación de 8-30X. </li><li> After asegurar una anestesia adecuada, proceder con la cirugía cuando el animal no presenta reflejo de retirada. </li><li> Con unas tijeras estériles, hacer una sola línea media inferior incisión abdominal longitudinal, desde el pubis hasta el proceso xifoides. </li><li> Usando un pequeño retractor, abra las paredes abdominales para exponer la cavidad. </li><li> El uso de algodón estéril con punta aplicadores, retraer con suavidad los intestinos superiormente al animal de izquierda y cubrir con una gasa humedecida con solución salina. Mueva los órganos reproductivos inferior y localizar la aorta infrarrenal y la vena cava inferior. Humedezca los tejidos expuestos periódicamente con una solución salina. </li><li> Separar la aorta de la IVC, desde el nivel de la arteria renal izquierda a la bifurcación. Si es necesario, utilice 10-0 suturas de monofilamento de poliamida para ligar las ramas pequeñas cerca de la aorta. </li><li> Cross abrazadera (proximal y distal al segmento de interés) de la aorta, de aproximadamente 5 mm aparte, con dos pinzas microvasculares 4 mm. </li><li> Usando las microtijeras Vannas-Tübingen, hacer una sola aortotomía horizontal y resecar un segmento pequeño (no más de 0,5 mm) de la aorta abdominal para acomodar el injerto aórtico donante. </li><li> Enjuague la aorta extirpada con heparinizada (100 U / ml) solución salina. El injerto aórtico donante debe tener una longitud adecuada para conectar los extremos seccionados aorta del receptor. </li><li> Coloque el injerto aórtico donante en la posición ortotópica y anastomosis extremo del injerto del donante al final del destinatario, igualando el respectivo injerto orientación anatómica con la del receptor. </li><li> Agarrar suavemente la túnica externa del buque y eversión ligeramente utilizando los fórceps No.5 médicos. Usando los fórceps, conducir la aguja unida a la sutura con monofilamento de poliamida 10-0 a través de todo el espesor de la pared del vaso con el fin de asegurar el injerto aórtico donante al recipiente de resecado del destinatario. Tenga cuidado para asegurarse de que la abertura del vaso no está cerrada debido to costura inadvertida de la pared posterior de la embarcación. </li><li> En las puntadas continuas, coloque suturas estancia en nueve tanto en los extremos superior e inferior del injerto. Comenzando en el extremo superior del injerto de tres, se anastomosan los extremos resecados con 2 suturas de funcionamiento y asegurar la sutura a la sutura estancia. <ol><li> Da la vuelta al injerto una y continuar con la sutura continua de dorsal parte de la embarcación, el cumplimiento de la sutura estancia origen. Asegure sin aplicar mucha presión en el recipiente. Repetir la sutura de la anastomosis baja. Nota: Las suturas interrumpidas comienzan la misma manera que la sutura continua con la excepción de que el recipiente se anastomosa con tres puntos de sutura separadas entre las suturas. Anastomosis tiempo es generalmente de 20 min. </li></ol></li><li> Una vez que la anastomosis se completa, suelte la pinza microvascular distal para permitir que la sangre fluya retrógrada y compruebe si hay fugas de los sitios anastomosados. Si hay una fuga, immediately coloque una puntada para cerrar el sitio defectuoso. Si no hay sangrado en los sitios, a continuación, suelte la pinza proximal. </li><li> Examine el trasplante y compruebe que no hay obstrucción arterial en el injerto, y los extremos proximal y porción distal del vaso del destinatario. Modelo de pulso vigoroso en el recipiente, tanto el destinatario de los donantes y de una indicación primaria que la sangre fluya libremente. Usando el par de pinzas, agarre suavemente un extremo de las suturas y eversión ligeramente el recipiente para inspeccionar la pared posterior de la embarcación. Nota: No debe haber fruncido de la pared vascular en ambos extremos de los sitios anastomosados. La mala circulación sanguínea después de la eliminación de las pinzas es un signo de trombosis. </li><li> El uso de aplicadores con punta de algodón, devolver los intestinos en la cavidad abdominal. </li><li> Con el soporte de la aguja Castroviejo y fórceps Graefe, cierre de la pared abdominal con 5-0 suturas de polipropileno utilizando costura continua. Cierre la capa de piel con el mismosuturas utilizando el cierre subcuticular. </li><li> Administrar Torbugesic (1 mg / kg) im inmediatamente después de concluir el trasplante. </li><li> Dé de inmediato, en el orden, atipamezol (1 mg / kg), ketoprofeno (5 mg / kg) y se calentó la solución por vía subcutánea de Ringer lactato. </li><li> Inmediatamente después de la cirugía, coloque los ratones en una jaula con calefacción bajo una manta de agua durante la noche (12 h). Durante el período de recuperación anestésica, colocar a los animales solos en una zona despejada limpio y seco. Línea de la jaula (autoclave) con toallas de papel limpias y ajustar la temperatura de la manta de agua a aproximadamente 20 a 22 ° C. Proporcionar croquetas secas y húmedas ad libitum en el suelo de la jaula. Nota: Un componente importante de la atención post-quirúrgica es la observación de la intervención de los animales y apropiado, según sea necesario, durante la recuperación de la anestesia y la cirugía. La intensidad necesaria de monitoreo variará con el animal y podría ser mayor durante el período de recuperación anestésica inmediata como compared para más adelante en la recuperación postoperatoria. </li><li> Continuamente monitorear animales que la anestesia sufridas monitoreados hasta que se recuperen por completo. El animal debe ser capaz de mantener decúbito esternal sin ayuda y debe parecer tranquilo y libre de dolor antes de que pueda ser dejado sin atención. </li><li> Dé buprenorfina (0,1 mg / kg BID) y ketoprofeno (5 mg / kg SID) para un período de tres días, ambos por vía subcutánea. </li><li> Monitor cardiovascular y la función respiratoria, temperatura corporal, y el dolor postoperatorio o molestias durante la recuperación de la anestesia durante un mínimo de tres días. Cuidado adicional puede ser necesaria, tales como la administración de analgésicos y otros fármacos y fluidos parenterales para reducir al mínimo la pérdida de la deshidratación y electrolitos. </li><li> Evaluar el éxito de la cirugía de trasplante mediante la observación de la función motora de las extremidades traseras. El éxito completo del trasplante implica el flujo de sangre sin obstáculos a la extremidad y la cola trasera, que debe ser inmediata tras la recuperación de la animal, y la recuperación completa sin parálisis de las extremidades traseras en el segundo día </li></ol></li></ol> 3. Tissue Collection Nota: Los puntos finales predeterminados estándar 3-60 días dependiendo del tipo de análisis deseado y la naturaleza de la falta de coincidencia antígeno. En general, el engrosamiento de la íntima es robusto en el día 30 después del trasplante a través de cepas completas ratón coincidentes MHC. <ol><li> Anestesiar al ratón con inyecciones intraperitoneales de ketamina (100 mg / kg; 10 mg / ml) y xilazina (10 mg / kg; 1 mg / ml). Evaluar la profundidad de la anestesia pellizcando la parte grasa de la almohadilla de la pata animal. Proceda con la cirugía cuando el animal no presenta reflejo de retirada. </li><li> Limpiar el sitio quirúrgico con agua y terminando con 70% de alcohol. </li><li> Colocar el animal en posición supina sobre una bandeja forrada con almohadilla absorbente. </li><li> Abra la cavidad abdominal con una incisión longitudinal gran línea media. Coloque un retractor auto-retención para exponer la cavidad, la una IVCd la aorta abdominal. </li><li> Separar suavemente el segmento aórtico donante trasplantado de la vecina IVC usando un par de pinzas 5 No. médica. Tenga especial cuidado de no despojar a la adventicia del vaso trasplantado. </li><li> Exponer la cavidad torácica por el corte a través de las costillas a lo largo de ambos lados de la columna torácica todo el camino a la entrada torácica. Reflejar la pared anterior del tórax superiormente para exponer el pericardio y asegurar la caja torácica con un par de pinzas hemostáticas. </li><li> Una vez que el corazón está expuesto, inserte un 25 G 5/8 aguja (unida a una jeringa) en el ventrículo izquierdo y al ras con 0,1 ml de solución salina heparinizada (100 U / ml). </li><li> El uso de un par de tijeras, quite la aurícula derecha para permitir que la sangre, solución salina heparinizada y fijador para salir del cuerpo durante la perfusión. Perfundir el animal con 5 ml de paraformaldehído al 4% o hasta que se ejecuta el líquido claro. Quite el corazón para asegurar la eutanasia. </li><li> Impuestos Especiales trasplantado segmento de vaso y sumergirse en el 4% párrformaldehído por no más de una hora. Ajuste el recipiente trasplantado en octubre (temperatura óptima de corte) de la matriz y la congelación de flash. Sección del buque en un criostato fijado en 8 um de espesor. Secciones se tiñen con hematoxilina y eosina y / o Verhoeff-van Gieson (van Gieson) tinción elástica. </li></ol> 4. Análisis morfológico de los injertos Nota: TA se caracteriza por el engrosamiento de la íntima 13. En este modelo, engrosamiento de la íntima y una reducción resultante en el tamaño del lumen son un reflejo de la gravedad de la lesión vascular inmunomediada. Syngraft controles se utilizan para determinar las características basales de los vasos en ausencia de respuestas inmunes alogénicas. Estos controles permiten también la evaluación de daño arterial que se produce como resultado de la intervención quirúrgica. No debe haber engrosamiento de la íntima en syngrafts. <ol><li> Para examinar el engrosamiento de la íntima y la oclusión luminal, medir el área dentro de la célula endotelialcapa, lámina elástica interna (IEL) y la lámina elástica externa (EEL) en los segmentos de las arterias elásticas manchado van Gieson con un software de análisis de imágenes. Los parámetros siguientes se pueden utilizar para determinar los cambios arteriales reflectantes de TA. <ol><li> Mida el área de la íntima absoluta: área dentro de la lámina elástica interna - el área dentro de la capa de células endoteliales. Esto proporciona una medida absoluta de la expansión de la íntima, que es el sello de TA. </li><li> Mida la absoluta zona medial: área dentro de la lámina elástica externa - área dentro de la lámina elástica interna. Esto proporciona una medida absoluta de la degradación medial o el crecimiento, que en ocasiones puede ocurrir como resultado de los cambios inmunes a esta región de la pared del vaso. </li><li> Medir el área total recipiente como el área dentro de la lámina elástica externa. Esto proporciona una medida de remodelado vascular que implica la expansión o la constricción de las arterias como resultado de un daño inmunológico. </li><li> Medidala íntima / media: (área dentro de la lámina elástica interna - área dentro de la capa de células endoteliales) / (área dentro de la lámina elástica externa - área dentro de la lámina elástica interna). Esto proporciona una medida relativa de expansión de la íntima y normaliza las diferencias en el tamaño de los buques. </li><li> Mida el estrechamiento luminal%: [(área dentro de la lámina elástica interna - área dentro de la capa de células endoteliales) / área con la lámina elástica interna)] * 100. Esto proporciona una medida de la extensión de la oclusión luminal, que resulta de una combinación de expansión de la íntima y la remodelación (hacia dentro o hacia fuera) de la pared del vaso. </li></ol></li></ol>

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	<li>Billingham, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graft+coronary+disease:+the+lesions+and+the+patients.">Graft coronary disease: the lesions and the patients.</a> Transplant Proc. 21, 3665-3666 (1989).</li><li>Foegh, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+rejection--graft+arteriosclerosis.">Chronic rejection--graft arteriosclerosis.</a> Transplant Proc. 22, 119-122 (1990).</li><li>Libby, P., Pober, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+rejection.">Chronic rejection.</a> Immunity. 14, 387-397 (2001).</li><li>Tellides, G., Pober, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-gamma+axis+in+graft+arteriosclerosis.">Interferon-gamma axis in graft arteriosclerosis.</a> Circulation research. 100, 622-632 (2007).</li><li>Johnson, D. E., Gao, S. Z., Schroeder, J. S., DeCampli, W. M., Billingham, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spectrum+of+coronary+artery+pathologic+findings+in+human+cardiac+allografts.">The spectrum of coronary artery pathologic findings in human cardiac allografts.</a> The Journal of heart transplantation. 8, 349-359 (1989).</li><li>Gao, S. Z., Alderman, E. L., Schroeder, J. S., Silverman, J. F., Hunt, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+coronary+vascular+disease+in+the+heart+transplant+patient:+coronary+arteriographic+findings.">Accelerated coronary vascular disease in the heart transplant patient: coronary arteriographic findings.</a> Journal of the American College of Cardiology. 12, 334-340 (1988).</li><li>Mennander, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+rejection+in+rat+aortic+allografts.+An+experimental+model+for+transplant+arteriosclerosis.">Chronic rejection in rat aortic allografts. An experimental model for transplant arteriosclerosis.</a> Arterioscler Thromb. 11, 671-680 (1991).</li><li>Choy, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granzymes+and+perforin+in+solid+organ+transplant+rejection.">Granzymes and perforin in solid organ transplant rejection.</a> Cell Death Differ. 17, 567-576 (2010).</li><li>Johnson, P., Carpenter, M., Hirsch, G., Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recipient+cells+form+the+intimal+proliferative+lesion+in+the+rat+aortic+model+of+allograft+arteriosclerosis.">Recipient cells form the intimal proliferative lesion in the rat aortic model of allograft arteriosclerosis.</a> Am J Transplant. 2, 207-214 (2002).</li><li>Minami, E., Laflamme, M. A., Saffitz, J. E., Murry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracardiac+progenitor+cells+repopulate+most+major+cell+types+in+the+transplanted+human+heart.">Extracardiac progenitor cells repopulate most major cell types in the transplanted human heart.</a> Circulation. 112, 2951-2958 (2005).</li><li>Yu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AIP1+prevents+graft+arteriosclerosis+by+inhibiting+interferon-gamma-dependent+smooth+muscle+cell+proliferation+and+intimal+expansion.">AIP1 prevents graft arteriosclerosis by inhibiting interferon-gamma-dependent smooth muscle cell proliferation and intimal expansion.</a> Circ Res. 109, 418-427 (2011).</li><li>Miller, C., DeWitt, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+humoral+responses+to+major+and+minor+histocompatibility+antigens.">Cellular and humoral responses to major and minor histocompatibility antigens.</a> Transplant Proc. 5, 303-305 (1973).</li><li>Tsutsui, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lumen+loss+in+transplant+coronary+artery+disease+is+a+biphasic+process+involving+early+intimal+thickening+and+late+constrictive+remodeling:+results+from+a+5-year+serial+intravascular+ultrasound+study.">Lumen loss in transplant coronary artery disease is a biphasic process involving early intimal thickening and late constrictive remodeling: results from a 5-year serial intravascular ultrasound study.</a> Circulation. 104, 653-657 (2001).</li><li>Rossum, A., Enns, W., Shi, P., MacEwan, G. E., Choy, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bim+regulates+allogeneic+immune+responses+and+transplant+arteriosclerosis+through+effects+on+T+cell+activation+and+death.">Bim regulates allogeneic immune responses and transplant arteriosclerosis through effects on T cell activation and death.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34, 1290-1297 (2014).</li><li>Ho, M. K., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+distribution,+structural+characterization,+and+biosynthesis+of+Mac-3,+a+macrophage+surface+glycoprotein+exhibiting+molecular+weight+heterogeneity.">Tissue distribution, structural characterization, and biosynthesis of Mac-3, a macrophage surface glycoprotein exhibiting molecular weight heterogeneity.</a> J Biol Chem. 258, 636-642 (1983).</li><li>Inoue, T., Plieth, D., Venkov, C. D., Xu, C., Neilson, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+against+macrophages+that+overlap+in+specificity+with+fibroblasts.">Antibodies against macrophages that overlap in specificity with fibroblasts.</a> Kidney international. 67, 2488-2493 (2005).</li><li>Shi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunologic+basis+of+transplant-associated+arteriosclerosis.">Immunologic basis of transplant-associated arteriosclerosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 4051-4056 (1996).</li><li>Skaro, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8++T+cells+mediate+aortic+allograft+vasculopathy+by+direct+killing+and+an+interferon-gamma-dependent+indirect+pathway.">CD8+ T cells mediate aortic allograft vasculopathy by direct killing and an interferon-gamma-dependent indirect pathway.</a> Cardiovasc Res. 65, 283-291 (2005).</li><li>Tellides, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-gamma+elicits+arteriosclerosis+in+the+absence+of+leukocytes.">Interferon-gamma elicits arteriosclerosis in the absence of leukocytes.</a> Nature. 403, 207-211 (2000).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-gamma+induces+human+vascular+smooth+muscle+cell+proliferation+and+intimal+expansion+by+phosphatidylinositol+3-kinase+dependent+mammalian+target+of+rapamycin+raptor+complex+1+activation.">Interferon-gamma induces human vascular smooth muscle cell proliferation and intimal expansion by phosphatidylinositol 3-kinase dependent mammalian target of rapamycin raptor complex 1 activation.</a> Circ Res. 101, 560-569 (2007).</li><li>Soulez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+perlecan+fragment+LG3+is+a+novel+regulator+of+obliterative+remodeling+associated+with+allograft+vascular+rejection.">The perlecan fragment LG3 is a novel regulator of obliterative remodeling associated with allograft vascular rejection.</a> Circ Res. 110, 94-104 (2012).</li><li>Choy, J. C., Kerjner, A., Wong, B. W., McManus, B. M., Granville, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perforin+mediates+endothelial+cell+death+and+resultant+transplant+vascular+disease+in+cardiac+allografts.">Perforin mediates endothelial cell death and resultant transplant vascular disease in cardiac allografts.</a> Am J Pathol. 165, 127-133 (2004).</li><li>Choy, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granzyme+B+induces+endothelial+cell+apoptosis+and+contributes+to+the+development+of+transplant+vascular+disease.">Granzyme B induces endothelial cell apoptosis and contributes to the development of transplant vascular disease.</a> Am J Transplant. 5, 494-499 (2005).</li><li>Reis, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dramatic+remodeling+of+advanced+atherosclerotic+plaques+of+the+apolipoprotein+E-deficient+mouse+in+a+novel+transplantation+model.">Dramatic remodeling of advanced atherosclerotic plaques of the apolipoprotein E-deficient mouse in a novel transplantation model.</a> Journal of vascular surgery. 34, 541-547 (2001).</li><li>Potteaux, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppressed+monocyte+recruitment+drives+macrophage+removal+from+atherosclerotic+plaques+of+Apoe-/-+mice+during+disease+regression.">Suppressed monocyte recruitment drives macrophage removal from atherosclerotic plaques of Apoe-/- mice during disease regression.</a> J Clin Invest. 121, 2025-2036 (2011).</li></ol>

Hemos descrito un protocolo para la interposición de injerto aórtico en ratones que es útil para estudiar el rechazo vascular inmunomediada y TA. Este modelo puede ser utilizado para investigar las causas de la TA, así como el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas. Se ha utilizado en el pasado para establecer un papel esencial de la inmunidad adaptativa, las respuestas de células T citotóxicas, las respuestas efectoras CD4 de células T mediada por citoquinas, y el daño del injerto mediado por anticuerpo...

Durante los últimos 30 años, los avances en los fármacos inmunosupresores han disminuido el rechazo del injerto por rechazo agudo, pero el rechazo crónico sigue siendo un desafío principal. La principal manifestación de rechazo al trasplante cardíaco crónico es la arteriosclerosis del trasplante (TA) 1,2. Esta condición se caracteriza por hiperplasia de la íntima y la disfunción vasomotor de las arterias de aloinjertos y se desarrolla como resultado de la focalización inmunológica de las células musculares lisas y endoteliales por el sistema inmune del destinatario. La orientación específica de la vasculatura del injerto debido al reconocimiento de complejo de histocompatibilidad principal de péptido extranjera (MHC) se pone de relieve por el desarrollo de TA exclusivamente en las arterias de injerto sin afectar los vasos anfitrionas 3. En consonancia con esto es la observación de que la TA no se produce experimentalmente cuando el destinatario es genéticamente idéntico al donante o cuando el receptor carece de células T y B 4. Lesión vascular mediada inmunológicamente y dysfunction hace que el desarrollo de engrosamiento de la íntima y fibrosis, así como la acumulación aberrante de los lípidos y las proteínas ECM, en TA 5. Engrosamiento de la íntima tiende a ser concéntrico a lo largo de todo el árbol arterial 4-6. Pérdida del injerto y la muerte por lo general se producen como consecuencia de la isquemia progresiva como consecuencia de la oclusión luminal de las arterias de aloinjertos 4. En 1991, Mennander et al. 7 fue pionera en un modelo de interposición aórtica en ratas para modelar TA. Varios grupos han adaptado posteriormente este procedimiento para su uso en ratones. En este modelo, los segmentos aórticos de aloinjertos desarrollan lesiones que tienen características comparables a TA observaron en los trasplantes clínicos. Esto incluye engrosamiento de la íntima que se caracteriza por la acumulación de células de músculo liso como receptores 7 y leucocitos. Durante los últimos 2 décadas este modelo ha sido utilizado para generar importante información sobre los mecanismos de lesión vascular, el rechazo y TA. Puede ser nosotrosed para examinar cuestiones relacionadas con la respuesta inmune y vasculares durante la patología arterial. La elección de los impactos desajuste antígeno la capacidad para hacer frente adecuadamente a estas preguntas. Trasplante a través de barreras completas MHC permite una evaluación completa de las respuestas inmunes que se sabe que están implicados en el rechazo del trasplante de órganos. Esto incluye el reconocimiento de células CD4 y CD8 T directo y la focalización de extranjera péptido-MHC presentado por células del injerto derivado, CD4 indirecto (y posiblemente CD8) el reconocimiento de células T y la orientación de los aloantígenos de injerto derivado presentados por células presentadoras de antígeno receptor, y anticuerpo reconocimiento mediado de aloantígenos en las superficies celulares vasculares 8. Sin embargo, la respuesta a la lesión vascular en los experimentos completos coincidentes-MHC puede ser diferente que el observado clínicamente. Johnson et al. 9 mostró que, en los injertos de interposición aórticos trasplantados a través de una barrera completa MHC falta de coincidencia, la mayoría delas células de la neoíntima son de origen destinatario y no de origen donante. Esto es diferente que la observada en los trasplantes humanos donde la mayoría de las células del músculo liso de la íntima son de origen donante 9,10. Para tener en cuenta esta limitación, los modelos experimentales alternativos que implican injerto a través de los descalces de antígeno de histocompatibilidad menor importancia se han desarrollado que desencadenan respuestas vasculares que se asemejan más a los observados en el trasplante clínico 11. Si bien estos modelos alternativos permiten conclusiones importantes que hacer con respecto a las respuestas vasculares que impulsan el desarrollo de la asistencia técnica, los procesos inmunológicos que causan rechazo vascular en antígeno de histocompatibilidad menor injertos no coincidentes no completamente re-capitular las que se producen en el ámbito clínico. Por ejemplo, los antígenos menores de histocompatibilidad se reconocen mal por injerto anticuerpos reactivos 12. Teniendo en cuenta las consideraciones anteriores, es importante considerar el questi patológicaal ser examinado en la elección del tipo de desajuste antígeno utilizado en un modelo interposición aórtica. Aquí se describe un protocolo detallado para murino injerto de interposición aórtica. Se describe el injerto de interposición entre los ratones MHC-coincidentes completos pero el mismo protocolo se utiliza para injertar a través de otras cepas de ratón coincidentes antígeno.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6J (H-2b)</td><td>Jackson Laboratories, Bar Harbour ME</td><td>Strain# 000664</td><td></td></tr><tr><td>Balb/cBYJ</td><td>Jackson Laboratories, Bar Harbour ME</td><td>Strain# 001026</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine Hydrochloride Injection USP 100 mg/ml</td><td>Ketalean</td><td>DIN 00612316</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylazine Injection 20 mg/ml</td><td>Rompum</td><td>DIN 02169592</td><td></td></tr><tr><td>Ketoprofen Injection 100 mg/ml</td><td>Anafen</td><td>DIN 01938126</td><td></td></tr><tr><td>Butorphanol Tartrate&amp;nbsp;injection 10 mg/ml</td><td>Torbugesic</td><td>DIN 008450000</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphine Injection 0.3 mg/ml</td><td>Reckitt Benckiser</td><td>B.N. 5241</td><td></td></tr><tr><td>Atipamezole hydrochloride sterile injectable solution</td><td>Antisedan</td><td>DIN 02237744</td><td></td></tr><tr><td>Heparin Sodium Injection, USP, 1,000 units/ml</td><td>McKesson Distribution</td><td>DIN 02264315</td><td></td></tr><tr><td>Tears naturale ophthalmic ointment</td><td>Alcon</td><td>DIN 02082519</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Leica</td><td>M80</td><td></td></tr><tr><td>0.9% Sodium Chloride, sterile</td><td>Baxter Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lactated Ringer&amp;rsquo;s solution, sterile</td><td>Baxter Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.9% Sodium Chloride Injection, sterile, 10 ml</td><td>Baxter Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alcohol Prep Pads</td><td>Loris</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Povidone Iodine</td><td>Betadine</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorohexidine Gluconate 4% w/v</td><td>Germi-Stat</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Black Polyamide Monofilament</td><td>AROSurgical Instruments</td><td>T4A10Q07</td><td></td></tr><tr><td>Suture, 10-0 suture, 70 microns</td><td>Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blue monofilament suture 5-0, P3 needle</td><td>Ethicon</td><td>8698G</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Syringe</td><td>BD</td><td>REF 309659</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Syringe</td><td>BD</td><td>REF 309604</td><td></td></tr><tr><td>1cc TB insulin syringe with 28 G 1/2</td><td>BD</td><td>REF 309309</td><td></td></tr><tr><td>25 G 7/8, hypodermic needle</td><td>BD</td><td>REF 305124</td><td></td></tr><tr><td>27 G 1/2, hypodermic needle</td><td>BD</td><td>REF 305109</td><td></td></tr><tr><td>Colibri Retractor- 1.5 cm spread 4 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>17000-04</td><td></td></tr><tr><td>S&amp;amp;T CAF-4 Clip applying forceps, without lock</td><td>Fine Science Tools</td><td>00072-14</td><td></td></tr><tr><td>Supergrip forceps, S&amp;amp;T</td><td>Fine Science Tools</td><td>00632-11</td><td></td></tr><tr><td>Medical No.5 forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11253-20</td><td></td></tr><tr><td>Lexer Baby Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14078-10</td><td></td></tr><tr><td>Micro Adson forceps serrated</td><td>Fine Science Tools</td><td>11018-12</td><td></td></tr><tr><td>Vannas-Tubingen microscissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>Micro clamps, b-1; 3.5mm x 1mm; 7mm length</td><td>Fine Science Tools</td><td>00396-01</td><td></td></tr><tr><td>Graefe-forceps, 10cm 1x2 teeth</td><td>Fine Science Tools</td><td>11054-10</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo with lock and tungsten jaws</td><td>Fine Science Tools</td><td>12565-14</td><td></td></tr><tr><td>Hot glass bead sterilizer</td><td>Inotech 250</td><td>IS-250 - Steri-250</td><td></td></tr><tr><td>Non-woven gauzes</td><td>Progene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cotton Tipped Applicators</td><td>Puritan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beard Trimmer</td><td>Wahl</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heating pad</td><td>Sunbeam</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mouse model of alloimmune-induced vascular rejection and transplant arteriosclerosis

Vascular rejection that leads to transplant arteriosclerosis (TA) is the leading representation of chronic heart transplant failure. In TA, the immune system of the recipient causes damage of the arterial wall and dysfunction of endothelial cells and smooth muscle cells. This triggers a pathological repair response that is characterized by intimal thickening and luminal occlusion. Understanding the mechanisms by which the immune system causes vasculature rejection and TA may inform the development of novel ways to manage graft failure. Here, we describe a mouse aortic interposition model that can be used to study the pathogenic mechanisms of vascular rejection and TA. The model involves grafting of an aortic segment from a donor animal into an allogeneic recipient. Rejection of the artery segment involves alloimmune reactions and results in arterial changes that resemble vascular rejection. The basic technical approach we describe can be used with different mouse strains and targeted interventions to answer specific questions related to vascular rejection and TA.

En este modelo, la aorta abdominal de un ratón Balb / CYJ se interpone en la aorta infrarrenal de un C57BL / 6 destinatario. Esto permite una evaluación completa de aloinmunes respuestas que se dirigen a las arterias de aloinjertos. Lesión vascular inmunomediada en este modelo inicia respuestas reparadoras vasculares que culminan en el engrosamiento de la íntima, el estrechamiento luminal y el reclutamiento de células inmunes (Figuras 1 y 2). Estos criterios sirven entonces como un...

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Mouse Model of Alloimmune-induced Vascular Rejection and Transplant Arteriosclerosis

We describe a protocol for aortic interposition grafting in mice. The goal of the protocol is to provide a model with which to study pathological processes and therapeutic strategies relevant to alloimmune reactions in arteries and the resultant arterial changes that contribute to organ transplant failure.

Modelo de ratón de rechazo vascular inducida por aloinmune y Arteriosclerosis Trasplante

Vascular rejection that leads to transplant arteriosclerosis (TA) is the leading representation of chronic heart transplant failure. In TA, the immune ...

mouse-model-alloimmune-induced-vascular-rejection-transplant

Research

JoVE Journal

Medicine

8.4K vistas.  Simon Fraser University. We describe a protocol for aortic interposition grafting in mice. The goal of the protocol is to provide a model with which to study pathological processes and therapeutic strategies relevant to alloimmune reactions in arteries and the resultant arterial changes that contribute to organ transplant failure. 

Video: Mouse Model of Alloimmune-induced Vascular Rejection and Transplant Arteriosclerosis

Orthotopic Aortic Transplantation: A Rat Model to Study the Development of Chronic Vasculopathy

Research models of chronic rejection are essential to investigate pathobiological and pathophysiological processes during the development of transplant vasculopathy (TVP).
The commonly used animal model for cardiovascular chronic rejection studies is the heterotopic heart transplant model performed in laboratory rodents. This model is used widely in experiments since Ono and Lindsey (3) published their technique. To analyze the findings in the blood vessels, the heart has to be sectioned and all vessels have to be measured.
Another method to investigate chronic rejection in cardiovascular questionings is the aortic transplant model (1, 2). In the orthotopic aortic transplant model, the aorta can easily be histologically evaluated (2). The PVG-to-ACI model is especially useful for CAV studies, since acute vascular rejection is not a major confounding factor and Cyclosporin A (CsA) treatment does not prevent the development of CAV, similar to what we find in the clinical setting (4). A7-day period of CsA is required in this model to prevent acute rejection and to achieve long-term survival with the development of TVP.
This model can also be used to investigate acute cellular rejection and media necrosis in xenogeneic models (5).

This video demonstrates the orthotopic aortic transplant model as a simple model to study the development of transplant vasculopathy (TVP) in rats.

Trasplante ortotópico aórtica: un modelo de rata para estudiar el desarrollo de la enfermedad vascular crónica

Research models of chronic rejection are essential to investigate pathobiological and pathophysiological processes during the development of transplant ...

Investigación

Medicina

Orthotopic Aortic Transplantation in Mice for the Study of Vascular Disease

Vascular procedures involving anastomoses in the mouse are generally thought to be difficult and highly dependent on the skill of the individual surgeon. This is largely true, but there are a number of important principles that can reduce the difficulty of these procedures and enhance reproducibility. Orthotopic aortic transplantation is an excellent procedure in which to learn these principles because it involves only two end-to-end anastomoses, but requires good suturing technique and handling of the vessels for consistent success. This procedure begins with the procurement of a length of abdominal aorta from a donor animal, followed by division of the native aorta in the recipient. The procured aorta is then placed between the divided ends of the recipient aorta and sutured into place using end-to-end anastomoses. To accomplish this objective successfully requires a high degree of concentration, good tools, a steady hand, and an appreciation of how easily the vasculature of a mouse can be damaged, resulting in thrombosis. Learning these important principles is what occupies most of the beginner's time when learning microsurgery in small rodents. Throughout this protocol, we refer to these important points. This model can be used to study vascular disease in a variety of different experimental systems1-8. In the context shown here, it is most often used for the study of post-transplant vascular disease, a common long-term complication of solid organ transplantation in which intimal hyperplasia occurs within the allograft. The primary advantage of the model is that it facilitates quantitative morphometric analyses and the transplanted vessel lies contiguous to the endogenous vessel, which can serve as an additional control9. The technique shown here is most often used for mice weighing 18-25 grams. We have accumulated most of our experience using the C57BL/6J, BALB/cJ, and C3H/HeJ strains.

We describe a technique in which a section of the abdominal aorta from a mouse is transplanted orthotopically to just below the renal arteries in an allogeneic or syngeneic recipient. This technique can be useful in studies in which transplantation of large arteries of uniform size is deemed advantageous.

El trasplante ortotópico aórtica en los ratones para el Estudio de la Enfermedad Vascular

Vascular procedures involving anastomoses in the mouse are generally thought to be difficult and highly dependent on the skill of the individual surgeon. ...

Mouse Models for Graft Arteriosclerosis

Graft arteriosclerois (GA), also called allograft vasculopathy, is a pathologic lesion that develops over months to years in transplanted organs characterized by diffuse, circumferential stenosis of the entire graft vascular tree. The most critical component of GA pathogenesis is the proliferation of smooth muscle-like cells within the intima. When a human coronary artery segment is interposed into the infra-renal aortae of immunodeficient mice, the intimas could be expand in response to adoptively transferred human T cells allogeneic to the artery donor or exogenous human IFN-&gamma; in the absence of human T cells. Interposition of a mouse aorta from one strain into another mouse strain recipient is limited as a model for chronic rejection in humans because the acute cell-mediated rejection response in this mouse model completely eliminates all donor-derived vascular cells from the graft within two-three weeks. We have recently developed two new mouse models to circumvent these problems. The first model involves interposition of a vessel segment from a male mouse into a female recipient of the same inbred strain (C57BL/6J). Graft rejection in this case is directed only against minor histocompatibility antigens encoded by the Y chromosome (present in the male but not the female) and the rejection response that ensues is sufficiently indolent to preserve donor-derived smooth muscle cells for several weeks. The second model involves interposing an artery segment from a wild type C57BL/6J mouse donor into a host mouse of the same strain and gender that lacks the receptor for IFN-&gamma; followed by administration of mouse IFN-&gamma; (delivered via infection of the mouse liver with an adenoviral vector. There is no rejection in this case as both donor and recipient mice are of the same strain and gender but donor smooth muscle cells proliferate in response to the cytokine while host-derived cells, lacking receptor for this cytokine, are unresponsive. By backcrossing additional genetic changes into the vessel donor, both models can be used to assess the effect of specific genes on GA progression. Here, we describe detailed protocols for our mouse GA models.

We describe protocols for our mouse graft arteriosclerois (GA) models which involve interposition of a mouse vessel segment into a recipient of the same inbred strain. By backcrossing additional genetic changes into the vessel donor, the model can assess the effect of specific genes on GA.

Modelos de ratón para Arteriosclerosis Graft

Graft arteriosclerois (GA),  also called allograft vasculopathy, is a pathologic lesion that develops over  months to years in transplanted organs ...

Mouse Kidney Transplantation: Models of Allograft Rejection

Rejection of the transplanted kidney in humans is still a major cause of morbidity and mortality. The mouse model of renal transplantation closely replicates both the technical and pathological processes that occur in human renal transplantation. Although mouse models of allogeneic rejection in organs other than the kidney exist, and are more technically feasible, there is evidence that different organs elicit disparate rejection modes and dynamics, for instance the time course of rejection in cardiac and renal allograft differs significantly in certain strain combinations. This model is an attractive tool for many reasons despite its technical challenges. As inbred mouse strain haplotypes are well characterized it is possible to choose donor and recipient combinations to model acute allograft rejection by transplanting across MHC class I and II loci. Conversely by transplanting between strains with similar haplotypes a chronic process can be elicited were the allograft kidney develops interstitial fibrosis and tubular atrophy. We have modified the surgical technique to reduce operating time and improve ease of surgery, however a learning curve still needs to be overcome in order to faithfully replicate the model. This study will provide key points in the surgical procedure and aid the process of establishing this technique.

Here, we present a protocol to study the immunology of rejection. The surgical model presented reports a short operating time and a concise technique. Depending on the donor-recipient strain combination, the transplanted kidney may develop acute cellular rejection or chronic allograft damage, defined by interstitial fibrosis and tubular atrophy.

Ratón Trasplante de Riñón: Modelos de rechazo del aloinjerto

Rejection of the transplanted kidney in humans is still a major cause of morbidity and mortality. The mouse model of renal transplantation closely ...

In Vitro and In Vivo Assessment of T, B and Myeloid Cells Suppressive Activity and Humoral Responses from Transplant Recipients

The main concern in transplantation is to achieve specific tolerance through induction of regulatory cells. The understanding of tolerance mechanisms requires reliable models. Here, we describe models of tolerance to cardiac allograft in rat, induced by blockade of costimulation signals or by upregulation of immunoregulatory molecules through gene transfer. Each of these models allowed in vivo generation of regulatory cells such as regulatory T cells (Tregs), regulatory B cells (Bregs) or regulatory myeloid cells (RegMCs). In this manuscript, we describe two complementary protocols that have been used to identify and define in vitro and in vivo regulatory cell activity to determine their responsibility in tolerance induction and maintenance. First, an in vitro suppressive assay allowed rapid identification of cells with suppressive capacity on effector immune responses in a dose dependent manner, and can be used for further analysis such as cytokine measurement or cytotoxicity. Second, the adoptive transfer of cells from a tolerant treated recipient to a newly irradiated grafted recipient, highlighted the tolerogenic properties of these cells in controlling graft directed immune responses and/or converting new regulatory cells (termed infectious tolerance). These methods are not restricted to cells with known phenotypic markers and can be extended to any cell population. Furthermore, donor directed allospecificity of regulatory cells (an important goal in the field) can be assessed by using third party donor cells or graft either in vitro or in vivo. Finally, to determine the specific tolerogenic capacity of these regulatory cells, we provide protocols to assess the humoral anti-donor antibody responses and the capacity of the recipient to develop humoral responses against new or former known antigens. The models of tolerance described can be used to further characterize regulatory cells, to identify new biomarkers, and immunoregulatory molecules, and are adaptable to other transplantation models or autoimmune diseases in rodent or human.

In Vitro and In Vivo Assessment of T, B and Myeloid Cells Suppressive Activity and Humoral Responses from Transplant Recipients

Here, we present a protocol to induce tolerance in transplantation, and assess in vitro and in vivo the suppressive capacity of distinct cell subsets from the recipient and the immune status of the recipient toward donor or exogenous antigens.

In Vitro e In Vivo la evaluación de la actividad supresora T, B y las células mieloides y las respuestas humorales de los receptores de trasplante

The main concern in transplantation is to achieve specific tolerance through induction of regulatory cells. The understanding of tolerance mechanisms ...

Inmunología e Infección

A Novel Microsurgical Model for Heterotopic, En Bloc Chest Wall, Thymus, and Heart Transplantation in Mice

Exploration of novel strategies in organ transplantation to prolong allograft survival and minimizing the need for long-term maintenance immunosuppression must be pursued. Employing vascularized bone marrow transplantation and co-transplantation of the thymus have shown promise in this regard in various animal models.1-11 Vascularized bone marrow transplantation allows for the uninterrupted transfer of donor bone marrow cells within the preserved donor microenvironment, and the incorporation of thymus tissue with vascularized bone marrow transplantation has shown to increase T-cell chimerism ultimately playing a supportive role in the induction of immune regulation. The combination of solid organ and vascularized composite allotransplantation can uniquely combine these strategies in the form of a novel transplant model. Murine models serve as an excellent paradigm to explore the mechanisms of acute and chronic rejection, chimerism, and tolerance induction, thus providing the foundation to propagate superior allograft survival strategies for larger animal models and future clinical application. Herein, we developed a novel heterotopic en bloc chest wall, thymus, and heart transplant model in mice using a cervical non-suture cuff technique. The experience in syngeneic and allogeneic transplant settings is described for future broader immunological investigations via an instructional manuscript and video supplement.

To study combined solid organ and vascularized composite allotransplantation, we describe a novel heterotopic en bloc chest wall, thymus, and heart transplant model in mice using a cervical non-suture cuff technique.

Un microquirúrgica Modelo Novela de heterotópico, en bloque, pared torácica, el timo y el trasplante cardiaco en ratones

Exploration of novel strategies in organ transplantation to prolong allograft survival and minimizing the need for long-term maintenance immunosuppression ...

Orthotopic Hind Limb Transplantation in the Mouse

In vivo animal model systems, and in particular mouse models, have evolved into powerful and versatile scientific tools indispensable to basic and translational research in the field of transplantation medicine. A vast array of reagents is available exclusively in this setting, including mono- and polyclonal antibodies for both diagnostic and interventional applications. In addition, a vast number of genotyped, inbred, transgenic, and knock out strains allow detailed investigation of the individual contributions of humoral and cellular components to the complex interplay of an immune response and make the mouse the gold standard for immunological research. 
Vascularized Composite Allotransplantation (VCA) delineates a novel field of transplantation using allografts to replace "like with like" in patients suffering traumatic or congenital tissue loss. This surgical methodological protocol shows the use of a non-suture cuff technique for super-microvascular anastomosis in an orthotopic mouse hind limb transplantation model. The model specifically allows for comparison between established paradigms in solid organ transplantation with a novel form of transplants consisting of various different tissue components. Uniquely, this model allows for the transplantation of a viable vascularized bone marrow compartment and niche that have the potential to exert a beneficial effect on the balance of immune acceptance and rejection. This technique provides a tool to investigate alloantigen recognition and allograft rejection and acceptance, as well as enables the pursuit of functional nerve regeneration studies to further advance this novel field of transplantation.

This novel model for orthotopic hind limb transplantation in the mouse, applying a non-suture cuff technique for super-microvascular anastomosis, provides a powerful tool for in&#160;vivo mechanistic immunological research related to vascularized composite allotransplantation (VCA).

Ortotópico de la extremidad posterior de trasplante en el ratón

In vivo animal model systems, and in particular mouse models, have evolved into powerful and versatile scientific tools indispensable to basic and ...

Modified Heterotopic Hindlimb Osteomyocutaneous Flap Model in the Rat for Translational Vascularized Composite Allotransplantation Research

Vascularized composite allotransplantation (VCA) is a relatively new field in the reconstructive surgery. Clinical achievements in human VCA include hand and face transplants and, more recently, abdominal wall, uterus, and urogenital transplants. Functional outcomes have exceeded initial expectations, and most recipients enjoy an improved quality of life. However, as clinical experience accumulates, chronic rejection and complications from the immunosuppression must be addressed. In many cases where grafts have failed, the causative pathology has been ischemic vasculopathy. <span style="font-size: 11pt; line-height: 115%; font-family: Arial, sans-serif; color: rgb(41, 43, 49); background-image: initial; background-position: initial; background-size: initial; background-repeat: initial; background-attachment: initial; background-origin: initial; background-clip: initial;">The biological mechanisms of the acute and chronic rejection associated with VCA, especially ischemic vasculopathy, are important areas of research. However, due to the very small number of VCA patients, the evaluation of proposed mechanisms is better addressed in an experimental model. Multiple groups have used animal models to address some of the relevant unsolved questions in VCA rejection and vasculopathy. Several model designs involving a variety of species are described in the literature. Here we present a reproducible model of VCA heterotopic hindlimb osteomyocutaneous flap in the rat that can be utilized for translational VCA research. This model allows for the serial evaluation of the graft, including biopsies and different imaging modalities, while maintaining a low level of morbidity.

Vascularized composite allograft offers life-altering benefits to transplant recipients, but the biological causes of graft rejection and vasculopathy remain poorly understood. The rodent surgical model presented here offers a reproducible, clinically relevant model of transplantation, allowing researchers to evaluate rejection events and potential therapeutic strategies to prevent their occurrence.

Modelo de colgajo Osteomiocucutáneo de extremidades posteriores modificados en la rata para investigación de compuestos alotransplante de compuesto translacional vascularizado

Vascularized composite allotransplantation (VCA) is a relatively new field in the reconstructive surgery. Clinical achievements in human VCA include hand ...

Murine Cervical Aortic Transplantation Model using a Modified Non-Suture Cuff Technique

With the introduction of powerful immunosuppressive protocols, distinct advances are possible in the prevention and therapy of acute rejection episodes. However, only minor improvement in the long-term results of transplanted solid organs could be observed over the past decades. In this context, chronic allograft vasculopathy (CAV) still represents the leading cause of late organ failure in cardiac, renal and pulmonary transplantation.
Thus far, the underlying pathogenesis of CAV development remains unclear, explaining why effective treatment strategies are presently missing and emphasizing a need for relevant experimental models in order to study the underlying pathophysiology leading to CAV formation. The following protocol describes a murine heterotopic cervical aortic transplantation model using a modified non-suture cuff technique. In this technique, a segment of the thoracic aorta is interpositioned in the right common carotid artery. With the use of the non-suture cuff technique, an easy to learn and reproducible model can be established, minimizing the possible heterogeneity of sutured vascular micro anastomoses.

Here, we present a protocol of heterotopic aortic transplantation in mice using the non-suture cuff technique in a cervical murine model. This model can be used to study the underlying pathology of chronic allograft vasculopathy (CAV) and can help evaluate new therapeutic agents in order to prevent its formation.

Modelo de trasplante de aórtica cervical murino utilizando una técnica de manguito no sutura modificada

With the introduction of powerful immunosuppressive protocols, distinct advances are possible in the prevention and therapy of acute rejection episodes. ...

A Rat Orthotopic Renal Transplantation Model for Renal Allograft Rejection

Renal allograft rejection limits the long-term survival of patients after renal transplantation. Rat orthotopic renal transplantation is an essential model to investigate the mechanism of renal allograft rejection in pre-clinical studies and could aid in the development of novel approaches to improve the long-term survival of renal allografts. Donor kidney implantation in rat orthotopic renal transplantation is commonly performed by end-to-side anastomosis to recipients' aorta and inferior vena cava. In this model, the donor's kidney was implanted using end-to-end anastomosis to the recipients' renal artery and renal vein. The donor's ureter was anastomosed to the recipient's bladder in an end-to-side 'tunnel' method. This model contributes to better healing of ureter-bladder anastomosis and increases the recipients' survival by avoiding interference with blood supply and venous reflux of the lower body. This model can be used to investigate the mechanisms of acute and chronic immune and pathologic rejection of renal allografts. Here, the study describes the detailed protocols of this orthotopic renal transplantation between rats.

The rat orthotopic renal transplantation model contributes to investigating the mechanism of renal allograft rejection. The current model increases the recipients' survival without interference with blood supply and venous reflux of the lower body using an end-to-end anastomosis of kidney implantation and an end-to-side "tunnel" method of ureter-bladder anastomosis.

Un modelo de trasplante renal ortotópico de rata para el rechazo del aloinjerto renal

Renal allograft rejection limits the long-term survival of patients after renal transplantation. Rat orthotopic renal transplantation is an essential ...