Este trabalho foi financiado por doações dos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde e Heart and Stroke Foundation of BC &amp; Yukon (JCC).

Todos os protocolos deste estudo foram revisados ​​e aprovados pelo comitê de ética de cuidados de animais Simon Fraser University. Use Balb / CYJ (H2 d) camundongos doadores e camundongos C57BL / 6 (H2 b) beneficiários para analisar reações alogênicos. Os ratos são utilizados em experiências, com idades entre 8 a 12 semanas. Use camundongos ou femininos ou masculinos. Controlos singeneicos consistem de segmentos de aorta de ratinhos C57BL / 6 dadores em receptores C57BL / 6. 1. doador e receptor Preparação Nota: Tanto o dador eo receptor são anestesiados e preparados antes da cirurgia para minimizar a isquemia do enxerto. Anestésicos injectáveis ​​são usados ​​no protocolo para evitar a obstrução do animal por equipamentos necessários para a entrega de anestésicos inalados. No entanto, se desejado, anestésico inalatório é uma alternativa adequada. A partir da injecção inicial de os anestésicos, todo o procedimento leva cerca de 90 minutos a completar. Tempo de isquemia do enxerto é menos than 30 min. <ol><li> Anestesiar o rato com injecções intraperitoneais de cetamina (100 mg / kg; 10 mg / ml) e xilazina (10 mg / kg; 1 mg / mL). O rato vai ser sedado dentro de 10 a 15 min. Avaliar a profundidade da anestesia por beliscar a parte gorda da almofada do pé animal. Administrar 1/3 da dose original do cocktail de anestésico, conforme necessário, até que o animal não apresentam reflexo de retirada. Monitorar a freqüência respiratória de perto depois de cada cocktail é administrada. Durante a cirurgia, avaliar o nível de anestesia a cada 15 min, apertando a parede abdominal anterior com um par de pinças. Os ratos devem permanecem profundamente anestesiados por 60 a 90 min. </li><li> Lubrifique os olhos do rato com uma pomada oftálmica para evitar a secura sob anestesia. </li><li> Raspar o cabelo tão perto da pele quanto possível sobre a região ventral abdominal do meio-tórax ao púbis. Tenha especial cuidado para não nick qualquer pele. Não utilizar creme depilatório, pois pode ser absorvida into da pele e pode ser inflamatória. </li><li> Colocar o animal em decúbito dorsal sobre uma toalha sobre a mesa de aquecimento ou pad. </li><li> Limpe o local da cirurgia com uma esfoliação preliminar com 2% de cloro. Prepare uma grande área de trabalho para maximizar o campo cirúrgico. Iniciar a esfregar no centro do local cirúrgico e mover-se para o exterior de uma forma linear ou circular. Descarte a gaze. Repita este procedimento pelo menos cinco vezes mais. Aplique uma compressa embebida em álcool prep para a mesma área. Uma vez que o álcool é seco, prepare a área limpa com solução Betadine e cortina com gaze estéril. </li></ol> 2. End-to-end Anastomosis Procedimento <ol><li> Doador de Operação <ol><li> Manter uma técnica asséptica durante toda a operação. Limpe todas as superfícies da bancada e mesa cirúrgica com solução de 0,5% de peróxido de hidrogênio acelerado antes da utilização. Enrole e autoclave todos os instrumentos, gazes cirúrgicas, cortinas e roupas antes de usar. Verifique a esterilidade dos instrumentos com um vaportira indicadora esterilizador colocados em cada pacote. Luvas cirúrgicas estéreis são utilizados e eliminados entre as cirurgias. Por várias cirurgias, esterilizar os instrumentos cirúrgicos entre os usos com o esterilizador talão de vidro quente. </li><li> Posicione o mouse doador em decúbito dorsal em uma placa de Plexiglas fina limpa envolvida com cortina estéril sob o microscópio cirúrgico na ampliação 8-30X. </li><li> Depois de garantir anestesia cirúrgica adequada, conforme descrito no ponto 1.1, proceder com a cirurgia. </li><li> Com uma tesoura estéril, fazer uma única linha média inferior incisão abdominal longitudinal, a partir do púbis ao processo xifóide. </li><li> Usando um pequeno afastador, abra a parede abdominal para expor a cavidade. </li><li> Usando algodão estéril derrubado aplicadores, retrair delicadamente os intestinos superiormente para o animal de esquerda e cobrir com gaze umedecida com solução salina. Mova os órgãos reprodutivos inferiormente e localize a aorta infra-renal e veia cava inferior (VCI). Moisdez os tecidos expostos periodicamente com solução salina. </li><li> Usando os No. médico 5 fórceps, separar a aorta a partir da VCI, a partir do nível da artéria renal esquerda para a bifurcação. Use 10-0 suturas monofilamento de poliamida para ligar as filiais pequenas perto da aorta. </li><li> Uma vez que a aorta do dador foi separada da veia cava inferior, saturar o recipiente com solução salina, cobrir a cavidade exposta com gaze humedecida e definir o doador de lado para uma área estéril. Verifique o status do doador (a função respiratória e cardiovascular, e profundidade da anestesia) a cada 15 minutos. Começar a operar no destinatário, isolando a aorta como descrito abaixo (Passos 2.2.1 a 2.2.7). </li><li> Uma vez que a aorta do receptor foi separado do IVC e anular, devolver o dador sob o microscópio. Braçadeira transversal (proximal e distal ao segmento de interesse) a aorta do doador, aproximadamente 5 mm, com dois grampos microvasculares 4 milímetros. </li><li> Usando a microtesoura Vannas-Tübingen,transecção um segmento de enxerto pequeno (3-4 mm de comprimento) da aorta abdominal. </li><li> Usando uma agulha de 25 G 5/8 ligado a uma seringa, lave a aorta excisado com solução heparinizada (U / ml 100) solução salina. Assegurar a ponta da agulha não entra em contacto com o vaso. </li><li> Aorta lugar em heparina (100 U / ml) de solução salina no gelo e reserve. Embora ainda sob anestesia profunda, solte os grampos microvasculares. Euthanize o doador por sangria. </li><li> Implantar o navio dador dentro de 30 min de excisão. Embora seja possível utilizar um recipiente dador para vários receptores através da excisão de um comprimento maior da aorta, manter o tempo de isquemia para menos de 30 min. </li></ol></li><li> Operação Destinatário <ol><li> Manter uma técnica asséptica durante toda a operação, como na operação dador. </li><li> Posicione o mouse destinatário em decúbito dorsal em uma placa de Plexiglas fina envolvido com cortina estéril sob o microscópio cirúrgico na ampliação 8-30X. </li><li> After garantia de anestesia adequada, prosseguir com a cirurgia quando o animal não apresenta reflexo de retirada. </li><li> Com uma tesoura estéril, fazer uma única linha média inferior incisão abdominal longitudinal, a partir do púbis ao processo xifóide. </li><li> Usando um pequeno afastador, abra a parede abdominal para expor a cavidade. </li><li> Usando algodão estéril derrubado aplicadores, retrair delicadamente os intestinos superiormente para o animal de esquerda e cobrir com gaze umedecida com solução salina. Mova os órgãos reprodutivos inferiormente e localize a aorta infra-renal e da VCI. Humedecer os tecidos expostos periodicamente com solução salina. </li><li> Separa-se a aorta a partir da veia cava inferior, a partir do nível da artéria renal esquerda para a bifurcação. Se necessário, use 10-0 suturas monofilamento poliamida para ligar as filiais pequenas perto da aorta. </li><li> Braçadeira transversal (proximal e distal ao segmento de interesse) na aorta, cerca de 5 mm entre si, com dois grampos microvasculares 4 milímetros. </li><li> Usando os microtesouras Vannas-Tubingen, fazer uma única aortotomy horizontal e ressecção de um pequeno segmento (não mais do que 0,5 mm) da aorta abdominal para acomodar o doador do enxerto aórtico. </li><li> Lave a aorta retirado com solução heparinizada (U / ml 100) salina. O doador do enxerto aórtico deve ser de comprimento apropriado para ligar as extremidades da aorta seccionados do receptor. </li><li> Coloque a prótese aórtica doador na posição ortotópica e anastomose extremidade do enxerto do doador para a extremidade do receptor, correspondentes a respectiva orientação anatómica do enxerto com o do receptor. </li><li> Gentilmente segure a túnica externa do navio e everter-lo um pouco usando a pinça No.5 médicos. Usando fórceps, conduzir a agulha acoplada ao monofilamento de sutura 10-0 poliamida através de toda a espessura da parede do vaso, a fim de garantir o doador do enxerto aórtico para o vaso ressecado do destinatário. Tome cuidado para garantir que a abertura navio não está fechada devido tO costura inadvertida da parede do fundo do recipiente. </li><li> Para pontos contínuos, colocar suturas de ancoragem em 9:00 em ambas as suas extremidades superior e inferior do enxerto. Começando na extremidade superior do enxerto a partir de 03:00, anastomose nas extremidades ressecados com duas suturas de funcionamento e proteger o fio de sutura à sutura estadia. <ol><li> Virar o enxerto mais e continuar a sutura corrida para dorsal parte da embarcação, atendendo a sutura origem estadia. Fixe sem aplicar muita pressão sobre o navio. Repita a sutura para a anastomose inferior. Nota: As suturas interrompidas começar da mesma maneira que o fio de sutura contínua com a excepção de que o recipiente é anastomosado com três pontos separados entre as suturas de ancoragem. Tempo de anastomose é geralmente 20 min. </li></ol></li><li> Uma vez que a anastomose é completa, solte o grampo microvascular distal para permitir que o sangue flua retrógrada e verificar se há vazamento dos locais anastomosada. Se houver uma fuga, immediately coloque um ponto para fechar o site com defeito. Se não houver hemorragia nos locais, em seguida, solte a braçadeira proximal. </li><li> Examinar o transplante e verificar que não existe obstrução arterial no enxerto, e a porção proximal e distal do vaso do destinatário. Padrão de impulso vigoroso no vaso tanto do doador e do receptor é uma indicação preliminar que o sangue está fluindo livremente. Utilizando o par de fórceps, agarre cuidadosamente uma das extremidades das suturas de ancoragem e ligeiramente everter do navio para inspeccionar a parede traseira do recipiente. Nota: Não deve haver nenhum enrugamento da parede do vaso em ambas as extremidades dos sítios anastomosados. Má circulação sanguínea após a remoção das pinças é um sinal de trombose. </li><li> Usando algodão derrubou aplicadores, devolva o intestino para a cavidade abdominal. </li><li> Com o suporte de agulha Castroviejo e fórceps Graefe, feche a parede abdominal com 5-0 suturas de polipropileno usando costura contínua. Fechar a camada de pele com a mesmasuturas usando encerramento subcuticular. </li><li> Administrar Torbugesic (1 mg / kg) im imediatamente após a conclusão do transplante. </li><li> Dê imediatamente, na ordem, atipamezol (1 mg / kg), cetoprofeno (5 mg / kg) e aqueceu-se por via subcutânea solução de Ringer com lactato. </li><li> Imediatamente após a cirurgia, os ratos colocar em uma gaiola aquecida sob um cobertor de água durante a noite (12 h). Durante o período anestésico-recuperação, colocar os animais em paz em uma área desobstruída limpo e seco. Linha a gaiola (autoclavada), com toalhas de papel limpas e ajustar a temperatura do cobertor de água para aproximadamente 20 a 22 ° C. Fornecer croquetes secos e molhados ad libitum no chão da gaiola. Nota: Um componente importante dos cuidados pós-cirúrgico é a observação do animal e de intervenção apropriada, se necessário, durante a recuperação da anestesia e cirurgia. A intensidade necessária de monitorização variará com o animal e pode ser maior durante o período de recuperação anestésico imediato como compared para mais tarde na recuperação pós-operatória. </li><li> Continuamente monitorar animais que têm sofrido anestesia monitorados até que eles se recuperar completamente. O animal deve ser capaz de manter decúbito esternal sem ajuda e tem de aparecer calmo e livre de dor antes que possa ser deixado sem vigilância. </li><li> Submeter buprenorfina (0,1 mg / kg bid) e cetoprofeno (5 mg / kg SID) para um período de três dias, tanto por via subcutânea. </li><li> Monitorar cardiovascular e função respiratória, temperatura do corpo, e dor pós-operatória ou desconforto durante a recuperação da anestesia durante um mínimo de três dias. Cuidados adicionais podem ser necessárias, como a administração de analgésicos e outros medicamentos, e fluidos parenterais para minimizar a desidratação e perda de eletrólitos. </li><li> Avaliar o sucesso da cirurgia de transplante através da observação da função motora dos membros posteriores. Completo sucesso do transplante envolve o fluxo sanguíneo livre para o membro posterior e cauda, ​​que deve ser imediata após a recuperação do animai, e a recuperação completa sem paralisia dos membros traseiros, no segundo dia </li></ol></li></ol> Coleção 3. Tissue Nota: Os pontos finais pré-determinado intervalo 3-60 dias, dependendo do tipo de análise desejado e da natureza do antigénio de incompatibilidade. Geralmente, espessamento da íntima é robusta no dia 30 após o transplante através de MHC estirpes completas rato incompatíveis. <ol><li> Anestesiar o rato com injecções intraperitoneais de cetamina (100 mg / kg; 10 mg / ml) e xilazina (10 mg / kg; 1 mg / mL). Avaliar a profundidade da anestesia por beliscar a parte gorda da almofada do pé animal. Prosseguir com a cirurgia quando o animal não apresenta reflexo de retirada. </li><li> Limpar o local cirúrgico com água e terminando com 70% de álcool. </li><li> Colocar o animal em decúbito dorsal em uma bandeja forrada com almofada absorvente. </li><li> Abra a cavidade abdominal através de uma incisão longitudinal grande linha média. Coloque um afastador de auto-retenção para expor a cavidade, a uma VCId aorta abdominal. </li><li> Delicadamente separar o segmento da aorta transplantado doador do IVC vizinha usando um par de fórceps 5 No. médica. Tenha especial cuidado para não retirar o adventícia do vaso transplantado. </li><li> Expor a cavidade torácica, cortando através das nervuras ao longo de ambos os lados da coluna vertebral torácica todo o caminho até à entrada torácica. Reflectem a parede anterior do tórax superiormente para expor o pericárdio e garantir a caixa torácica com um par de pinça hemostática. </li><li> Uma vez que o coração é exposto, inserir uma agulha 25 G 5/8 (ligada a uma seringa) para o ventrículo esquerdo e nivelada com 0,1 ml de solução salina heparinizada (100 U / mL). </li><li> Utilizando um par de tesouras, remover a aurícula direita para permitir que o sangue, soro fisiológico heparinizado, e o fixador para deixar o corpo durante a perfusão. Perfundir o animal com 5 ml de paraformaldeído a 4% ou até que o fluido corre claro. Remover do coração para assegurar a eutanásia. </li><li> Excise transplantado segmento de vaso e mergulhar no parágrafo 4%formaldeído para não mais do que uma hora. Defina o navio transplantadas em outubro (temperatura de corte óptima) da matriz e congelamento flash. Seção do navio sob um criostato fixado em 8 hum espessura. Seções mancha com Hematoxilina e Eosina e / ou Verhoeff-van Gieson (van Gieson) mancha elástica. </li></ol> 4. Análise morfológica de enxertos Nota: TA é caracterizada por espessamento da camada íntima 13. Neste modelo, o espessamento da íntima e uma consequente redução no tamanho do lúmen são um reflexo da gravidade da lesão vascular mediada imunologicamente. Syngraft controlos são utilizados para determinar as características basais dos vasos na ausência de respostas imunitárias alogénicas. Esses controles também possibilitar a avaliação de danos arterial que ocorre como resultado do procedimento cirúrgico. Não deve haver espessamento da íntima em syngrafts. <ol><li> Para examinar o espessamento da íntima e oclusão luminal, medir a área dentro da célula endotelialcamada, lâmina interna elástica (IEL) e lâmina elástica externa (EEL) em segmentos de artérias elásticas coradas van Gieson com um software de análise de imagem. Os parâmetros a seguir podem ser utilizados para determinar as alterações arteriais reflectoras de TA. <ol><li> Medir a área da íntima absoluta: a área da lâmina elástica interna - a área dentro da camada de células endoteliais. Isso fornece uma medida absoluta de expansão da íntima, que é a marca do TA. </li><li> Medir a absoluta área medial: área dentro da lâmina elástica externa - área dentro da lâmina elástica interna. Isto fornece uma medida absoluta da degradação medial ou o crescimento, que pode ocorrer ocasionalmente, como resultado de alterações mediadas pelo sistema imunológico para esta região da parede do vaso. </li><li> Medir a área total do vaso, como a área da lâmina elástica externa. Isso proporciona uma medição de remodelagem vascular que envolve a expansão ou constrição da artéria, como resultado de dano imunológico. </li><li> Medidada íntima / Média: (a área da lâmina elástica interna - área dentro da camada de células endoteliais) / (área da lâmina elástica externa - área da lâmina elástica interna). Isto proporciona uma medida relativa da expansão da íntima e normaliza as diferenças no tamanho do vaso. </li><li> Meça o estreitamento% Luminal: [(área dentro da lâmina elástica interna - área dentro da camada de células endoteliais) / área com a lâmina elástica interna)] * 100. Isto proporciona uma medida do grau de oclusão luminal, que resulta de uma combinação de expansão e remodelação da íntima (para dentro ou para fora) da parede do vaso. </li></ol></li></ol>

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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dramatic+remodeling+of+advanced+atherosclerotic+plaques+of+the+apolipoprotein+E-deficient+mouse+in+a+novel+transplantation+model.">Dramatic remodeling of advanced atherosclerotic plaques of the apolipoprotein E-deficient mouse in a novel transplantation model.</a> Journal of vascular surgery. 34, 541-547 (2001).</li><li>Potteaux, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppressed+monocyte+recruitment+drives+macrophage+removal+from+atherosclerotic+plaques+of+Apoe-/-+mice+during+disease+regression.">Suppressed monocyte recruitment drives macrophage removal from atherosclerotic plaques of Apoe-/- mice during disease regression.</a> J Clin Invest. 121, 2025-2036 (2011).</li></ol>

Nós descrevemos um protocolo para a interposição aórtica miocárdio em ratos que é útil para estudar rejeição vascular imunomediada e TA. Este modelo pode ser usado para investigar as causas de AT, bem como o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas. Tem sido usado no passado para estabelecer um papel essencial da imunidade adaptativa, respostas de células T citotóxicas, as respostas efectoras de células T CD4 mediada por citoquinas, e danos do enxerto mediada por anticorpos em TA 14,17-21.</s...

Nos últimos 30 anos, os avanços em drogas imunossupressoras têm diminuído a rejeição do enxerto por rejeição aguda, mas a rejeição crônica permanece um desafio principal. A principal manifestação da rejeição do transplante cardíaca crônica é a arteriosclerose de transplante (TA) 1,2. Esta condição é caracterizada por hiperplasia intimai e disfunção vasomotora das artérias aloenxerto e se desenvolve como um resultado de direccionamento imunológico de células endoteliais e do músculo liso pelo sistema imune receptor. O direcionamento específico da vasculatura do enxerto devido ao reconhecimento do complexo de histocompatibilidade estrangeira peptídeo-major (MHC) é realçada pelo desenvolvimento de TA exclusivamente nas artérias do enxerto, poupando os navios de acolhimento 3. De acordo com isto é a observação de que não ocorre TA experimentalmente quando o receptor é geneticamente idêntico ao doador ou quando o receptor não tem células T e B 4. Lesão vascular mediada imunologicamente e dysfunction faz com que o desenvolvimento de espessamento da íntima e fibrose, assim como a acumulação anormal de lípidos e proteínas da MEC, em TA 5. Espessamento da íntima tende a ser concêntrica ao longo de toda a 4-6 árvore arterial. Perda do enxerto e morte geralmente ocorrem como resultado de isquemia progressiva resultante da oclusão luminal de artérias allograft 4. Em 1991, Mennander et al. 7 pioneira um modelo de interposição aórtica em ratos para modelar TA. Diversos grupos têm subsequentemente adaptado este procedimento para utilização em ratos. Neste modelo, os segmentos da aorta de aloenxerto desenvolver lesões que apresentam características comparáveis ​​às TA observada em transplantes clínicos. Isso inclui espessamento da íntima caracterizada pelo acúmulo de células musculares lisas-like e leucócitos beneficiários 7. Nos últimos 2 décadas este modelo tem sido usado para gerar importantes insights sobre os mecanismos de lesão vascular, rejeição e TA. Pode ser-nosed para analisar as questões relacionadas com as respostas imunes e vasculares durante patologia arterial. A escolha dos impactos antígeno de incompatibilidade a capacidade de abordar adequadamente essas questões. Transplante através das barreiras de MHC completos permite uma avaliação abrangente das respostas imunes que são conhecidos por serem envolvidos na rejeição de transplante de órgãos. Isso inclui o reconhecimento direto de células CD4 e CD8 T e direcionamento da política externa peptídeo-MHC apresentado por células derivadas do enxerto, CD4 indireta (e, possivelmente, CD8) reconhecimento de células T e segmentação de aloantígenos derivados do enxerto apresentados por antigénio destinatário que apresentam células e por anticorpos reconhecimento mediado de aloantigénios na superfície das células vasculares 8. No entanto, a resposta vascular à lesão em experiências de MHC desemparelhado completos pode ser diferente do que a observada clinicamente. Johnson et al., 9 revelaram que, em enxertos transplantados interposição da aorta através de uma barreira completa de MHC incompatibilidade, a maioria deas células são de origem neointimais receptor e não de origem do doador. Isto é diferente do que a observada em transplantes humanos, onde a maioria das células do músculo liso da íntima são de origem do doador 9,10. Para ter em conta esta limitação, modelos experimentais alternativos que envolvem enxerto através menores descasamentos dos antígenos de histocompatibilidade têm sido desenvolvidos que desencadeiam respostas vasculares que mais se assemelham aos observados no transplante clínico 11. Embora estes modelos alternativos permitem conclusões importantes a serem feitas sobre as respostas vasculares que impulsionam o desenvolvimento de TA, os processos imunológicos que causam rejeição vascular em antígeno de histocompatibilidade menor enxertos incompatíveis não completamente re-capitular aquelas que ocorrem no ambiente clínico. Por exemplo, antígenos de histocompatibilidade menores são reconhecidos mal por enxerto anticorpos reativos 12. Dadas as considerações acima, é importante considerar o questi patológicono a ser examinado quando se escolhe o tipo de antigénio incompatibilidade utilizado num modelo interposição aórtica. Aqui nós descrevemos um protocolo detalhado para murino enxertia interposição aórtica. Nós descrevemos enxerto de interposição entre camundongos MHC-incompatíveis completos, mas o mesmo protocolo é usado para enxerto através de outras linhagens de camundongos incompatíveis antígeno.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6J (H-2b)</td><td>Jackson Laboratories, Bar Harbour ME</td><td>Strain# 000664</td><td></td></tr><tr><td>Balb/cBYJ</td><td>Jackson Laboratories, Bar Harbour ME</td><td>Strain# 001026</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine Hydrochloride Injection USP 100 mg/ml</td><td>Ketalean</td><td>DIN 00612316</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylazine Injection 20 mg/ml</td><td>Rompum</td><td>DIN 02169592</td><td></td></tr><tr><td>Ketoprofen Injection 100 mg/ml</td><td>Anafen</td><td>DIN 01938126</td><td></td></tr><tr><td>Butorphanol Tartrate&amp;nbsp;injection 10 mg/ml</td><td>Torbugesic</td><td>DIN 008450000</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphine Injection 0.3 mg/ml</td><td>Reckitt Benckiser</td><td>B.N. 5241</td><td></td></tr><tr><td>Atipamezole hydrochloride sterile injectable solution</td><td>Antisedan</td><td>DIN 02237744</td><td></td></tr><tr><td>Heparin Sodium Injection, USP, 1,000 units/ml</td><td>McKesson Distribution</td><td>DIN 02264315</td><td></td></tr><tr><td>Tears naturale ophthalmic ointment</td><td>Alcon</td><td>DIN 02082519</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Leica</td><td>M80</td><td></td></tr><tr><td>0.9% Sodium Chloride, sterile</td><td>Baxter Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lactated Ringer&amp;rsquo;s solution, sterile</td><td>Baxter Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.9% Sodium Chloride Injection, sterile, 10 ml</td><td>Baxter Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alcohol Prep Pads</td><td>Loris</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Povidone Iodine</td><td>Betadine</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorohexidine Gluconate 4% w/v</td><td>Germi-Stat</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Black Polyamide Monofilament</td><td>AROSurgical Instruments</td><td>T4A10Q07</td><td></td></tr><tr><td>Suture, 10-0 suture, 70 microns</td><td>Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blue monofilament suture 5-0, P3 needle</td><td>Ethicon</td><td>8698G</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Syringe</td><td>BD</td><td>REF 309659</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Syringe</td><td>BD</td><td>REF 309604</td><td></td></tr><tr><td>1cc TB insulin syringe with 28 G 1/2</td><td>BD</td><td>REF 309309</td><td></td></tr><tr><td>25 G 7/8, hypodermic needle</td><td>BD</td><td>REF 305124</td><td></td></tr><tr><td>27 G 1/2, hypodermic needle</td><td>BD</td><td>REF 305109</td><td></td></tr><tr><td>Colibri Retractor- 1.5 cm spread 4 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>17000-04</td><td></td></tr><tr><td>S&amp;amp;T CAF-4 Clip applying forceps, without lock</td><td>Fine Science Tools</td><td>00072-14</td><td></td></tr><tr><td>Supergrip forceps, S&amp;amp;T</td><td>Fine Science Tools</td><td>00632-11</td><td></td></tr><tr><td>Medical No.5 forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11253-20</td><td></td></tr><tr><td>Lexer Baby Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14078-10</td><td></td></tr><tr><td>Micro Adson forceps serrated</td><td>Fine Science Tools</td><td>11018-12</td><td></td></tr><tr><td>Vannas-Tubingen microscissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>Micro clamps, b-1; 3.5mm x 1mm; 7mm length</td><td>Fine Science Tools</td><td>00396-01</td><td></td></tr><tr><td>Graefe-forceps, 10cm 1x2 teeth</td><td>Fine Science Tools</td><td>11054-10</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo with lock and tungsten jaws</td><td>Fine Science Tools</td><td>12565-14</td><td></td></tr><tr><td>Hot glass bead sterilizer</td><td>Inotech 250</td><td>IS-250 - Steri-250</td><td></td></tr><tr><td>Non-woven gauzes</td><td>Progene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cotton Tipped Applicators</td><td>Puritan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beard Trimmer</td><td>Wahl</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heating pad</td><td>Sunbeam</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mouse model of alloimmune-induced vascular rejection and transplant arteriosclerosis

Vascular rejection that leads to transplant arteriosclerosis (TA) is the leading representation of chronic heart transplant failure. In TA, the immune system of the recipient causes damage of the arterial wall and dysfunction of endothelial cells and smooth muscle cells. This triggers a pathological repair response that is characterized by intimal thickening and luminal occlusion. Understanding the mechanisms by which the immune system causes vasculature rejection and TA may inform the development of novel ways to manage graft failure. Here, we describe a mouse aortic interposition model that can be used to study the pathogenic mechanisms of vascular rejection and TA. The model involves grafting of an aortic segment from a donor animal into an allogeneic recipient. Rejection of the artery segment involves alloimmune reactions and results in arterial changes that resemble vascular rejection. The basic technical approach we describe can be used with different mouse strains and targeted interventions to answer specific questions related to vascular rejection and TA.

Neste modelo, a aorta abdominal de um rato Balb / CYJ é interposta na aorta infra-renal de um C57BL / 6 destinatário. Isto permite uma avaliação abrangente de aloimunes respostas que visam artérias aloenxerto. Lesão vascular mediada imunologicamente neste modelo inicia respostas reparadoras vasculares que culminam em espessamento da íntima, estreitamento luminal e recrutamento de células imunitárias (Figuras 1 e 2). Estes critérios, em seguida, servir como um ler-out para a gr...

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Mouse Model of Alloimmune-induced Vascular Rejection and Transplant Arteriosclerosis

We describe a protocol for aortic interposition grafting in mice. The goal of the protocol is to provide a model with which to study pathological processes and therapeutic strategies relevant to alloimmune reactions in arteries and the resultant arterial changes that contribute to organ transplant failure.

Modelo rato de rejeição vascular induzida por Aloimune e Transplante Arteriosclerose

Vascular rejection that leads to transplant arteriosclerosis (TA) is the leading representation of chronic heart transplant failure. In TA, the immune ...

mouse-model-alloimmune-induced-vascular-rejection-transplant

Research

JoVE Journal

Medicine

8.4K visualizações.  Simon Fraser University. We describe a protocol for aortic interposition grafting in mice. The goal of the protocol is to provide a model with which to study pathological processes and therapeutic strategies relevant to alloimmune reactions in arteries and the resultant arterial changes that contribute to organ transplant failure. 

Vídeo: Mouse Model of Alloimmune-induced Vascular Rejection and Transplant Arteriosclerosis

Orthotopic Aortic Transplantation: A Rat Model to Study the Development of Chronic Vasculopathy

Research models of chronic rejection are essential to investigate pathobiological and pathophysiological processes during the development of transplant vasculopathy (TVP).
The commonly used animal model for cardiovascular chronic rejection studies is the heterotopic heart transplant model performed in laboratory rodents. This model is used widely in experiments since Ono and Lindsey (3) published their technique. To analyze the findings in the blood vessels, the heart has to be sectioned and all vessels have to be measured.
Another method to investigate chronic rejection in cardiovascular questionings is the aortic transplant model (1, 2). In the orthotopic aortic transplant model, the aorta can easily be histologically evaluated (2). The PVG-to-ACI model is especially useful for CAV studies, since acute vascular rejection is not a major confounding factor and Cyclosporin A (CsA) treatment does not prevent the development of CAV, similar to what we find in the clinical setting (4). A7-day period of CsA is required in this model to prevent acute rejection and to achieve long-term survival with the development of TVP.
This model can also be used to investigate acute cellular rejection and media necrosis in xenogeneic models (5).

This video demonstrates the orthotopic aortic transplant model as a simple model to study the development of transplant vasculopathy (TVP) in rats.

Transplante ortotópico de aorta: um modelo de rato para estudar o desenvolvimento de vasculopatia crônica

Research models of chronic rejection are essential to investigate pathobiological and pathophysiological processes during the development of transplant ...

Medicina

Orthotopic Aortic Transplantation in Mice for the Study of Vascular Disease

Vascular procedures involving anastomoses in the mouse are generally thought to be difficult and highly dependent on the skill of the individual surgeon. This is largely true, but there are a number of important principles that can reduce the difficulty of these procedures and enhance reproducibility. Orthotopic aortic transplantation is an excellent procedure in which to learn these principles because it involves only two end-to-end anastomoses, but requires good suturing technique and handling of the vessels for consistent success. This procedure begins with the procurement of a length of abdominal aorta from a donor animal, followed by division of the native aorta in the recipient. The procured aorta is then placed between the divided ends of the recipient aorta and sutured into place using end-to-end anastomoses. To accomplish this objective successfully requires a high degree of concentration, good tools, a steady hand, and an appreciation of how easily the vasculature of a mouse can be damaged, resulting in thrombosis. Learning these important principles is what occupies most of the beginner's time when learning microsurgery in small rodents. Throughout this protocol, we refer to these important points. This model can be used to study vascular disease in a variety of different experimental systems1-8. In the context shown here, it is most often used for the study of post-transplant vascular disease, a common long-term complication of solid organ transplantation in which intimal hyperplasia occurs within the allograft. The primary advantage of the model is that it facilitates quantitative morphometric analyses and the transplanted vessel lies contiguous to the endogenous vessel, which can serve as an additional control9. The technique shown here is most often used for mice weighing 18-25 grams. We have accumulated most of our experience using the C57BL/6J, BALB/cJ, and C3H/HeJ strains.

We describe a technique in which a section of the abdominal aorta from a mouse is transplanted orthotopically to just below the renal arteries in an allogeneic or syngeneic recipient. This technique can be useful in studies in which transplantation of large arteries of uniform size is deemed advantageous.

Transplante ortotópico de aorta em camundongos para o Estudo da Doença Vascular

Vascular procedures involving anastomoses in the mouse are generally thought to be difficult and highly dependent on the skill of the individual surgeon. ...

Mouse Models for Graft Arteriosclerosis

Graft arteriosclerois (GA), also called allograft vasculopathy, is a pathologic lesion that develops over months to years in transplanted organs characterized by diffuse, circumferential stenosis of the entire graft vascular tree. The most critical component of GA pathogenesis is the proliferation of smooth muscle-like cells within the intima. When a human coronary artery segment is interposed into the infra-renal aortae of immunodeficient mice, the intimas could be expand in response to adoptively transferred human T cells allogeneic to the artery donor or exogenous human IFN-&gamma; in the absence of human T cells. Interposition of a mouse aorta from one strain into another mouse strain recipient is limited as a model for chronic rejection in humans because the acute cell-mediated rejection response in this mouse model completely eliminates all donor-derived vascular cells from the graft within two-three weeks. We have recently developed two new mouse models to circumvent these problems. The first model involves interposition of a vessel segment from a male mouse into a female recipient of the same inbred strain (C57BL/6J). Graft rejection in this case is directed only against minor histocompatibility antigens encoded by the Y chromosome (present in the male but not the female) and the rejection response that ensues is sufficiently indolent to preserve donor-derived smooth muscle cells for several weeks. The second model involves interposing an artery segment from a wild type C57BL/6J mouse donor into a host mouse of the same strain and gender that lacks the receptor for IFN-&gamma; followed by administration of mouse IFN-&gamma; (delivered via infection of the mouse liver with an adenoviral vector. There is no rejection in this case as both donor and recipient mice are of the same strain and gender but donor smooth muscle cells proliferate in response to the cytokine while host-derived cells, lacking receptor for this cytokine, are unresponsive. By backcrossing additional genetic changes into the vessel donor, both models can be used to assess the effect of specific genes on GA progression. Here, we describe detailed protocols for our mouse GA models.

We describe protocols for our mouse graft arteriosclerois (GA) models which involve interposition of a mouse vessel segment into a recipient of the same inbred strain. By backcrossing additional genetic changes into the vessel donor, the model can assess the effect of specific genes on GA.

Os modelos de mouse para Arteriosclerose Graft

Graft arteriosclerois (GA),  also called allograft vasculopathy, is a pathologic lesion that develops over  months to years in transplanted organs ...

Mouse Kidney Transplantation: Models of Allograft Rejection

Rejection of the transplanted kidney in humans is still a major cause of morbidity and mortality. The mouse model of renal transplantation closely replicates both the technical and pathological processes that occur in human renal transplantation. Although mouse models of allogeneic rejection in organs other than the kidney exist, and are more technically feasible, there is evidence that different organs elicit disparate rejection modes and dynamics, for instance the time course of rejection in cardiac and renal allograft differs significantly in certain strain combinations. This model is an attractive tool for many reasons despite its technical challenges. As inbred mouse strain haplotypes are well characterized it is possible to choose donor and recipient combinations to model acute allograft rejection by transplanting across MHC class I and II loci. Conversely by transplanting between strains with similar haplotypes a chronic process can be elicited were the allograft kidney develops interstitial fibrosis and tubular atrophy. We have modified the surgical technique to reduce operating time and improve ease of surgery, however a learning curve still needs to be overcome in order to faithfully replicate the model. This study will provide key points in the surgical procedure and aid the process of establishing this technique.

Here, we present a protocol to study the immunology of rejection. The surgical model presented reports a short operating time and a concise technique. Depending on the donor-recipient strain combination, the transplanted kidney may develop acute cellular rejection or chronic allograft damage, defined by interstitial fibrosis and tubular atrophy.

Rato Transplante Renal: Modelos de rejeição de enxertos

Rejection of the transplanted kidney in humans is still a major cause of morbidity and mortality. The mouse model of renal transplantation closely ...

In Vitro and In Vivo Assessment of T, B and Myeloid Cells Suppressive Activity and Humoral Responses from Transplant Recipients

The main concern in transplantation is to achieve specific tolerance through induction of regulatory cells. The understanding of tolerance mechanisms requires reliable models. Here, we describe models of tolerance to cardiac allograft in rat, induced by blockade of costimulation signals or by upregulation of immunoregulatory molecules through gene transfer. Each of these models allowed in vivo generation of regulatory cells such as regulatory T cells (Tregs), regulatory B cells (Bregs) or regulatory myeloid cells (RegMCs). In this manuscript, we describe two complementary protocols that have been used to identify and define in vitro and in vivo regulatory cell activity to determine their responsibility in tolerance induction and maintenance. First, an in vitro suppressive assay allowed rapid identification of cells with suppressive capacity on effector immune responses in a dose dependent manner, and can be used for further analysis such as cytokine measurement or cytotoxicity. Second, the adoptive transfer of cells from a tolerant treated recipient to a newly irradiated grafted recipient, highlighted the tolerogenic properties of these cells in controlling graft directed immune responses and/or converting new regulatory cells (termed infectious tolerance). These methods are not restricted to cells with known phenotypic markers and can be extended to any cell population. Furthermore, donor directed allospecificity of regulatory cells (an important goal in the field) can be assessed by using third party donor cells or graft either in vitro or in vivo. Finally, to determine the specific tolerogenic capacity of these regulatory cells, we provide protocols to assess the humoral anti-donor antibody responses and the capacity of the recipient to develop humoral responses against new or former known antigens. The models of tolerance described can be used to further characterize regulatory cells, to identify new biomarkers, and immunoregulatory molecules, and are adaptable to other transplantation models or autoimmune diseases in rodent or human.

In Vitro and In Vivo Assessment of T, B and Myeloid Cells Suppressive Activity and Humoral Responses from Transplant Recipients

Here, we present a protocol to induce tolerance in transplantation, and assess in vitro and in vivo the suppressive capacity of distinct cell subsets from the recipient and the immune status of the recipient toward donor or exogenous antigens.

In Vitro e In Vivo de avaliação da atividade supressiva, T, B e células mieloides e respostas Humoral de pacientes transplantados

The main concern in transplantation is to achieve specific tolerance through induction of regulatory cells. The understanding of tolerance mechanisms ...

Imunologia e Infecção

A Novel Microsurgical Model for Heterotopic, En Bloc Chest Wall, Thymus, and Heart Transplantation in Mice

Exploration of novel strategies in organ transplantation to prolong allograft survival and minimizing the need for long-term maintenance immunosuppression must be pursued. Employing vascularized bone marrow transplantation and co-transplantation of the thymus have shown promise in this regard in various animal models.1-11 Vascularized bone marrow transplantation allows for the uninterrupted transfer of donor bone marrow cells within the preserved donor microenvironment, and the incorporation of thymus tissue with vascularized bone marrow transplantation has shown to increase T-cell chimerism ultimately playing a supportive role in the induction of immune regulation. The combination of solid organ and vascularized composite allotransplantation can uniquely combine these strategies in the form of a novel transplant model. Murine models serve as an excellent paradigm to explore the mechanisms of acute and chronic rejection, chimerism, and tolerance induction, thus providing the foundation to propagate superior allograft survival strategies for larger animal models and future clinical application. Herein, we developed a novel heterotopic en bloc chest wall, thymus, and heart transplant model in mice using a cervical non-suture cuff technique. The experience in syngeneic and allogeneic transplant settings is described for future broader immunological investigations via an instructional manuscript and video supplement.

To study combined solid organ and vascularized composite allotransplantation, we describe a novel heterotopic en bloc chest wall, thymus, and heart transplant model in mice using a cervical non-suture cuff technique.

A Microsurgical Modelo Novel para heterotópico, em bloco da parede torácica, Thymus, e Transplante Cardíaco em Ratos

Exploration of novel strategies in organ transplantation to prolong allograft survival and minimizing the need for long-term maintenance immunosuppression ...

Orthotopic Hind Limb Transplantation in the Mouse

In vivo animal model systems, and in particular mouse models, have evolved into powerful and versatile scientific tools indispensable to basic and translational research in the field of transplantation medicine. A vast array of reagents is available exclusively in this setting, including mono- and polyclonal antibodies for both diagnostic and interventional applications. In addition, a vast number of genotyped, inbred, transgenic, and knock out strains allow detailed investigation of the individual contributions of humoral and cellular components to the complex interplay of an immune response and make the mouse the gold standard for immunological research. 
Vascularized Composite Allotransplantation (VCA) delineates a novel field of transplantation using allografts to replace "like with like" in patients suffering traumatic or congenital tissue loss. This surgical methodological protocol shows the use of a non-suture cuff technique for super-microvascular anastomosis in an orthotopic mouse hind limb transplantation model. The model specifically allows for comparison between established paradigms in solid organ transplantation with a novel form of transplants consisting of various different tissue components. Uniquely, this model allows for the transplantation of a viable vascularized bone marrow compartment and niche that have the potential to exert a beneficial effect on the balance of immune acceptance and rejection. This technique provides a tool to investigate alloantigen recognition and allograft rejection and acceptance, as well as enables the pursuit of functional nerve regeneration studies to further advance this novel field of transplantation.

This novel model for orthotopic hind limb transplantation in the mouse, applying a non-suture cuff technique for super-microvascular anastomosis, provides a powerful tool for in&#160;vivo mechanistic immunological research related to vascularized composite allotransplantation (VCA).

Ortotópico Hind Limb Transplantation no mouse

In vivo animal model systems, and in particular mouse models, have evolved into powerful and versatile scientific tools indispensable to basic and ...

Modified Heterotopic Hindlimb Osteomyocutaneous Flap Model in the Rat for Translational Vascularized Composite Allotransplantation Research

Vascularized composite allotransplantation (VCA) is a relatively new field in the reconstructive surgery. Clinical achievements in human VCA include hand and face transplants and, more recently, abdominal wall, uterus, and urogenital transplants. Functional outcomes have exceeded initial expectations, and most recipients enjoy an improved quality of life. However, as clinical experience accumulates, chronic rejection and complications from the immunosuppression must be addressed. In many cases where grafts have failed, the causative pathology has been ischemic vasculopathy. <span style="font-size: 11pt; line-height: 115%; font-family: Arial, sans-serif; color: rgb(41, 43, 49); background-image: initial; background-position: initial; background-size: initial; background-repeat: initial; background-attachment: initial; background-origin: initial; background-clip: initial;">The biological mechanisms of the acute and chronic rejection associated with VCA, especially ischemic vasculopathy, are important areas of research. However, due to the very small number of VCA patients, the evaluation of proposed mechanisms is better addressed in an experimental model. Multiple groups have used animal models to address some of the relevant unsolved questions in VCA rejection and vasculopathy. Several model designs involving a variety of species are described in the literature. Here we present a reproducible model of VCA heterotopic hindlimb osteomyocutaneous flap in the rat that can be utilized for translational VCA research. This model allows for the serial evaluation of the graft, including biopsies and different imaging modalities, while maintaining a low level of morbidity.

Vascularized composite allograft offers life-altering benefits to transplant recipients, but the biological causes of graft rejection and vasculopathy remain poorly understood. The rodent surgical model presented here offers a reproducible, clinically relevant model of transplantation, allowing researchers to evaluate rejection events and potential therapeutic strategies to prevent their occurrence.

Modelo Osteomyocutaneous Heterotopic modificado da aleta do Hindmembro no rato para a pesquisa de Allotransplante composta Vascularized translacional

Vascularized composite allotransplantation (VCA) is a relatively new field in the reconstructive surgery. Clinical achievements in human VCA include hand ...

Murine Cervical Aortic Transplantation Model using a Modified Non-Suture Cuff Technique

With the introduction of powerful immunosuppressive protocols, distinct advances are possible in the prevention and therapy of acute rejection episodes. However, only minor improvement in the long-term results of transplanted solid organs could be observed over the past decades. In this context, chronic allograft vasculopathy (CAV) still represents the leading cause of late organ failure in cardiac, renal and pulmonary transplantation.
Thus far, the underlying pathogenesis of CAV development remains unclear, explaining why effective treatment strategies are presently missing and emphasizing a need for relevant experimental models in order to study the underlying pathophysiology leading to CAV formation. The following protocol describes a murine heterotopic cervical aortic transplantation model using a modified non-suture cuff technique. In this technique, a segment of the thoracic aorta is interpositioned in the right common carotid artery. With the use of the non-suture cuff technique, an easy to learn and reproducible model can be established, minimizing the possible heterogeneity of sutured vascular micro anastomoses.

Here, we present a protocol of heterotopic aortic transplantation in mice using the non-suture cuff technique in a cervical murine model. This model can be used to study the underlying pathology of chronic allograft vasculopathy (CAV) and can help evaluate new therapeutic agents in order to prevent its formation.

Murine Modelo de Transplante de Aorta Cervical usando uma técnica de manguito não sutura modificada

With the introduction of powerful immunosuppressive protocols, distinct advances are possible in the prevention and therapy of acute rejection episodes. ...

A Rat Orthotopic Renal Transplantation Model for Renal Allograft Rejection

Renal allograft rejection limits the long-term survival of patients after renal transplantation. Rat orthotopic renal transplantation is an essential model to investigate the mechanism of renal allograft rejection in pre-clinical studies and could aid in the development of novel approaches to improve the long-term survival of renal allografts. Donor kidney implantation in rat orthotopic renal transplantation is commonly performed by end-to-side anastomosis to recipients' aorta and inferior vena cava. In this model, the donor's kidney was implanted using end-to-end anastomosis to the recipients' renal artery and renal vein. The donor's ureter was anastomosed to the recipient's bladder in an end-to-side 'tunnel' method. This model contributes to better healing of ureter-bladder anastomosis and increases the recipients' survival by avoiding interference with blood supply and venous reflux of the lower body. This model can be used to investigate the mechanisms of acute and chronic immune and pathologic rejection of renal allografts. Here, the study describes the detailed protocols of this orthotopic renal transplantation between rats.

The rat orthotopic renal transplantation model contributes to investigating the mechanism of renal allograft rejection. The current model increases the recipients' survival without interference with blood supply and venous reflux of the lower body using an end-to-end anastomosis of kidney implantation and an end-to-side "tunnel" method of ureter-bladder anastomosis.

Um modelo de transplante renal ortotópico de rato para rejeição de aoenerxerto renal

Renal allograft rejection limits the long-term survival of patients after renal transplantation. Rat orthotopic renal transplantation is an essential ...