Este trabalho foi financiado por doações dos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde e Heart and Stroke Foundation of BC &amp; Yukon (JCC).

Todos os protocolos deste estudo foram revisados ​​e aprovados pelo comitê de ética de cuidados de animais Simon Fraser University. Use Balb / CYJ (H2 d) camundongos doadores e camundongos C57BL / 6 (H2 b) beneficiários para analisar reações alogênicos. Os ratos são utilizados em experiências, com idades entre 8 a 12 semanas. Use camundongos ou femininos ou masculinos. Controlos singeneicos consistem de segmentos de aorta de ratinhos C57BL / 6 dadores em receptores C57BL / 6. 1. doador e receptor Preparação Nota: Tanto o dador eo receptor são anestesiados e preparados antes da cirurgia para minimizar a isquemia do enxerto. Anestésicos injectáveis ​​são usados ​​no protocolo para evitar a obstrução do animal por equipamentos necessários para a entrega de anestésicos inalados. No entanto, se desejado, anestésico inalatório é uma alternativa adequada. A partir da injecção inicial de os anestésicos, todo o procedimento leva cerca de 90 minutos a completar. Tempo de isquemia do enxerto é menos than 30 min. <ol><li> Anestesiar o rato com injecções intraperitoneais de cetamina (100 mg / kg; 10 mg / ml) e xilazina (10 mg / kg; 1 mg / mL). O rato vai ser sedado dentro de 10 a 15 min. Avaliar a profundidade da anestesia por beliscar a parte gorda da almofada do pé animal. Administrar 1/3 da dose original do cocktail de anestésico, conforme necessário, até que o animal não apresentam reflexo de retirada. Monitorar a freqüência respiratória de perto depois de cada cocktail é administrada. Durante a cirurgia, avaliar o nível de anestesia a cada 15 min, apertando a parede abdominal anterior com um par de pinças. Os ratos devem permanecem profundamente anestesiados por 60 a 90 min. </li><li> Lubrifique os olhos do rato com uma pomada oftálmica para evitar a secura sob anestesia. </li><li> Raspar o cabelo tão perto da pele quanto possível sobre a região ventral abdominal do meio-tórax ao púbis. Tenha especial cuidado para não nick qualquer pele. Não utilizar creme depilatório, pois pode ser absorvida into da pele e pode ser inflamatória. </li><li> Colocar o animal em decúbito dorsal sobre uma toalha sobre a mesa de aquecimento ou pad. </li><li> Limpe o local da cirurgia com uma esfoliação preliminar com 2% de cloro. Prepare uma grande área de trabalho para maximizar o campo cirúrgico. Iniciar a esfregar no centro do local cirúrgico e mover-se para o exterior de uma forma linear ou circular. Descarte a gaze. Repita este procedimento pelo menos cinco vezes mais. Aplique uma compressa embebida em álcool prep para a mesma área. Uma vez que o álcool é seco, prepare a área limpa com solução Betadine e cortina com gaze estéril. </li></ol> 2. End-to-end Anastomosis Procedimento <ol><li> Doador de Operação <ol><li> Manter uma técnica asséptica durante toda a operação. Limpe todas as superfícies da bancada e mesa cirúrgica com solução de 0,5% de peróxido de hidrogênio acelerado antes da utilização. Enrole e autoclave todos os instrumentos, gazes cirúrgicas, cortinas e roupas antes de usar. Verifique a esterilidade dos instrumentos com um vaportira indicadora esterilizador colocados em cada pacote. Luvas cirúrgicas estéreis são utilizados e eliminados entre as cirurgias. Por várias cirurgias, esterilizar os instrumentos cirúrgicos entre os usos com o esterilizador talão de vidro quente. </li><li> Posicione o mouse doador em decúbito dorsal em uma placa de Plexiglas fina limpa envolvida com cortina estéril sob o microscópio cirúrgico na ampliação 8-30X. </li><li> Depois de garantir anestesia cirúrgica adequada, conforme descrito no ponto 1.1, proceder com a cirurgia. </li><li> Com uma tesoura estéril, fazer uma única linha média inferior incisão abdominal longitudinal, a partir do púbis ao processo xifóide. </li><li> Usando um pequeno afastador, abra a parede abdominal para expor a cavidade. </li><li> Usando algodão estéril derrubado aplicadores, retrair delicadamente os intestinos superiormente para o animal de esquerda e cobrir com gaze umedecida com solução salina. Mova os órgãos reprodutivos inferiormente e localize a aorta infra-renal e veia cava inferior (VCI). Moisdez os tecidos expostos periodicamente com solução salina. </li><li> Usando os No. médico 5 fórceps, separar a aorta a partir da VCI, a partir do nível da artéria renal esquerda para a bifurcação. Use 10-0 suturas monofilamento de poliamida para ligar as filiais pequenas perto da aorta. </li><li> Uma vez que a aorta do dador foi separada da veia cava inferior, saturar o recipiente com solução salina, cobrir a cavidade exposta com gaze humedecida e definir o doador de lado para uma área estéril. Verifique o status do doador (a função respiratória e cardiovascular, e profundidade da anestesia) a cada 15 minutos. Começar a operar no destinatário, isolando a aorta como descrito abaixo (Passos 2.2.1 a 2.2.7). </li><li> Uma vez que a aorta do receptor foi separado do IVC e anular, devolver o dador sob o microscópio. Braçadeira transversal (proximal e distal ao segmento de interesse) a aorta do doador, aproximadamente 5 mm, com dois grampos microvasculares 4 milímetros. </li><li> Usando a microtesoura Vannas-Tübingen,transecção um segmento de enxerto pequeno (3-4 mm de comprimento) da aorta abdominal. </li><li> Usando uma agulha de 25 G 5/8 ligado a uma seringa, lave a aorta excisado com solução heparinizada (U / ml 100) solução salina. Assegurar a ponta da agulha não entra em contacto com o vaso. </li><li> Aorta lugar em heparina (100 U / ml) de solução salina no gelo e reserve. Embora ainda sob anestesia profunda, solte os grampos microvasculares. Euthanize o doador por sangria. </li><li> Implantar o navio dador dentro de 30 min de excisão. Embora seja possível utilizar um recipiente dador para vários receptores através da excisão de um comprimento maior da aorta, manter o tempo de isquemia para menos de 30 min. </li></ol></li><li> Operação Destinatário <ol><li> Manter uma técnica asséptica durante toda a operação, como na operação dador. </li><li> Posicione o mouse destinatário em decúbito dorsal em uma placa de Plexiglas fina envolvido com cortina estéril sob o microscópio cirúrgico na ampliação 8-30X. </li><li> After garantia de anestesia adequada, prosseguir com a cirurgia quando o animal não apresenta reflexo de retirada. </li><li> Com uma tesoura estéril, fazer uma única linha média inferior incisão abdominal longitudinal, a partir do púbis ao processo xifóide. </li><li> Usando um pequeno afastador, abra a parede abdominal para expor a cavidade. </li><li> Usando algodão estéril derrubado aplicadores, retrair delicadamente os intestinos superiormente para o animal de esquerda e cobrir com gaze umedecida com solução salina. Mova os órgãos reprodutivos inferiormente e localize a aorta infra-renal e da VCI. Humedecer os tecidos expostos periodicamente com solução salina. </li><li> Separa-se a aorta a partir da veia cava inferior, a partir do nível da artéria renal esquerda para a bifurcação. Se necessário, use 10-0 suturas monofilamento poliamida para ligar as filiais pequenas perto da aorta. </li><li> Braçadeira transversal (proximal e distal ao segmento de interesse) na aorta, cerca de 5 mm entre si, com dois grampos microvasculares 4 milímetros. </li><li> Usando os microtesouras Vannas-Tubingen, fazer uma única aortotomy horizontal e ressecção de um pequeno segmento (não mais do que 0,5 mm) da aorta abdominal para acomodar o doador do enxerto aórtico. </li><li> Lave a aorta retirado com solução heparinizada (U / ml 100) salina. O doador do enxerto aórtico deve ser de comprimento apropriado para ligar as extremidades da aorta seccionados do receptor. </li><li> Coloque a prótese aórtica doador na posição ortotópica e anastomose extremidade do enxerto do doador para a extremidade do receptor, correspondentes a respectiva orientação anatómica do enxerto com o do receptor. </li><li> Gentilmente segure a túnica externa do navio e everter-lo um pouco usando a pinça No.5 médicos. Usando fórceps, conduzir a agulha acoplada ao monofilamento de sutura 10-0 poliamida através de toda a espessura da parede do vaso, a fim de garantir o doador do enxerto aórtico para o vaso ressecado do destinatário. Tome cuidado para garantir que a abertura navio não está fechada devido tO costura inadvertida da parede do fundo do recipiente. </li><li> Para pontos contínuos, colocar suturas de ancoragem em 9:00 em ambas as suas extremidades superior e inferior do enxerto. Começando na extremidade superior do enxerto a partir de 03:00, anastomose nas extremidades ressecados com duas suturas de funcionamento e proteger o fio de sutura à sutura estadia. <ol><li> Virar o enxerto mais e continuar a sutura corrida para dorsal parte da embarcação, atendendo a sutura origem estadia. Fixe sem aplicar muita pressão sobre o navio. Repita a sutura para a anastomose inferior. Nota: As suturas interrompidas começar da mesma maneira que o fio de sutura contínua com a excepção de que o recipiente é anastomosado com três pontos separados entre as suturas de ancoragem. Tempo de anastomose é geralmente 20 min. </li></ol></li><li> Uma vez que a anastomose é completa, solte o grampo microvascular distal para permitir que o sangue flua retrógrada e verificar se há vazamento dos locais anastomosada. Se houver uma fuga, immediately coloque um ponto para fechar o site com defeito. Se não houver hemorragia nos locais, em seguida, solte a braçadeira proximal. </li><li> Examinar o transplante e verificar que não existe obstrução arterial no enxerto, e a porção proximal e distal do vaso do destinatário. Padrão de impulso vigoroso no vaso tanto do doador e do receptor é uma indicação preliminar que o sangue está fluindo livremente. Utilizando o par de fórceps, agarre cuidadosamente uma das extremidades das suturas de ancoragem e ligeiramente everter do navio para inspeccionar a parede traseira do recipiente. Nota: Não deve haver nenhum enrugamento da parede do vaso em ambas as extremidades dos sítios anastomosados. Má circulação sanguínea após a remoção das pinças é um sinal de trombose. </li><li> Usando algodão derrubou aplicadores, devolva o intestino para a cavidade abdominal. </li><li> Com o suporte de agulha Castroviejo e fórceps Graefe, feche a parede abdominal com 5-0 suturas de polipropileno usando costura contínua. Fechar a camada de pele com a mesmasuturas usando encerramento subcuticular. </li><li> Administrar Torbugesic (1 mg / kg) im imediatamente após a conclusão do transplante. </li><li> Dê imediatamente, na ordem, atipamezol (1 mg / kg), cetoprofeno (5 mg / kg) e aqueceu-se por via subcutânea solução de Ringer com lactato. </li><li> Imediatamente após a cirurgia, os ratos colocar em uma gaiola aquecida sob um cobertor de água durante a noite (12 h). Durante o período anestésico-recuperação, colocar os animais em paz em uma área desobstruída limpo e seco. Linha a gaiola (autoclavada), com toalhas de papel limpas e ajustar a temperatura do cobertor de água para aproximadamente 20 a 22 ° C. Fornecer croquetes secos e molhados ad libitum no chão da gaiola. Nota: Um componente importante dos cuidados pós-cirúrgico é a observação do animal e de intervenção apropriada, se necessário, durante a recuperação da anestesia e cirurgia. A intensidade necessária de monitorização variará com o animal e pode ser maior durante o período de recuperação anestésico imediato como compared para mais tarde na recuperação pós-operatória. </li><li> Continuamente monitorar animais que têm sofrido anestesia monitorados até que eles se recuperar completamente. O animal deve ser capaz de manter decúbito esternal sem ajuda e tem de aparecer calmo e livre de dor antes que possa ser deixado sem vigilância. </li><li> Submeter buprenorfina (0,1 mg / kg bid) e cetoprofeno (5 mg / kg SID) para um período de três dias, tanto por via subcutânea. </li><li> Monitorar cardiovascular e função respiratória, temperatura do corpo, e dor pós-operatória ou desconforto durante a recuperação da anestesia durante um mínimo de três dias. Cuidados adicionais podem ser necessárias, como a administração de analgésicos e outros medicamentos, e fluidos parenterais para minimizar a desidratação e perda de eletrólitos. </li><li> Avaliar o sucesso da cirurgia de transplante através da observação da função motora dos membros posteriores. Completo sucesso do transplante envolve o fluxo sanguíneo livre para o membro posterior e cauda, ​​que deve ser imediata após a recuperação do animai, e a recuperação completa sem paralisia dos membros traseiros, no segundo dia </li></ol></li></ol> Coleção 3. Tissue Nota: Os pontos finais pré-determinado intervalo 3-60 dias, dependendo do tipo de análise desejado e da natureza do antigénio de incompatibilidade. Geralmente, espessamento da íntima é robusta no dia 30 após o transplante através de MHC estirpes completas rato incompatíveis. <ol><li> Anestesiar o rato com injecções intraperitoneais de cetamina (100 mg / kg; 10 mg / ml) e xilazina (10 mg / kg; 1 mg / mL). Avaliar a profundidade da anestesia por beliscar a parte gorda da almofada do pé animal. Prosseguir com a cirurgia quando o animal não apresenta reflexo de retirada. </li><li> Limpar o local cirúrgico com água e terminando com 70% de álcool. </li><li> Colocar o animal em decúbito dorsal em uma bandeja forrada com almofada absorvente. </li><li> Abra a cavidade abdominal através de uma incisão longitudinal grande linha média. Coloque um afastador de auto-retenção para expor a cavidade, a uma VCId aorta abdominal. </li><li> Delicadamente separar o segmento da aorta transplantado doador do IVC vizinha usando um par de fórceps 5 No. médica. Tenha especial cuidado para não retirar o adventícia do vaso transplantado. </li><li> Expor a cavidade torácica, cortando através das nervuras ao longo de ambos os lados da coluna vertebral torácica todo o caminho até à entrada torácica. Reflectem a parede anterior do tórax superiormente para expor o pericárdio e garantir a caixa torácica com um par de pinça hemostática. </li><li> Uma vez que o coração é exposto, inserir uma agulha 25 G 5/8 (ligada a uma seringa) para o ventrículo esquerdo e nivelada com 0,1 ml de solução salina heparinizada (100 U / mL). </li><li> Utilizando um par de tesouras, remover a aurícula direita para permitir que o sangue, soro fisiológico heparinizado, e o fixador para deixar o corpo durante a perfusão. Perfundir o animal com 5 ml de paraformaldeído a 4% ou até que o fluido corre claro. Remover do coração para assegurar a eutanásia. </li><li> Excise transplantado segmento de vaso e mergulhar no parágrafo 4%formaldeído para não mais do que uma hora. Defina o navio transplantadas em outubro (temperatura de corte óptima) da matriz e congelamento flash. Seção do navio sob um criostato fixado em 8 hum espessura. Seções mancha com Hematoxilina e Eosina e / ou Verhoeff-van Gieson (van Gieson) mancha elástica. </li></ol> 4. Análise morfológica de enxertos Nota: TA é caracterizada por espessamento da camada íntima 13. Neste modelo, o espessamento da íntima e uma consequente redução no tamanho do lúmen são um reflexo da gravidade da lesão vascular mediada imunologicamente. Syngraft controlos são utilizados para determinar as características basais dos vasos na ausência de respostas imunitárias alogénicas. Esses controles também possibilitar a avaliação de danos arterial que ocorre como resultado do procedimento cirúrgico. Não deve haver espessamento da íntima em syngrafts. <ol><li> Para examinar o espessamento da íntima e oclusão luminal, medir a área dentro da célula endotelialcamada, lâmina interna elástica (IEL) e lâmina elástica externa (EEL) em segmentos de artérias elásticas coradas van Gieson com um software de análise de imagem. Os parâmetros a seguir podem ser utilizados para determinar as alterações arteriais reflectoras de TA. <ol><li> Medir a área da íntima absoluta: a área da lâmina elástica interna - a área dentro da camada de células endoteliais. Isso fornece uma medida absoluta de expansão da íntima, que é a marca do TA. </li><li> Medir a absoluta área medial: área dentro da lâmina elástica externa - área dentro da lâmina elástica interna. Isto fornece uma medida absoluta da degradação medial ou o crescimento, que pode ocorrer ocasionalmente, como resultado de alterações mediadas pelo sistema imunológico para esta região da parede do vaso. </li><li> Medir a área total do vaso, como a área da lâmina elástica externa. Isso proporciona uma medição de remodelagem vascular que envolve a expansão ou constrição da artéria, como resultado de dano imunológico. </li><li> Medidada íntima / Média: (a área da lâmina elástica interna - área dentro da camada de células endoteliais) / (área da lâmina elástica externa - área da lâmina elástica interna). Isto proporciona uma medida relativa da expansão da íntima e normaliza as diferenças no tamanho do vaso. </li><li> Meça o estreitamento% Luminal: [(área dentro da lâmina elástica interna - área dentro da camada de células endoteliais) / área com a lâmina elástica interna)] * 100. Isto proporciona uma medida do grau de oclusão luminal, que resulta de uma combinação de expansão e remodelação da íntima (para dentro ou para fora) da parede do vaso. </li></ol></li></ol>

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C., Kerjner, A., Wong, B. W., McManus, B. M., Granville, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perforin+mediates+endothelial+cell+death+and+resultant+transplant+vascular+disease+in+cardiac+allografts.">Perforin mediates endothelial cell death and resultant transplant vascular disease in cardiac allografts.</a> Am J Pathol. 165, 127-133 (2004).</li><li>Choy, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granzyme+B+induces+endothelial+cell+apoptosis+and+contributes+to+the+development+of+transplant+vascular+disease.">Granzyme B induces endothelial cell apoptosis and contributes to the development of transplant vascular disease.</a> Am J Transplant. 5, 494-499 (2005).</li><li>Reis, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dramatic+remodeling+of+advanced+atherosclerotic+plaques+of+the+apolipoprotein+E-deficient+mouse+in+a+novel+transplantation+model.">Dramatic remodeling of advanced atherosclerotic plaques of the apolipoprotein E-deficient mouse in a novel transplantation model.</a> Journal of vascular surgery. 34, 541-547 (2001).</li><li>Potteaux, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppressed+monocyte+recruitment+drives+macrophage+removal+from+atherosclerotic+plaques+of+Apoe-/-+mice+during+disease+regression.">Suppressed monocyte recruitment drives macrophage removal from atherosclerotic plaques of Apoe-/- mice during disease regression.</a> J Clin Invest. 121, 2025-2036 (2011).</li></ol>

Nós descrevemos um protocolo para a interposição aórtica miocárdio em ratos que é útil para estudar rejeição vascular imunomediada e TA. Este modelo pode ser usado para investigar as causas de AT, bem como o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas. Tem sido usado no passado para estabelecer um papel essencial da imunidade adaptativa, respostas de células T citotóxicas, as respostas efectoras de células T CD4 mediada por citoquinas, e danos do enxerto mediada por anticorpos em TA 14,17-21.</s...

Nos últimos 30 anos, os avanços em drogas imunossupressoras têm diminuído a rejeição do enxerto por rejeição aguda, mas a rejeição crônica permanece um desafio principal. A principal manifestação da rejeição do transplante cardíaca crônica é a arteriosclerose de transplante (TA) 1,2. Esta condição é caracterizada por hiperplasia intimai e disfunção vasomotora das artérias aloenxerto e se desenvolve como um resultado de direccionamento imunológico de células endoteliais e do músculo liso pelo sistema imune receptor. O direcionamento específico da vasculatura do enxerto devido ao reconhecimento do complexo de histocompatibilidade estrangeira peptídeo-major (MHC) é realçada pelo desenvolvimento de TA exclusivamente nas artérias do enxerto, poupando os navios de acolhimento 3. De acordo com isto é a observação de que não ocorre TA experimentalmente quando o receptor é geneticamente idêntico ao doador ou quando o receptor não tem células T e B 4. Lesão vascular mediada imunologicamente e dysfunction faz com que o desenvolvimento de espessamento da íntima e fibrose, assim como a acumulação anormal de lípidos e proteínas da MEC, em TA 5. Espessamento da íntima tende a ser concêntrica ao longo de toda a 4-6 árvore arterial. Perda do enxerto e morte geralmente ocorrem como resultado de isquemia progressiva resultante da oclusão luminal de artérias allograft 4. Em 1991, Mennander et al. 7 pioneira um modelo de interposição aórtica em ratos para modelar TA. Diversos grupos têm subsequentemente adaptado este procedimento para utilização em ratos. Neste modelo, os segmentos da aorta de aloenxerto desenvolver lesões que apresentam características comparáveis ​​às TA observada em transplantes clínicos. Isso inclui espessamento da íntima caracterizada pelo acúmulo de células musculares lisas-like e leucócitos beneficiários 7. Nos últimos 2 décadas este modelo tem sido usado para gerar importantes insights sobre os mecanismos de lesão vascular, rejeição e TA. Pode ser-nosed para analisar as questões relacionadas com as respostas imunes e vasculares durante patologia arterial. A escolha dos impactos antígeno de incompatibilidade a capacidade de abordar adequadamente essas questões. Transplante através das barreiras de MHC completos permite uma avaliação abrangente das respostas imunes que são conhecidos por serem envolvidos na rejeição de transplante de órgãos. Isso inclui o reconhecimento direto de células CD4 e CD8 T e direcionamento da política externa peptídeo-MHC apresentado por células derivadas do enxerto, CD4 indireta (e, possivelmente, CD8) reconhecimento de células T e segmentação de aloantígenos derivados do enxerto apresentados por antigénio destinatário que apresentam células e por anticorpos reconhecimento mediado de aloantigénios na superfície das células vasculares 8. No entanto, a resposta vascular à lesão em experiências de MHC desemparelhado completos pode ser diferente do que a observada clinicamente. Johnson et al., 9 revelaram que, em enxertos transplantados interposição da aorta através de uma barreira completa de MHC incompatibilidade, a maioria deas células são de origem neointimais receptor e não de origem do doador. Isto é diferente do que a observada em transplantes humanos, onde a maioria das células do músculo liso da íntima são de origem do doador 9,10. Para ter em conta esta limitação, modelos experimentais alternativos que envolvem enxerto através menores descasamentos dos antígenos de histocompatibilidade têm sido desenvolvidos que desencadeiam respostas vasculares que mais se assemelham aos observados no transplante clínico 11. Embora estes modelos alternativos permitem conclusões importantes a serem feitas sobre as respostas vasculares que impulsionam o desenvolvimento de TA, os processos imunológicos que causam rejeição vascular em antígeno de histocompatibilidade menor enxertos incompatíveis não completamente re-capitular aquelas que ocorrem no ambiente clínico. Por exemplo, antígenos de histocompatibilidade menores são reconhecidos mal por enxerto anticorpos reativos 12. Dadas as considerações acima, é importante considerar o questi patológicono a ser examinado quando se escolhe o tipo de antigénio incompatibilidade utilizado num modelo interposição aórtica. Aqui nós descrevemos um protocolo detalhado para murino enxertia interposição aórtica. Nós descrevemos enxerto de interposição entre camundongos MHC-incompatíveis completos, mas o mesmo protocolo é usado para enxerto através de outras linhagens de camundongos incompatíveis antígeno.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name&#160;</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J (H-2b)</td>
			<td>Jackson Laboratories, Bar Harbour ME</td>
			<td>Strain# 000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balb/cBYJ</td>
			<td>Jackson Laboratories, Bar Harbour ME</td>
			<td>Strain# 001026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Ketamine Hydrochloride Injection USP 100 mg/ mL</td>
			<td rowspan="2">Ketalean</td>
			<td rowspan="2">DIN 00612316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine Injection 20 mg/mL</td>
			<td>Rompum</td>
			<td>DIN 02169592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketoprofen Injection 100 mg/mL</td>
			<td>Anafen</td>
			<td>DIN 01938126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butorphanol Tartrate&#160;injection 10 mg/mL</td>
			<td>Torbugesic</td>
			<td>DIN 008450000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine Injection 0.3 mg/mL</td>
			<td>Reckitt Benckiser</td>
			<td>B.N. 5241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atipamezole hydrochloride sterile injectable solution</td>
			<td>Antisedan</td>
			<td>DIN 02237744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium Injection, USP, 1000 units/mL</td>
			<td>McKesson Distribution</td>
			<td>DIN 02264315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tears naturale ophthalmic ointment</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>DIN 02082519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% Sodium Chloride, sterile</td>
			<td>Baxter Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactated Ringer&#8217;s solution, sterile</td>
			<td>Baxter Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% Sodium Chloride Injection, sterile, 10 mL</td>
			<td>Baxter Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol Prep Pads</td>
			<td>Loris</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone Iodine</td>
			<td>Betadine</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorohexidine Gluconate 4% w/v</td>
			<td>Germi-Stat</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black Polyamide Monofilament</td>
			<td>AROSurgical Instruments</td>
			<td rowspan="2">T4A10Q07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture, 10-0 suture, 70 microns</td>
			<td>Corporation</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue monofilament suture 5-0, P3 needle</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>8698G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>REF 309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>REF 309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1cc TB insulin syringe with 28G 1/2</td>
			<td>BD</td>
			<td>REF 309309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G 7/8, hypodermic needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>REF 305124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G 1/2, hypodermic needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>REF 305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri Retractor- 1.5cm spread 4cm</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>17000-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S&#38;T CAF-4 Clip applying forceps, without lock</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>00072-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supergrip forceps, S&#38;T</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>00632-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medical No.5 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11253-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lexer Baby Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14078-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Adson forceps serrated</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11018-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas-Tubingen microscissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15003-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro clamps, b-1; 3.5mm x 1mm; 7mm length</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>00396-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe-forceps, 10cm 1x2 teeth</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11054-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Castroviejo with lock and tungsten jaws</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12565-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot glass bead sterilizer</td>
			<td>Inotech 250</td>
			<td>IS-250 - Steri-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-woven gauzes</td>
			<td>Progene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Tipped Applicators</td>
			<td>Puritan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beard Trimmer</td>
			<td>Wahl</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>Sunbeam</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mouse model of alloimmune-induced vascular rejection and transplant arteriosclerosis

Vascular rejection that leads to transplant arteriosclerosis (TA) is the leading representation of chronic heart transplant failure. In TA, the immune system of the recipient causes damage of the arterial wall and dysfunction of endothelial cells and smooth muscle cells. This triggers a pathological repair response that is characterized by intimal thickening and luminal occlusion. Understanding the mechanisms by which the immune system causes vasculature rejection and TA may inform the development of novel ways to manage graft failure. Here, we describe a mouse aortic interposition model that can be used to study the pathogenic mechanisms of vascular rejection and TA. The model involves grafting of an aortic segment from a donor animal into an allogeneic recipient. Rejection of the artery segment involves alloimmune reactions and results in arterial changes that resemble vascular rejection. The basic technical approach we describe can be used with different mouse strains and targeted interventions to answer specific questions related to vascular rejection and TA.

Neste modelo, a aorta abdominal de um rato Balb / CYJ é interposta na aorta infra-renal de um C57BL / 6 destinatário. Isto permite uma avaliação abrangente de aloimunes respostas que visam artérias aloenxerto. Lesão vascular mediada imunologicamente neste modelo inicia respostas reparadoras vasculares que culminam em espessamento da íntima, estreitamento luminal e recrutamento de células imunitárias (Figuras 1 e 2). Estes critérios, em seguida, servir como um ler-out para a gr...

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Mouse Model of Alloimmune-induced Vascular Rejection and Transplant Arteriosclerosis

We describe a protocol for aortic interposition grafting in mice. The goal of the protocol is to provide a model with which to study pathological processes and therapeutic strategies relevant to alloimmune reactions in arteries and the resultant arterial changes that contribute to organ transplant failure.

Modelo rato de rejeição vascular induzida por Aloimune e Transplante Arteriosclerose

Vascular rejection that leads to transplant arteriosclerosis (TA) is the leading representation of chronic heart transplant failure. In TA, the immune ...

mouse-model-alloimmune-induced-vascular-rejection-transplant

Research

JoVE Journal

Medicine

8.4K visualizações.  Simon Fraser University. We describe a protocol for aortic interposition grafting in mice. The goal of the protocol is to provide a model with which to study pathological processes and therapeutic strategies relevant to alloimmune reactions in arteries and the resultant arterial changes that contribute to organ transplant failure. 

Vídeo: Mouse Model of Alloimmune-induced Vascular Rejection and Transplant Arteriosclerosis

Mouse Models for Graft Arteriosclerosis

Graft arteriosclerois (GA), also called allograft vasculopathy, is a pathologic lesion that develops over months to years in transplanted organs characterized by diffuse, circumferential stenosis of the entire graft vascular tree. The most critical component of GA pathogenesis is the proliferation of smooth muscle-like cells within the intima. When a human coronary artery segment is interposed into the infra-renal aortae of immunodeficient mice, the intimas could be expand in response to adoptively transferred human T cells allogeneic to the artery donor or exogenous human IFN-&gamma; in the absence of human T cells. Interposition of a mouse aorta from one strain into another mouse strain recipient is limited as a model for chronic rejection in humans because the acute cell-mediated rejection response in this mouse model completely eliminates all donor-derived vascular cells from the graft within two-three weeks. We have recently developed two new mouse models to circumvent these problems. The first model involves interposition of a vessel segment from a male mouse into a female recipient of the same inbred strain (C57BL/6J). Graft rejection in this case is directed only against minor histocompatibility antigens encoded by the Y chromosome (present in the male but not the female) and the rejection response that ensues is sufficiently indolent to preserve donor-derived smooth muscle cells for several weeks. The second model involves interposing an artery segment from a wild type C57BL/6J mouse donor into a host mouse of the same strain and gender that lacks the receptor for IFN-&gamma; followed by administration of mouse IFN-&gamma; (delivered via infection of the mouse liver with an adenoviral vector. There is no rejection in this case as both donor and recipient mice are of the same strain and gender but donor smooth muscle cells proliferate in response to the cytokine while host-derived cells, lacking receptor for this cytokine, are unresponsive. By backcrossing additional genetic changes into the vessel donor, both models can be used to assess the effect of specific genes on GA progression. Here, we describe detailed protocols for our mouse GA models.

We describe protocols for our mouse graft arteriosclerois (GA) models which involve interposition of a mouse vessel segment into a recipient of the same inbred strain. By backcrossing additional genetic changes into the vessel donor, the model can assess the effect of specific genes on GA.

Os modelos de mouse para Arteriosclerose Graft

Graft arteriosclerois (GA),  also called allograft vasculopathy, is a pathologic lesion that develops over  months to years in transplanted organs ...

Medicina

Technical Aspects of the Mouse Aortocaval Fistula

Technical aspects of creating an arteriovenous fistula in the mouse are discussed. Under general anesthesia, an abdominal incision is made, and the aorta and inferior vena cava (IVC) are exposed. The proximal infrarenal aorta and the distal aorta are dissected for clamp placement and needle puncture, respectively. Special attention is paid to avoid dissection between the aorta and the IVC. After clamping the aorta, a 25 G needle is used to puncture both walls of the aorta into the IVC. The surrounding connective tissue is used for hemostatic compression. Successful creation of the AVF will show pulsatile arterial blood flow in the IVC. Further confirmation of successful AVF can be achieved by post-operative Doppler ultrasound.

The goal is to produce an arteriovenous fistula that is simple and reproducible. This method does not use sutures or glue adhesive. Therefore the samples can be used with the least amount of foreign materials for analysis.

Aspectos técnicos da artocava Fístula Rato

Technical aspects of creating an arteriovenous fistula in the mouse are discussed. Under general anesthesia, an abdominal incision is made, and the aorta ...

Murine Heterotopic Heart Transplant Technique

It is now over forty years since this technique was first reported by Corry, Wynn and Russell. Although it took some years for other labs to become proficient in and utilize this technique, it is now widely used by many laboratories around the world. A significant refinement to the original technique was developed and reported in 2001 by Niimi. Described here are the techniques that have evolved over more than a decade in the hands of three surgeons (Plenter, Grazia, Pietra) in our center. These techniques are now being passed on to a younger generation of surgeons and researchers.
Based largely on the Niimi experience, the procedures used have evolved in the fine details - details which we will endeavor to relate here in such a way that others may be able to use this very useful model. Like Niimi, we have found that a video aid to learning is a priceless resource for the beginner.

The manuscript describes the steps required to perform the heterotopic heart transplant in the mouse.

Técnica de transplante heterotópico Murino Coração

It is now over forty years since this technique was first reported by Corry, Wynn and Russell. Although it took some years for other labs to become ...

Mouse Kidney Transplantation: Models of Allograft Rejection

Rejection of the transplanted kidney in humans is still a major cause of morbidity and mortality. The mouse model of renal transplantation closely replicates both the technical and pathological processes that occur in human renal transplantation. Although mouse models of allogeneic rejection in organs other than the kidney exist, and are more technically feasible, there is evidence that different organs elicit disparate rejection modes and dynamics, for instance the time course of rejection in cardiac and renal allograft differs significantly in certain strain combinations. This model is an attractive tool for many reasons despite its technical challenges. As inbred mouse strain haplotypes are well characterized it is possible to choose donor and recipient combinations to model acute allograft rejection by transplanting across MHC class I and II loci. Conversely by transplanting between strains with similar haplotypes a chronic process can be elicited were the allograft kidney develops interstitial fibrosis and tubular atrophy. We have modified the surgical technique to reduce operating time and improve ease of surgery, however a learning curve still needs to be overcome in order to faithfully replicate the model. This study will provide key points in the surgical procedure and aid the process of establishing this technique.

Here, we present a protocol to study the immunology of rejection. The surgical model presented reports a short operating time and a concise technique. Depending on the donor-recipient strain combination, the transplanted kidney may develop acute cellular rejection or chronic allograft damage, defined by interstitial fibrosis and tubular atrophy.

Rato Transplante Renal: Modelos de rejeição de enxertos

Rejection of the transplanted kidney in humans is still a major cause of morbidity and mortality. The mouse model of renal transplantation closely ...

Ferric Chloride-induced Thrombosis Mouse Model on Carotid Artery and Mesentery Vessel

Severe thrombosis and its ischemic consequences such as myocardial infarction, pulmonary embolism and stroke are major worldwide health issues. The ferric chloride injury is now a well-established technique to rapidly and accurately induce the formation of thrombi in exposed veins or artery of small and large diameter. This model has played a key role in the study of the pathophysiology of thrombosis, in the discovery and validation of novel antithrombotic drugs and in the understanding of the mechanism of action of these new agents. Here, the implementation of this technique on a mesenteric vessel and carotid artery in mice is presented. The method describes how to label circulating leukocytes and platelets with a fluorescent dye and to observe, by intravital microscopy on the exposed mesentery, their accumulation at the injured vessel wall which leads to the formation of a thrombus. On the carotid artery, the occlusion caused by the clot formation is measured by monitoring the blood flow with a Doppler probe.

The FeCl3 induced thrombosis model in mice is described herein. A method to monitor thrombus growth by intravital microscopy observation on a mesenteric vessel and by blood flow measurement in the carotid artery is presented.

Férrico Thrombosis Modelo rato na artéria carótida e Mesentery Vessel induzida por Chloride

Severe thrombosis and its ischemic consequences such as myocardial infarction, pulmonary embolism and stroke are major worldwide health issues. The ferric ...

Intraluminal Drug Delivery to the Mouse Arteriovenous Fistula Endothelium

Delivery of therapeutic agents to enhance arteriovenous fistula (AVF) maturation can be administered either via intraluminal or external routes. The simple murine AVF model was combined with intraluminal administration of drug solution to the venous endothelium at the same time as fistula creation. Technical aspects of this model are discussed. Under general anesthesia, an abdominal incision is made and the aorta and inferior vena cava (IVC) are exposed. The infra-renal aorta and IVC are dissected for clamping. After proximal and distal clamping, the puncture site is exposed and a 25 G needle is used to puncture both walls of the aorta and into the IVC. Immediately after the puncture, a reporter gene-expressing viral vector was infused in the IVC via the same needle, followed by 15 min of incubation. The intraluminal administration method enabled more robust viral gene delivery to the venous endothelium compared to administration by the external route. This novel method of delivery will facilitate studies that explore the role of the endothelium in AVF maturation and enable intraluminal drug delivery at the time of surgical operation.

After puncturing the aorta through the inferior vena cava (IVC) to create an aorto-caval fistula in the mouse, solution containing a drug is infused into the IVC via the same needle, followed by incubation. This method enables more robust drug delivery to the venous endothelium compared to the external route.

Drug Delivery intraluminal para o Rato Fístula Arteriovenosa endotélio

Delivery of therapeutic agents to enhance arteriovenous fistula (AVF) maturation can be administered either via intraluminal or external routes. The ...

Vein Interposition Model: A Suitable Model to Study Bypass Graft Patency

Bypass grafting is an established treatment method for coronary artery disease. Graft patency continues to be the Achilles heel of saphenous vein grafts. Research models for bypass graft failure are essential for a better understanding of pathobiological and pathophysiological processes during graft patency loss. Large animal models, such as pigs or sheep, resemble human anatomical structures but require special facilities and equipment. This video describes a rat vein interposition model to investigate vein graft patency loss. Rats are inexpensive and easy to handle. Compared to mouse models, the convenient size of rats permits better operability and enables a sufficient amount of material to be obtained for further diverse analysis. In brief, the inferior epigastric vein of a donor rat is harvested and used to replace a segment of the femoral artery. Anastomosis is conducted via single stitches and sealed with fibrin glue. Graft patency can be monitored non-invasively using duplex sonography. Myointimal hyperplasia, which is the main cause for graft patency loss, develops progressively over time and can be calculated from histological cross sections.

This video demonstrates a model to study the development of myointimal hyperplasia after venous interposition surgery in rats.

Veia Interposição Modelo: Um modelo adequado para estudar Bypass Graft Perviedade

Bypass grafting is an established treatment method for coronary artery disease. Graft patency continues to be the Achilles heel of saphenous vein grafts. ...

Using the Sleeve Technique in a Mouse Model of Aortic Transplantation - An Instructional Video

Orthotopic aortic transplantation using the sleeve technique reduces injury to the aorta with failure rate of only 10-20%. The time to anastomose the aorta in mice using the sleeve method was short and easy averaging 20 min, permitting studies of iso/allo grafts. The following article describes the aortic transplantation procedure used in our laboratory. The mice were anesthetized with a mixture of 1.5% volume isoflurane and 100% oxygen through a face mask. At this point, the segment of the aorta between the renal arteries and its bifurcation was separated from the vena cava, freely prepared and clampedat the proximal and distal segments with a single silk suture. Prior to the removal of the aorta, a saline solution containing heparin was injected into the inferior vena cava. Then the aorta was cut between the clamps and a saline heparin solution was used to flush the lumen. The sleeve technique with monofilament sutures was used in order to transplant the abdominal aorta in the orthotopic position.

We present an orthotopic aortic transplantation model using the sleeve technique in mice. It is a very rapid anastomosis method, which can be employed in studies of vascular disease.

Usando a técnica de manga em um modelo do rato da transplantação da aorta - um vídeo instrutivo

Orthotopic aortic transplantation using the sleeve technique reduces injury to the aorta with failure rate of only 10-20%. The time to anastomose the ...

Mouse Model for Pancreas Transplantation Using a Modified Cuff Technique

Mouse models have several advantages in transplantation research, including easy handling, a variety of genetically well-defined strains, and the availability of the widest range of molecular probes and reagents to perform in vivo as well as in vitro studies. Based on our experience with various murine transplantation models, we developed a heterotopic pancreas transplantation model in mice with the intent to analyze mechanisms underlying severe ischemia reperfusion injury-associated early graft damage. In contrast to previously described techniques using suture techniques, herein we describe a new procedure using a non-suture cuff technique. 
In recent years, we have performed more than 300 pancreas transplantations in mice with an overall success rate of &gt;90%, a success rate never described before in mouse pancreas transplantation. The backbone of this non-suture cuff technique for graft revascularization consists of two major steps: (I) pulling the recipient vessel over a polyethylene/polyamide cuff and fixing it with a circumferential ligature, and (II) placing the donor vessel over the everted recipient vessel and fixing it with a second circumferential ligature. The resultant continuity of the endothelial layer results in less thrombogenic lesions with high patency rates and, finally, high success rates.
In this model, arterial anastomosis is achieved by pulling the abdominal aorta of the donor graft over the everted common carotid artery of the recipient animal. Venous drainage of the graft is achieved by pulling the portal vein of the graft over the everted external jugular vein of the recipient. This manuscript provides details and crucial steps of the organ recovery and organ implantation procedures, which will allow researchers with microsurgical skills to perform the transplantation successfully in their laboratories.

Among abdominal solid organ transplantation, pancreatic grafts are prone to develop severe ischemia reperfusion injury-associated graft damage, leading eventually to early graft loss. This protocol describes a model of murine pancreas transplantation using a non-suture cuff technique, ideally suited for analyzing these early, deleterious damages.

Modelo do rato para transplante de pâncreas, usando uma técnica modificada do manguito

Mouse models have several advantages in transplantation research, including easy handling, a variety of genetically well-defined strains, and the ...

Quantitative Micro-CT Analysis of Aortopathy in a Mouse Model of &#946;-aminopropionitrile-induced Aortic Aneurysm and Dissection

Aortic aneurysm and dissection is associated with significant morbidity and mortality in the population and can be highly lethal. While animal models of aortic disease exist, in vivo imaging of the vasculature has been limited. In recent years, micro-computerized tomography (micro-CT) has emerged as a preferred modality for imaging both large and small vessels both in vivo and ex vivo. In conjunction with a method of vascular casting, we have successfully used micro-CT to characterize the frequency and distribution of aortic pathology in &#946;-aminopropionitrile-treated C57/Bl6 mice. Technical limitations of this method include variations in the quality of the perfusion introduced by poor animal preparation, the application of proper methodologies for vessel size quantification, and the non-survivability of this procedure. This article details a methodology for the intravascular perfusion of a lead-based radiopaque silicone rubber for the quantitative characterization of aortopathy in a mouse model of aneurysm and dissection. In addition to visualizing aortic pathology, this method may be used for examining other vascular beds in vivo or vascular beds removed post-mortem.

Quantitative Micro-CT Analysis of Aortopathy in a Mouse Model of &amp;#946;-aminopropionitrile-induced Aortic Aneurysm and Dissection

This article describes a detailed methodology of using a radiopaque lead-based silicone rubber to perfuse the murine vasculature for aortic diameter quantification in a mouse model of aortic aneurysm and dissection.

Análise quantitativa de Micro-CT de Aortopathy em um modelo do rato de β-aminopropionitrile-induzida de aneurisma da aorta e dissecação

Aortic aneurysm and dissection is associated with significant morbidity and mortality in the population and can be highly lethal. While animal models of ...