ゼブラフィッシュ患者由来異種移植片は、in vivoで癌患者の化学感受性プロファイルを予測するための強力な前臨床モデルである。プロトコルは、患者の手術標本から始まるモデルの生成を記述します。細胞をゼブラフィッシュ胚に分離するのではなく、小さな組織断片を異種移植することにより、腫瘍の進行と化学療法への反応にとって重要なステップである腫瘍微小環境を維持することができます。
このモデルの大きな利点は、個別化医療のツールとして機能するわずか1週間の臨床関連時間枠で患者の予後を予測する可能性にあります。患者から採取した腫瘍組織全体を5ミリリットルの新鮮な腫瘍培地で洗浄することにより、サンプル処理を開始します。プラスチック製のパスツールピペットを使用して10回上下にピペットで固定します。
洗浄を3回繰り返す前に、洗浄媒体を注意深く吸引して廃棄してください。サンプルを1〜2ミリリットルの新鮮な腫瘍培地に浸します。メスの刃を使用して腫瘍サンプルを1〜2ミリメートルの立方体に切断し、腫瘍培地を入れた滅菌済みの5ミリリットルのプラスチックチューブに入れます。
McIlwainティッシュチョッパーを100マイクロメートルの厚さに設定した後、腫瘍片をチョッパーの円形のプラスチックテーブルに置き、それらを切り刻みます。テーブルを90度回転させ、チョッピングを繰り返します。刻んだ腫瘍片を腫瘍培地を含む15ミリリットルのプラスチックチューブに集めます。
細かく刻んだ腫瘍片を300 Gで3分間遠心分離してから、上清を吸引して廃棄します。細胞微量溶液またはCM-DiIやDeep Redなどの代替蛍光セルトラッカーとともに、37°Cの水浴中で30分間、断片をインキュベートします。インキュベーション中は、10分ごとに断片を静かに再懸濁します。
染色の最後に、少なくとも1%のタンパク質を添加した腫瘍培地を添加して、遊離色素を除去します。体積は染色量の5倍になります。断片を300 Gで3分間遠心分離し、上清を廃棄します。
1ミリリットルのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水またはDPBSを追加し、この洗浄ステップを3回繰り返します。完了したら、60ミリメートルのペトリ皿に5ミリリットルのDPBSに断片を懸濁させます。ゼブラフィッシュベースの患者由来異種移植片またはzPDXを確立するために、受精後2日目の胚を麻酔する。
3つのアガロースシリンダーを有するペトリ皿に、片側が露出するシリンダー上にゼブラフィッシュ胚を置きます。余分な溶液を取り除き、胚を薄膜に保ちます。滅菌鉗子を使用して、染色された腫瘍組織断片の断片を60ミリメートルのペトリ皿から胚が置かれている1%アガロース支持体に移します。
次に、組織を拾い上げて胚卵黄の上に置いてから、熱で引っ張られたガラスマイクロニードルを使用して卵周囲腔に押し込みます。E3 1%ペニシリンストレプトマイシンを胚に数滴加えて、胚を液体に戻します。すべての胚に腫瘍組織の移植を繰り返した後、ペトリ皿からアガロース支持体を取り出し、摂氏35度で胚をインキュベートします。
着床の2時間後、蛍光実体顕微鏡を使用して陽性染色で正しい異種移植片がないか胚を確認します。死んだ胚と腫瘍片のない胚を完全に卵胞周囲腔内に捨てる。完了したら、胚を6つのマルチウェルプレートにランダムに分配し、実験計画に従ってグループに均等に分けます。
薬物をE3 1%ペン連鎖球菌に混合して希釈し、FOLFOXIRIカクテルを調製します。2時間の移植後、各ウェルから培地を取り出し、薬物カクテルを加える。胚を摂氏35度のインキュベーターに3日間入れ、培地を毎日交換して薬を更新します。
イメージングには、共焦点顕微鏡の40倍の対物レンズで画像をキャプチャします。1024 x 512 ピクセルの解像度を使用し、Z 間隔は 5 マイクロメートルです。シアノで検出されたアポトーシスを分析するために取得したzPDXのマウント画像全体は、併用療法が対照群群と比較して細胞アポトーシスを増加させることを示した。
ケーススタディでは、移植された異種移植片におけるアポトーシス細胞の割合の統計的に有意な増加が、対照群と比較してFOLFOXIRI処理群で確認されたことが報告されました。プロトコールは膵臓癌組織を用いた例を示しているが、ゼブラフィッシュ患者由来の異種移植片は異なる種類の癌から樹立することができる。さらに、このモデルは倫理的影響が低いため、新薬のin vivoスクリーニングに容易に利用できます。
この方法は技術的に困難であり、専門のオペレーターが必要です。ゼブラフィッシュの胚操作とマイクロインジェクションに関する以前の専門知識は、技術のトレーニングをスピードアップします。
