This work was supported by NSF/DBI-1255991 grant to IML.

キャピラリーマイクロリアクターの調製<ol><li> 100μmの内径（ID）が360μmの外径（OD）7〜8センチメートルの長さに毛細血管、およびガラスキャピラリー包丁で3〜5センチメートル〜20μmでID×90ミクロンのODキャピラリーをxはカット。任意の突出バリなし、両方のキャピラリー端がきれい、ストレートカットを持って、顕微鏡下で確認してください。 </li><li> 〜6mmの長さのために、100μmのIDのx 360μmの外径キャピラリーの一端には20μmID×90ミクロンのODキャピラリを挿入します。必要な場合には、顕微鏡下でこの動作を観察します。 </li><li> Q-チップの先端と90μmのOD / 100μmのIDを毛細血管の接合の周りに接着剤E6000の小滴を適用し、室温で接着剤の硬化O / Nをしましょう​​。 </li><li> 10~15ミリの長さまで挿入さ20μmID×90ミクロンのODキャピラリーをカット。これは、エレクトロスプレーイオン化エミッタとなります。 </li><li> 1/32 &quot;OD PEEK、1/16&quot; OD PEEKと1/16 &quot;OD PTFE浴槽カット済み長さ4-5センチの作品でる。これらは、漏れのない接続を提供するためのキャピラリー組合で使用袖になります。 </li><li> PEEK組合に100μmのIDのx 360μmの外径キャピラリーの反対側の端を接続します。漏れのない接続を提供するための1/32 &quot;PEEKスリーブを使用します。 </li><li>挿入/労働組合の反対側の端に〜の片5 cmの長さ1/16 &quot;PTFEチューブを締めます。 </li><li> C18の約4 mgの（5μm）と粒子が予備洗浄乾燥/ 2mLのガラスバイアルで計量します。 、0.5ミリリットルのイソプロパノールを追加バイアルを閉じ、超音波処理槽内のスラリーを分散させます。 </li><li> 250μlの注射器で撤退約200μlのスラリー、PEEK組合の1/16 &quot;PTFEチューブに注射針を挿入し、100ミクロンのIDのx 360μmの外径キャピラリーにゆっくりスラリーを分配;のように顕微鏡下で観察しますこれは、マイクロリアクター（ 図1）となります20μ; 2-3ミリメートルパッキングの長さが達成されるまで、毛細管は粒子で満たさm個のIDキャピラリーは、キーストーン効果によりマイクロリアクター中の粒子を保持している。15 </li><li> H 2 O / CH 3 CN 50：50 V / Vの50μlの溶液を〜とマイクロリアクターをすすぎ、その後、H 2 O / CH 3 CN 98の50μlのソリューション〜と：2（v / v）です。 </li></ol>サンプル溶液の調製注：有機溶媒および酸の取り扱いを伴う操作および溶液調製をヒュームフード内で行われるべきです。ゴーグル、手袋、防護服を着用してください。 <ol><li> CH 3 OHで洗浄し、いくつかのガラスバイアル（4ミリリットル）とポリプロピレンチューブ（15ミリリットル）を乾燥させます。 </li><li> 200μlのCH 3 CN 9.8 mlのH 2 Oを混合して15mlのポリプロピレンチューブ中で、H 2 O / CH 3 CN（2 V / V 98）の溶液10mlを調製超音波処理によって混ぜます。 </li><li>溶液10mlを調製し、H 2 O / CH 3 CN（50:50 v / v）の15mlのポリプロピレンチューブ中の5mLのH 2を混合して&lt;/サブ&gt; Oと5ミリリットルのCH 3 CN;超音波処理によって混ぜます。 </li><li> 4 mLのH 2 O / CH 3 CNに4μlのTFA（10％）を加えることにより酸性化した水性溶液4ml（TFA 0.01％V / V）を調製する：4 mLのガラスバイアル中（98 2 V / V）超音波処理によって混ぜます。 </li><li> 4 mLのガラスバイアルに4 mLのH 2 O / CH 3 CN（50:50 v / v）に4μlのTFA（10％）を加えることにより酸性化し、有機溶液4ml（TFA 0.01％V / V）を調製します。超音波処理によって混ぜます。 </li><li> 16 mgのNH 4 HCO 3を計量 4ミリリットルのガラスバイアルにおける分析天秤を持ちます。 （2 V / V 98）溶液を超音波処理によって分散させる; H 2 Oを4ml / CH 3 CNを加えますこれは、水性緩衝液中のNH 4 HCO 3（pH約7.8）の50 mM溶液をもたらします。 </li><li> 4ミリリットルのガラスバイアルにおける分析天秤で、標準的なタンパク質（ 例えば 、ウシ血清アルブミン、ヘモグロビンα/β、チトクロームC、炭酸脱水酵素、α-2-HS糖タンパク質、）5mgを計量します。 4ミリリットルのDIウォートを追加rと超音波処理により分散させます。これは、典型的には、高μMレベルの濃度の溶液をもたらします。 </li><li> NH 4 HCO 3（50 mM）の水性緩衝液の適切な量で高μMレベルの濃度の溶液を希釈することにより1ミリリットルタンパク質溶液（1-2μM）を準備。超音波処理によって混ぜます。 </li><li> NH 4 HCO 3（50 mM）の水性緩衝液μlの170で20μgのシーケンシンググレードのトリプシンを溶解することによりトリプシン溶液（5μM）を準備。超音波処理によって分散させます。 </li></ol> 3.実験のセットアップ注：LTQ-MSシステムは、様々なサンプル入力アプローチに質量分析計のインターフェースを可能に自作XYZステージを含んで修正されたESI源が装備されています。 <ol><li> PEEK組合から毛細管マイクロリアクターを外し、PEEKティーに接続します。 </li><li> PEEKティーのサイドアームに約2センチPt線を挿入します。提供するための1/32 &quot;PEEKスリーブを使用漏れのない接続とPt線を絶縁するため。 </li><li> 50ミクロンのIDのx 360μmの外径（〜0.5メートルの長さ）サンプル移送毛細管は、PEEKティーの反対側の端部に接続します。漏れのない接続を提供するための1/32 &quot;PEEKスリーブを使用します。 </li><li> XYZステージ上PEEKティーを確保し、離れて質量分析計の入口キャピラリーから〜2ミリメートルESIエミッタを配置します。 </li><li>質量分析計のESIの電力供給源に白金線を接続します。 </li><li>ステンレス鋼の組合へのサンプル移送毛細管の反対側の端を接続します。漏れのない接続を提供するための1/16 &quot;PEEKスリーブを使用します。 </li><li> 、ポンプをオンにして所望の値に流量を設定する（ 例えば 、ステンレス鋼労働組合の反対側の端部4〜5 cmの長さ1/16 &quot;PTFEチューブを接続し、PTFEチューブ内の250μlの注射針を挿入2μL/分）。 </li><li> MS機器ANを制御するソフトウェアパッケージに入力タンデムMSデータ収集パラメータ分析を行うための準備セットアップにメソッドファイルとして保存しますdは、 LTQ-MSシステムのために、以下のデータ依存解析パラメータを使用します。除​​外質量幅180秒間有効ダイナミック除外を1.5メートル/ zの±; 1 MSは、トップ5最も強いピークに1ズームとMS 2のスキャンに続いてスキャンし、スキャン幅±5のm / zをズーム。衝突誘起解離分離幅3メートル/ zの、正規化衝突エネルギー35％、活性化Q 0.25、および活性化時間30ミリ秒に設定（CID）パラメータ。 </li></ol> 4.マイクロ流体セットアップ<ol><li> （1）マイクロリアクターからなる、デバイスの16-18レイアウトは、 図2Aに設けられている。（0.13ミリメートル幅×2ミリの長さ×50ミクロンの深）の入口に接続された（2;ガラスまたはポリマー基板からマイクロ流体デバイスを準備します）、出口（3）およびサイドポート（4）。流体操作のための相互接続チャネルである〜110ミクロン、幅〜50μmの深いです。マルチチャネル構造は、（5）、からなる〜1.5〜2ミクロンの深×10ミクロン幅×置か100μmの長いマイクロチャネル25ミクロン離れて、マイクロリアクター中の粒子を保持するためのフィルタとして機能します。 </li><li>入口ポートに専用コネクタを接着することによって、または流体送達（ 図2B）用の金具を収容したポリマースタンドを工夫することにより、チップへの流体送達接続を有効にします。16 </li><li>ステップ1.8で説明したようにC18粒子（5ミクロン）のスラリーを準備します。チップ側ポートに接続された1/16 &quot;PTFEチューブ（4）を用いて注射器でマイクロリアクターにスラリーを送達; 90ºCのオーブン中で1時間、エポキシ接着剤と硬化と、粒子のロード後にポートをシール16。 </li><li> 、出口ポートにキャピラリー（20μmのID×90μmの外径×10ミリの長さ）を挿入E6000接着剤で封止し、そしてキュアO / Nをしましょう​​。これは、（ESIエミッターとなります<strong&gt; 6）。 </li><li> 50μmのIDのx 360μmの外径（〜0.5メートルの長さ）サンプル移送キャピラリーはチップ入口ポート（2）に接続します。 3.6から3.7に記載されているように、250μlのシリンジとシリンジポンプにキャピラリーの反対側の端を接続します。 </li><li>直前の入口ポートへのサンプル移送ライン（2）上の軽量PEEKティーコネクタを配置し、3.2で説明したように、ティーのサイドアームにPt線を挿入します。これは、ESI電極となります。 </li><li>質量分析計の入口キャピラリーから〜2ミリメートル離れて配置さESIエミッタとXYZステージ上にマイクロ流体デバイスを固定します。 3.8で説明したように、分析のためのMSを準備します。 </li></ol> 5.サンプルのロード、MS分析のためのタンパク質分解消化および溶出注：すべての溶液/試料移送ステップは、シリンジポンプの助けを借りて行われ、完了するためにいくつかの追加分を可能にすべきである、デッドvolumを補償するために、マイクロリアクターへとからの転送ラインに関連したエス。必要な時間は、関与の流量に依存します。 <ol><li> 5分間2μL/ minで：（2 V / V 98）、マイクロリアクターを洗浄し、分析の準備をし、H 2 O中のNH 4 HCO 3（50ミリモル）の水溶液を注入することによって/ CH 3 CN 250μlの注射器を使用しています。 </li><li> 5分間、2μL/分で試料溶液を注入することによりマイクロリアクターのタンパク質試料（1μM）を読み込みます。 250μlの注射器を使用しています。 </li><li> 1-3分間2μL/ minでマイクロリアクターに吸着されたタンパク質の上にトリプシン溶液（5μM）を注入します。 </li><li> TFAの酸性化水溶液でマイクロリアクターをすすぐことによって、タンパク質分解消化プロセスを停止（0.01％v / v）のH 2 O / CH 3 CN中の（98：2 v / v）で2μL/分で5分間。 250μlの注射器を使用しています。 </li><li> TFAの酸性化有機溶液（0.01％を注入することによりマイクロリアクターからタンパク質消化物を溶出開始v / v）のH 2 O / CH 3 CN（50:50 v / v）の300 NL /分。 </li><li> MSデータ取得処理とESI電圧（〜2000 V）をオンにします。ステップ3.8において提供されたデータ収集パラメータを使用して、MSデータを取得します。トリプシンペプチドの溶出を観察します。 </li></ol> 6.データ処理<ol><li>生のMSデータフォーマットと互換性のある検索エンジンでタンデムMSデータを処理します。 <ol><li>生物の特定の最小限の冗長タンパク質データベースを使用して、LTQ-MS RAWファイルを処理します。検索のための切断を逃した、検索エンジンで生データをアップロードし、それぞれ2および1ダに親とフラグメントイオン質量許容範囲を設定し、最大2つので唯一の完全にトリプシンフラグメントを使用します。翻訳後修飾のために許可されていません。それぞれ、1％、3％に高、中、自信偽発見率（FDR）を設定し、翻訳後修飾することができません。 </li></ol></li><li>唯一の高自信を選択するために、データをフィルタペプチドは、データベース内のタンパク質にマッチします。タンパク質およびペプチドレベルの結果を評価します。 </li></ol>

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	<li>Petersen, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Bioreactors.">Microfluidic Bioreactors.</a> Encyclopedia of Microfluidics and Nanofluidics. , (2014).</li><li>Matosevic, S., Szita, N., Baganz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamentals+and+applications+of+immobilized+microfluidic+enzymatic+reactors.">Fundamentals and applications of immobilized microfluidic enzymatic reactors.</a> J. Chem. Technol. Biotechnol. 86 (3), 325-334 (2011).</li><li>Liu, Y., Liu, B., Yang, P., Girault, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+enzymatic+reactors+for+proteome+research.">Microfluidic enzymatic reactors for proteome research.</a> Anal. Bioanal. Chem. 390 (1), 227-229 (2008).</li><li>Wu, H., Zhai, J., Tian, Y., Lu, H., Wang, X., Jia, W., Liu, B., Yang, P., Xu, Y., Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+enzymatic-reactors+for+peptide+mapping:+strategy,+characterization,+and+performance.">Microfluidic enzymatic-reactors for peptide mapping: strategy, characterization, and performance.</a> LabChip. 4 (6), 588-597 (2004).</li><li>Jin, L. J., Ferrance, J., Sanders, J. C., Landers, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microchip-based+proteolytic+digestion+system+driven+by+electroosmotic+pumping.">A microchip-based proteolytic digestion system driven by electroosmotic pumping.</a> LabChip. 3 (1), 11-18 (2003).</li><li>Asanomi, Y., Yamaguchi, H., Miyazaki, M., Maeda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme-immobilized+microfluidic+process+reactors.">Enzyme-immobilized microfluidic process reactors.</a> Molecules. 7 (16), 6041-6059 (2011).</li><li>Aravamudhan, S., Joseph, P. J., Kuklenyik, Z., Boyer, A. E., Barr, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+microfluidic+enzyme+reactor+mass+spectrometry+platform+for+detection+of+anthrax+lethal+factor.">Integrated microfluidic enzyme reactor mass spectrometry platform for detection of anthrax lethal factor.</a> , 1071-1074 (2009).</li><li>Liu, X., Lo, R. C., Gomez, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+a+microfluidic+enzyme+reactor+utilizing+magnetic+beads.">Fabrication of a microfluidic enzyme reactor utilizing magnetic beads.</a> Electrophoresis. 30 (12), 2129-2133 (2009).</li><li>Liu, Y., Xue, Y., Ji, J., Chen, X., Kong, J., Yang, P., Girault, H. H., Liu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gold+nanoparticle+assembly+microfluidic+reactor+for+efficient+on-line+proteolysis.">Gold nanoparticle assembly microfluidic reactor for efficient on-line proteolysis.</a> Mol. Cell. Proteomics. 6 (8), 1428-1436 (2007).</li><li>Wu, H., Tian, Y., Liu, B., Lu, H., Wang, X., Zhai, J., Jin, H., Yang, P., Xu, Y., Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Titania+and+alumina+sol-gel-derived+microfluidics+enzymatic-reactors+for+peptide+mapping:+design,+characterization,+and+performance.">Titania and alumina sol-gel-derived microfluidics enzymatic-reactors for peptide mapping: design, characterization, and performance.</a> J. Proteome Res. 3 (6), 1201-1209 (2004).</li><li>Ji, J., Zhang, Y., Zhou, X., Kong, J., Tang, Y., Liu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+protein+digestion+through+the+confinement+of+nanozeolite-assembled+microchip+reactors.">Enhanced protein digestion through the confinement of nanozeolite-assembled microchip reactors.</a> Anal. Chem. 80 (7), 2457-2463 (2008).</li><li>Hustoft, H. K., Brandtzaeg, O. K., Rogeberg, M., Misaghian, D., Torsetnes, S. B., Greibrokk, T., Reubsaet, L., Wilson, S. R., Lundanes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+enzyme+reactor+and+high+resolving+chromatography+in+&amp;#34;sub-chip&amp;#34;+dimensions+for+sensitive+protein+mass+spectrometry.">Integrated enzyme reactor and high resolving chromatography in &amp;#34;sub-chip&amp;#34; dimensions for sensitive protein mass spectrometry.</a> Scientific Reports. 3 (3511), 1-7 (2013).</li><li>Pramanik, B. N., Mirza, U. A., Ing, Y. H., Liu, Y. H., Bartner, P. L., Weber, P. C., Bose, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microwave-enhanced+enzyme+reaction+for+protein+mapping+by+mass+spectrometry:+A+new+approach+to+protein+digestion+in+minutes.">Microwave-enhanced enzyme reaction for protein mapping by mass spectrometry: A new approach to protein digestion in minutes.</a> Protein Sci. 11 (11), 2676-2687 (2002).</li><li>Olszowy, P. P., Burns, A., Ciborowski, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pressure-assisted+sample+preparation+for+proteomic+analysis.">Pressure-assisted sample preparation for proteomic analysis.</a> Anal. Biochem. 438 (1), 67-72 (2013).</li><li>Lord, G. A., Gordon, D. B., Myers, P., King, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tapers+and+restrictors+for+capillary+electrochromatography+and+capillary+electrochromatography-mass+spectrometry.">Tapers and restrictors for capillary electrochromatography and capillary electrochromatography-mass spectrometry.</a> J. Chromatogr. A. 768, 9-16 (1997).</li><li>Lazar, I. M., Kabulski, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+LC+Device+with+Orthogonal+Sample+Extraction+for+On-Chip+MALDI-MS+Detection.">Microfluidic LC Device with Orthogonal Sample Extraction for On-Chip MALDI-MS Detection.</a> Lab Chip. 13 (11), 2055-2065 (2013).</li><li>Harrison, D. J., Manz, A., Fan, Z. H., Ludi, H., Widmer, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+electrophoresis+and+sample+injection+systems+on+a+planar+glass+chip.">Capillary electrophoresis and sample injection systems on a planar glass chip.</a> Anal. Chem. 64 (17), 1926-1932 (1992).</li><li>Jacobson, S. C., Hergenroder, R., Koutny, L. B., Warmack, R. J., Ramsey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Injection+Schemes+and+Column+Geometry+on+the+Performance+of+Microchip+Electrophoresis+Devices.">Effects of Injection Schemes and Column Geometry on the Performance of Microchip Electrophoresis Devices.</a> Anal. Chem. 66 (7), 1107-1113 (1994).</li><li>Armenta, J. M., Perez, M. J., Yang, X., Shapiro, D., Reed, D., Tuli, L., Finkielstein, C. V., Lazar, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Proteomic+Protocol+for+Biomarker+Fingerprinting+in+Cancerous+Cells.">Fast Proteomic Protocol for Biomarker Fingerprinting in Cancerous Cells.</a> J. Chromatogr. A. 1217, 2862-2870 (2010).</li><li>Doucette, A., Craft, D., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Spectrometric+Study+of+the+Effects+of+Hydrophobic+Surface+Chemistry+and+Morphology+on+the+Digestion+of+Surface-Bound+Proteins.">Mass Spectrometric Study of the Effects of Hydrophobic Surface Chemistry and Morphology on the Digestion of Surface-Bound Proteins.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 14, 203-214 (2003).</li><li>Lazar, I. M., Trisiripisal, P., Sarvaiya, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Liquid+Chromatography+System+for+Proteomic+Applications+and+Biomarker+Screening.">Microfluidic Liquid Chromatography System for Proteomic Applications and Biomarker Screening.</a> Anal. Chem. 78 (15), 5513-5524 (2006).</li><li>Lazar, I. M., Karger, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+Open-Channel+Electroosmotic+Pumping+System+for+Microfluidic+Sample+Handling,&amp;#34.">Multiple Open-Channel Electroosmotic Pumping System for Microfluidic Sample Handling,&amp;#34.</a> Anal. Chem. 74 (24), 6259-6268 (2002).</li><li>Lazar, I. M., Rockwood, A. L., Lee, E. D., Sin, J. C. H., Lee, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+TOFMS+Detection+for+Capillary+Electrophoresis.">High-speed TOFMS Detection for Capillary Electrophoresis.</a> Anal. Chem. 71 (13), 2578-2581 (1999).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

この研究に記載のマイクロリアクターは、簡単に実装する30分未満でMS分析と識別を可能にするために、タンパク質の酵素消化を実施するための実験を​​提供します。このシステムの明確な利点は、従来の手法と比較して、簡単、高速、低試薬消費と低コストが含まれます。特に、高価な固定化トリプシンビーズおよびカートリッジを必要としません。毛細管マイクロリアクターの製造は簡...

精製タンパク質の同定および特徴付けは、しばしばMS技術を使用することによって達成されます。タンパク質が酵素で消化され、そのペプチドは、さらに単純な注入実験を用いてMSによって分析します。タンパク質分解性消化は、ほとんどのMS分析器の有用な質量範囲に小さいペプチド断片を生成するために必要であり、それは容易に、アミノ酸配列情報を生成する低エネルギー衝突誘起解離を介して断片化することができます。単離されたタンパク質または単純なタンパク質混合物のために、MS検出の前に、ペプチドのクロマトグラフ分離のための更なる必要はありません。 25-50ペプチドの混合物は、容易にMSのイオン源に直接シリンジポンプを用いてサンプルを注入することによって分析することができます。 質量分析計は、分析を実行し、短い時間枠内でタンパク質の配列を確認することができます。現代のデータ取得方法と、この方法は、wを実現することができます数分あるいは秒をithin。短い時間スケールで全体のプロセスを完了するの制限要因は、タンパク質分解消化ステップです。 （50-100）の酵素比：一般的に、これは、基板を使用して、37ºCでは、溶液中で、数時間（またはO / N）を介して実行される1。分または秒に酵素消化時間を短縮するために、固定化酵素マイクロリアクタ、マイクロ流体リアクターまたは市販のカートリッジの形で記載されている。1-6一般的に、酵素は、共有結合、非共有結合的/物理吸着、錯体によって固定されています形成またはカプセル化、大規模な対体積表面と酵素-基板の比率によって有効にされている酵素プロセスの3,6効率化。固定化された反応器のさらなる利点は、MS分析における酵素の自己消化との干渉を低減した酵素安定性および再利用性を向上させることを含みます。様々なアプローチ、ガラスを使用して、またはポリマーの微細加工装置が記載されており、抗体-抗原相互作用によって磁気ビーズ上に固定化酵素を使用して、7,8 9 は 、チタニア-アルミナゾル-ゲル10とnanozeolites 11の中に封入又はNi-NTAまたはHisタグ複合体形成を介して捕捉され、金ナノ粒子のネットワーク中に取り込ま。6あるいは固定化酵素を用いたオープン管状キャピラリーは同様に、開発されてきた。12また、強化されたタンパク質分解的切断が30-120に反応時間を減少させるために制御マイクロ波照射13または圧力補助または圧力循環技術（PCT）を使用して実証されています分。14 固定化酵素リアクターの複数の利点にもかかわらず、商業的なカートリッジのコストが高く、日常的な使用のためのマイクロ流体デバイスの利用可能性は制限され、そして追加の計測のために必要とするマイクロ波またはPCT技術の結果を使用します。この作業の目的は、circumve方法を開発することでしたこれらの欠点をNTS、それは容易に分以内MS分析のための調製物中のタンパク質の酵素的切断を行うための簡単​​かつ効果的なアプローチの研究に力を与えるために、すべての実験室で実施することができます。アプローチは、疎水性、キャピラリーまたはマイクロ流体デバイスにあらかじめロードされているC18-粒子、及び以上の酵素の注入の間に酵素消化に続いて、これらの粒子上の目的のタンパク質の吸着の使用に依存しています充填床と撮影したタンパク質（複数可）。このアプローチでは、基板は、非共有結合相互作用を介して固定化され、酵素を固定化されたタンパク質上に注入されます。タンパク質分解消化効率は、酵素処理、還元および粒子の表面からの距離と拡散時間の蛋白質を露出大きな粒子表面積増加物質移動、酵素の活性に影響を与える可能性がない共有結合、能力を向上させることが迅速にevaluat異なる酵素、廃棄、および多重化の電子の組み合わせ処理は、マイクロ流体形式で実行された場合。このアプローチは、標準的なタンパク質およびESI-MS検出の前にタンパク質分解消化のためのトリプシン最も一般的に使用される酵素の混合物を使用して実証されています。この研究において検出のために使用される質量分析計は、線形トラップ四重極（LTQ）装置でした。

<table><tbody><tr><td>Ion trap ESI-MS</td><td>Thermo Electron</td><td>LTQ</td><td>The LTQ mass spectrometer is used for acquiring tandem MS data</td></tr><tr><td>XYZ stage</td><td>Newport</td><td>Multiple parts</td><td>The home-built XYZ stage is used to adapt the commercial LTQ nano-ESI source to receive input from various sample delivery systems</td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td>Edmund optics</td><td>G81-278</td><td>The microscope is used to observe the microreactor packing process</td></tr><tr><td>Analytical balance/Metler</td><td>VWR</td><td>46600-204</td><td>The balance is used to weigh the protein samples</td></tr><tr><td>Ultrasonic bath/Branson</td><td>VWR</td><td>33995-540</td><td>The sonic bath is used for mixing/homogenizing the samples and dispersing the C18 particle slurry</td></tr><tr><td>Syringe pump 22</td><td>Harvard Apparatus</td><td>552222</td><td>The micropump is used for loading, rinsing and eluting the sample and the enzyme on and from the packed capillary microreactor</td></tr><tr><td>Milli-Q ultrapure water system</td><td>EMD Millipore</td><td>ZD5311595&amp;nbsp;</td><td>The MilliQ water system is used to prepare purified DI water</td></tr><tr><td>Pipettor/Eppendorf (1,000&amp;nbsp;&amp;micro;l)</td><td>VWR</td><td>53513-410</td><td>The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions</td></tr><tr><td>Pipettor/Eppendorf (100&amp;nbsp;&amp;micro;l)</td><td>VWR</td><td>53513-406</td><td>The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions</td></tr><tr><td>Pipettor/Eppendorf (10&amp;nbsp;&amp;micro;l)</td><td>VWR</td><td>53513-402</td><td>The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions</td></tr><tr><td>Fused silica capillary (100 &amp;micro;m ID x 360 &amp;micro;m OD)</td><td>Polymicro Technologies</td><td>TSP100375</td><td>This capillary is used for the fabrication of the microreactor</td></tr><tr><td>Fused silica capillary (20&amp;nbsp;&amp;micro;m ID x 100 &amp;micro;m OD)</td><td>Polymicro Technologies</td><td>TSP020090</td><td>This capillary is used for the fabrication of the ESI emitter</td></tr><tr><td>Fused silica capillary (50&amp;nbsp;&amp;micro;m ID x 360 &amp;micro;m OD)</td><td>Polymicro Technologies</td><td>TSP050375</td><td>This capillary is used to transfer the samples and the eluent from the syringe pump to the capillary microreactor</td></tr><tr><td>Glass capillary cleaver</td><td>Supelco</td><td>23740-U</td><td>This is a tool for cutting fused silica capillaries at the desired length</td></tr><tr><td>Glue</td><td>Eclectic Products</td><td>E6000 Craft</td><td>This glue is used for securing the ESI emitter into the capillary microreactor or the microfluidic chip</td></tr><tr><td>Epoxy glue</td><td>Epo-Tek</td><td>353NDT</td><td>This glue is used to seal the microfluidic inlet hole through which the C18 particles are loaded</td></tr><tr><td>Reversed phase C18 particles (5&amp;nbsp;&amp;micro;m)</td><td>Agilent Technologies</td><td>Zorbax 300SB-C18</td><td>These are C18 particles on which the proteins are adsorbed; the particles were extracted from a 4&amp;nbsp;mm x 20 cm C18 LC column from Agilent</td></tr><tr><td>Syringe/glass (250 &amp;micro;l)</td><td>Hamilton</td><td>81130-1725RN</td><td>The glass syringes are used to load the C18 particle slurry in the capillary microreactor and to deliver the sample and eluents to the microreactor</td></tr><tr><td>Internal reducing PEEK Union (1/16&amp;rdquo; to 1/32&amp;rdquo;)</td><td>Valco</td><td>ZRU1.5FPK</td><td>This union is used to connect the 250 &amp;micro;l syringe to the microreactor for loading the 5 &amp;micro;m particle slurry</td></tr><tr><td>Stainless steel union (1/16&amp;rdquo;)</td><td>Valco</td><td>ZU1XC</td><td>The stainless steel union is used to connect the glass syringe needle to the infusion capillary</td></tr><tr><td>Microvolume PEEK Tee connector (1/32&amp;rdquo;)</td><td>Valco</td><td>MT.5XCPK</td><td>The Peek tee is used to connect the sample transfer capillary to the capillary microreactor; on its side arm, it enables the insertion of the Pt wire</td></tr><tr><td>Tee connector (light weight)</td><td>Valco</td><td>C-NTXFPK</td><td>This Tee connector is used to apply ESI voltage to the microfluidic chip through the sample transfer line</td></tr><tr><td>Pt wire (0.404 mm)</td><td>VWR</td><td>66260-126</td><td>The Pt wire provides electrical connection for ESI generation and is connected to the mass spectrometer ESI power supply</td></tr><tr><td>PTFE tubing (1/16&amp;rdquo; OD)</td><td>Valco</td><td>TTF115-10FT</td><td>The Teflon tubing is used to enable an air-tight connection between the syringe needle and the stainless steel union&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PEEK tubing (0.015&amp;rdquo; ID x 1/16&amp;rdquo; OD)</td><td>Upchurch Scientific</td><td>1565</td><td>The Peek tubing is used as a sleeve to enable an air-tight connection between the stainless steel union and the 50&amp;nbsp;&amp;micro;m ID transfer capillary</td></tr><tr><td>PEEK tubing (0.015&amp;rdquo; ID x 1/32&amp;rdquo; OD)</td><td>Valco</td><td>TPK.515-25</td><td>The Peek tubing is used as a sleeve to enable a leak-free connection between the fused silica capillaries and the Peek Tee</td></tr><tr><td>Clean-cut polymer tubing cutter</td><td>Valco</td><td>JR-797</td><td>This cutter is used to pre-cut the 1/16&amp;rdquo; and 1/32&amp;rsquo; Peek polymer tubing that is used as sleeve for leak-free connections in pieces of ~4-5 cm in length</td></tr><tr><td>Amber vial (2 ml)</td><td>Agilent&amp;nbsp;</td><td>HP-5183-2069</td><td>The vials are used to prepare sample solutions and the C18 particle slurry&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Amber vial (4 ml)</td><td>VWR</td><td>66011-948</td><td>The vials are used to prepare sample solutions</td></tr><tr><td>Polypropylene tube (15&amp;nbsp;ml)</td><td>Fisher</td><td>12-565-286D</td><td>The vials are used to prepare buffer solutions</td></tr><tr><td>Cylinder (100 ml)</td><td>VWR</td><td>24710-463</td><td>The cylinder is used to measure volumes of solvent</td></tr><tr><td>Cylinder (10 ml)</td><td>VWR</td><td>24710-441</td><td>The cylinder is used to measure volumes of solvent</td></tr><tr><td>Pipette tips (1,000 &amp;micro;l)</td><td>VWR</td><td>83007-386</td><td>The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions</td></tr><tr><td>Pipette tips (100 &amp;micro;l)</td><td>VWR</td><td>53503-781</td><td>The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions</td></tr><tr><td>Pipette tips (10 &amp;micro;l)</td><td>VWR</td><td>53511-681</td><td>The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions</td></tr><tr><td>Glass substrates</td><td>Nanofilm</td><td>B270 white crown, 3&amp;rdquo; x 3&amp;rdquo;</td><td>These are glass substrates for microchip fabrication</td></tr><tr><td>Male nut fitting (1/16&amp;rdquo;)</td><td>Upchurch</td><td>P203X</td><td>This fitting is used for connecting transfer capillaries to the microfluidic chip</td></tr><tr><td>Nanoport assembly</td><td>Upchurch</td><td>N-122H</td><td>This fitting is used for connecting transfer capillaries to the microfluidic chip</td></tr><tr><td>Protein standards</td><td>Sigma</td><td>Multiple #</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile, HPLC grade</td><td>Fisher</td><td>A955</td><td></td></tr><tr><td>Methanol, HPLC grade</td><td>Fisher</td><td>A452</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol, HPLC grade</td><td>Sigma</td><td>650447</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid</td><td>Sigma</td><td>302031</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium bicarbonate</td><td>Aldrich</td><td>A6141</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin, sequencing grade</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr></tbody></table>

fast enzymatic processing of proteins for ms detection with a flow-through microreactor

質量分析（MS）の大部分は、タンパク質分析方法は、典型的にはトリプシン、検出前に酵素消化工程を含むベース。この工程は、質量分析計測器の有効走査範囲内MW &lt;3,000-4,000ダで一般に、低分子量ペプチドの生成のために必要です。従来のプロトコルは、37ºCでO / N酵素消化を伴います。最近の進歩は、典型的には、例えば 、マイクロ波または高固定化酵素または数分にタンパク質分解消化に必要な時間を短縮する相補的な物理的プロセス（の範囲のマイクロリアクターの使用を含む様々な戦略の開発につながっています圧力）。この研究では、タンパク質の迅速な酵素消化を達成するための任意の実験室で実施することができる簡単で費用効果的なアプローチを記載します。タンパク質（またはタンパク質の混合物）は、C18結合逆相高速PERFに吸着されていますキャピラリーカラムにプリロード液体クロマトグラフィー（HPLC）、シリカ粒子をormance、そして水性緩衝液中のトリプシンを短時間で粒子上に注入されます。オンラインのMS検出を有効にするには、トリプシンペプチドは、MSイオン源で直接増加有機含有量の溶媒系で溶出されています。このアプローチは、高価な固定化酵素粒子の使用を回避し、プロセスを完了するための任意の援助を必要としません。タンパク質消化および完全なサンプルの分析は、それぞれ、2〜3分と約30分未満で達成することができます。

タンパク質分解性消化プロセスの代表的な結果は、上述したマイクロリアクター（ 図1または2）、 表1に提供されて、タンパク質の混合物を同時に行う。テーブルは、特定のタンパク質を同定する独特のペプチド配列を含み、クロス切れ残りの相関スコア（XCORR）（ すなわち 、対応するタンデム質量スペクトルの実験対理論上のマッチ...

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Fast Enzymatic Processing of Proteins for MS Detection with a Flow-through Microreactor

フロースルーマイクロリアクターとMS検出のためのタンパク質の高速酵素処理

A quick protocol for proteolytic digestion with an in-house built flow-through tryptic microreactor coupled to an electrospray ionization (ESI) mass spectrometer is presented. The fabrication of the microreactor, the experimental setup and the data acquisition process are described.

The vast majority of mass spectrometry (MS)-based protein analysis methods involve an enzymatic digestion step prior to detection, typically with trypsin. ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.9K ビュー.  Virginia Tech. A quick protocol for proteolytic digestion with an in-house built flow-through tryptic microreactor coupled to an electrospray ionization (ESI) mass spectrometer is presented. The fabrication of the microreactor, the experimental setup and the data acquisition process are described.

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Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. Hydrogen-Deuterium Exchange (HDX) measured at rapid time scales is uniquely suited to detect structures and hydrogen bonding networks that are briefly populated, allowing for the characterization of transient conformers in native ensembles. Coupling of HDX to mass spectrometry offers several key advantages, including high sensitivity, low sample consumption and no restriction on protein size. This technique has advanced greatly in the last several decades, including the ability to monitor HDX labeling times on the millisecond time scale. In addition, by incorporating the HDX workflow onto a microfluidic platform housing an acidic protease microreactor, we are able to localize dynamic properties at the peptide level. In this study, Time-Resolved ElectroSpray Ionization Mass Spectrometry (TRESI-MS) coupled to HDX was used to provide a detailed picture of residual structure in the tau protein, as well as the conformational shifts induced upon hyperphosphorylation.

Conformational flexibility plays a critical role in protein function. Herein, we describe the use of time-resolved electrospray ionization mass spectrometry coupled to hydrogen-deuterium exchange for probing the rapid structural changes that drive function in ordered and disordered proteins.

時間分解エレクトロスプレーイオン化水素 - 重水素交換質量分析タンパク質の構造とダイナミクスを学ぶために

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

生化学

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, glass coverslips are functionalized in a one-step reaction with silane-PEG-biotin. Flow cells are constructed by sandwiching an adhesive tape with pre-cut channels between a functionalized coverslip and a PDMS slab containing inlet and outlet holes. Multiple channels are integrated into one flow cell and the flow of reagents into each channel can be fully automated, which significantly increases the assay throughput and reduces hands-on time per assay. Inside each channel, biotin-&#955;-DNAs are immobilized on the surface and a laminar flow is applied to flow-stretch the DNAs. The DNA molecules are stretched to &#62;80% of their contour length and serve as spatially extended templates for studying the binding and transport activity of fluorescently labeled molecules. The trajectories of single molecules are tracked by time-lapse Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) imaging. Raw images are analyzed using streamlined custom single particle tracking software to automatically identify trajectories of single molecules diffusing along DNA and estimate their 1D diffusion constants.

This protocol demonstrates a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying one-dimensional (1D) diffusion of molecules along DNA.

シンプルで堅牢、かつ高スループットの単一分子 DNA 分子の輸送を研究するためのストレッチ法の実装を流れ

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

Microfluidic Mixers for Studying Protein Folding

The process by which a protein folds into its native conformation is highly relevant to biology and human health yet still poorly understood. One reason for this is that folding takes place over a wide range of timescales, from nanoseconds to seconds or longer, depending on the protein1. Conventional stopped-flow mixers have allowed measurement of folding kinetics starting at about 1 ms. We have recently developed a microfluidic mixer that dilutes denaturant ~100-fold in ~8 &mu;s2. Unlike a stopped-flow mixer, this mixer operates in the laminar flow regime in which turbulence does not occur. The absence of turbulence allows precise numeric simulation of all flows within the mixer with excellent agreement to experiment3-4.
Laminar flow is achieved for Reynolds numbers Re &le;100. For aqueous solutions, this requires micron scale geometries. We use a hard substrate, such as silicon or fused silica, to make channels 5-10 &mu;m wide and 10 &mu;m deep (See Figure 1). The smallest dimensions, at the entrance to the mixing region, are on the order of 1 &mu;m in size. The chip is sealed with a thin glass or fused silica coverslip for optical access. Typical total linear flow rates are ~1 m/s, yielding Re~10, but the protein consumption is only ~0.5 nL/s or 1.8 &mu;L/hr. Protein concentration depends on the detection method: For tryptophan fluorescence the typical concentration is 100 &mu;M (for 1 Trp/protein) and for FRET the typical concentration is ~100 nM.
The folding process is initiated by rapid dilution of denaturant from 6 M to 0.06 M guanidine hydrochloride. The protein in high denaturant flows down a central channel and is met on either side at the mixing region by buffer without denaturant moving ~100 times faster (see Figure 2). This geometry causes rapid constriction of the protein flow into a narrow jet ~100 nm wide. Diffusion of the light denaturant molecules is very rapid, while diffusion of the heavy protein molecules is much slower, diffusing less than 1 &mu;m in 1 ms. The difference in diffusion constant of the denaturant and the protein results in rapid dilution of the denaturant from the protein stream, reducing the effective concentration of the denaturant around the protein. The protein jet flows at a constant rate down the observation channel and fluorescence of the protein during folding can be observed using a scanning confocal microscope5.

In this work we explain the fabrication and use of a microfluidic mixer capable of mixing two solutions in ~8 &mu;s. We also demonstrate the use of these mixers with spectroscopic detection using UV fluorescence and fluorescence resonance energy transfer (FRET).

タンパク質の折り畳みを研究するためのマイクロ流体ミキサー

The process by which a protein folds into its native conformation is highly relevant to biology and human health yet still poorly understood. One reason ...

生物工学

Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this work, the pre-endosomal anthrax toxin is assembled and transitioned into the endosomal complex. First, the N-terminal domain of a cysteine mutant lethal factor (LFN) is attached to a biolayer interferometry (BLI) biosensor through disulfide coupling in an optimal orientation, allowing protective antigen (PA) prepore to bind (Kd 1 nM). The optimally oriented LFN-PAprepore complex then binds to soluble capillary morphogenic gene-2 (CMG2) cell surface receptor (Kd 170 pM), resulting in a representative anthrax pre-endosomal complex, stable at pH 7.5. This assembled complex is then subjected to acidification (pH 5.0) representative of the late endosome environment to transition the PAprepore into the membrane inserted pore state. This PApore state results in a weakened binding between the CMG2 receptor and the LFN-PApore and a substantial dissociation of CMG2 from the transition pore. The thio-attachment of LFN to the biosensor surface is easily reversed by dithiothreitol. Reduction on the BLI biosensor surface releases the LFN-PAprepore-CMG2 ternary complex or the acid transitioned LFN-PApore complexes into microliter volumes. Released complexes are then visualized and identified using electron microscopy and mass spectrometry. These experiments demonstrate how to monitor the kinetic assembly/disassembly of specific protein complexes using label-free BLI methodologies and evaluate the structure and identity of these BLI assembled complexes by electron microscopy and mass spectrometry, respectively, using easy-to-replicate sequential procedures.

Here we present a protocol to monitor the assembly and disassembly of the anthrax toxin using biolayer interferometry (BLI). Following assembly/disassembly on the biosensor surface, the large protein complexes are released from the surface for visualization and identification of components of the complexes using electron microscopy and mass spectrometry, respectively.

動的タンパク質複合体の分析の組み立てし、質量分析法と電子顕微鏡を用いた Biolayer 干渉法によるバイオ センサーから解放

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions largely depend on intracellular protein&#8211;protein interactions. Therefore, research regarding these interactions is indispensable to facilitating the understanding of physiologic processes. Co-precipitation of associated proteins, followed by mass spectrometry (MS) analysis, enables the identification of novel protein interactions. In this study, we have provided details of the novel technique of immunoprecipitation-liquid chromatography (LC)-MS/MS analysis combined with on-membrane digestion for the analysis of protein&#8211;protein interactions. This technique is suitable for crude immunoprecipitants and can improve the throughput of proteomic analyses. Tagged recombinant proteins were precipitated using specific antibodies; next, immunoprecipitants blotted onto polyvinylidene difluoride membrane pieces were subjected to reductive alkylation. Following trypsinization, the digested protein residues were analyzed using LC-MS/MS. Using this technique, we were able to identify several candidate associated proteins. Thus, this method is convenient and useful for the characterization of novel protein&#8211;protein interactions.

Here, we present a protocol for an on-membrane digestion technique for the preparation of samples for mass spectrometry. This technique facilitates the convenient analysis of protein&#8211;protein interactions.

膜上消化技術を用いてのタンパク質・タンパク質相互作用の評価

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Platform Incubator with Movable XY Stage: A New Platform for Implementing In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

Fast Photochemical Oxidation of proteins (FPOP) coupled with mass spectrometry (MS) has become an invaluable tool in structural proteomics to interrogate protein interactions, structure, and protein conformational dynamics as a function of solvent accessibility. In recent years, the scope of FPOP, a hydroxyl radical protein foot printing (HRPF) technique, has been expanded to protein labeling in live cell cultures, providing the means to study protein interactions in the convoluted cellular environment. In-cell protein modifications can provide insight into ligand induced structural changes or conformational changes accompanying protein complex formation, all within the cellular context. Protein footprinting has been accomplished employing a customary flow-based system and a 248 nm KrF excimer laser to yield hydroxyl radicals via photolysis of hydrogen peroxide, requiring 20 minutes of analysis for one cell sample.To facilitate time-resolved FPOP experiments, the use of a new 6-well plate-based IC-FPOP platform was pioneered. In the current system, a single laser pulse irradiates one entire well, which truncates the FPOP experimental time frame resulting in 20 seconds of analysis time, a 60-fold decrease. This greatly reduced analysis time makes it possible to research cellular mechanisms such as biochemical signaling cascades, protein folding, and differential experiments (i.e., drug-free vs. drug bound) in a time-dependent manner. This new instrumentation, entitled Platform Incubator with Movable XY Stage (PIXY), allows the user to perform cell culture and IC-FPOP directly on the optical bench using a platform incubator with temperature, CO2 and humidity control. The platform also includes a positioning stage, peristaltic pumps, and mirror optics for laser beam guidance. IC-FPOP conditions such as optics configuration, flow rates, transient transfections, and H2O2 concentration in PIXY have been optimized and peer-reviewed. Automation of all components of the system will reduce human manipulation and increase throughput.

A new static platform is used to characterize protein structure and interaction sites in the native cell environment utilizing a protein footprinting technique called in-cell fast photochemical oxidation of proteins (IC-FPOP).

可動XYステージを用いてプラットフォームインキュベーター:タンパク質の細胞内高速光化学酸化を実装するための新しいプラットフォーム

Fast Photochemical Oxidation of proteins (FPOP) coupled with mass spectrometry (MS) has become an invaluable tool in structural proteomics to interrogate ...

Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and prognosis of disease. While clinical proteomic methods vary widely, a common characteristic is the need for (i) extraction of proteins from extremely heterogeneous fluids (i.e. serum, whole blood, etc.) and (ii) extensive biochemical processing prior to analysis. Here, we report a new digital microfluidics (DMF) based method integrating several processing steps used in clinical proteomics. This includes protein extraction, resolubilization, reduction, alkylation and enzymatic digestion. Digital microfluidics is a microscale fluid-handling technique in which nanoliter-microliter sized droplets are manipulated on an open surface. Droplets are positioned on top of an array of electrodes that are coated by a dielectric layer - when an electrical potential is applied to the droplet, charges accumulate on either side of the dielectric. The charges serve as electrostatic handles that can be used to control droplet position, and by biasing a sequence of electrodes in series, droplets can be made to dispense, move, merge, mix, and split on the surface. Therefore, DMF is a natural fit for carrying rapid, sequential, multistep, miniaturized automated biochemical assays. This represents a significant advance over conventional methods (relying on manual pipetting or robots), and has the potential to be a useful new tool in clinical proteomics.
Mais J. Jebrail, Vivienne N. Luk, and Steve C. C. Shih contributed equally to this work.
Sergio L. S. Freire's current address is at the University of the Sciences in Philadelphia located at 600 South 43rd Street, Philadelphia, PA 19104.

Digital Microfluidics is a technique characterized by the manipulation of discrete droplets (~nL - mL) on an array of electrodes by the application of electrical fields. It is well-suited for carrying out rapid, sequential, miniaturized automated biochemical assays. Here, we report a platform capable of automating several proteomic processing steps.

自動プロテオーム処理のためのデジタルマイクロ流体

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and ...

生物学

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an array of dynamic, multi-protein complexes1. To gain a mechanistic understanding of the various cellular processes, it is crucial to determine the structure of such protein complexes, and reveal how their structural organization dictates their function. Many aspects of multi-protein complexes are, however, difficult to characterize, due to their heterogeneous nature, asymmetric structure, and dynamics. Therefore, new approaches are required for the study of the tertiary levels of protein organization.
One of the emerging structural biology tools for analyzing macromolecular complexes is mass spectrometry (MS)2-5. This method yields information on the complex protein composition, subunit stoichiometry, and structural topology. The power of MS derives from its high sensitivity and, as a consequence, low sample requirement, which enables examination of protein complexes expressed at endogenous levels. Another advantage is the speed of analysis, which allows monitoring of reactions in real time. Moreover, the technique can simultaneously measure the characteristics of separate populations co-existing in a mixture. 
Here, we describe a detailed protocol for the application of structural MS to the analysis of large protein assemblies. The procedure begins with the preparation of gold-coated capillaries for nanoflow electrospray ionization (nESI). It then continues with sample preparation, emphasizing the buffer conditions which should be compatible with nESI on the one hand, and enable to maintain complexes intact on the other. We then explain, step-by-step, how to optimize the experimental conditions for high mass measurements and acquire MS and tandem MS spectra. Finally, we chart the data processing and analyses that follow. Rather than attempting to characterize every aspect of protein assemblies, this protocol introduces basic MS procedures, enabling the performance of MS and MS/MS experiments on non-covalent complexes. Overall, our goal is to provide researchers unacquainted with the field of structural MS, with knowledge of the principal experimental tools.

Mass spectrometry has proven to be a valuable tool for analyzing large protein complexes. This method enables insights into the composition, stoichiometry and overall architecture of multi-subunit assemblies. Here, we describe, step-by-step, how to perform a structural mass spectrometry analysis, and characterize macromolecular structures.

構造質量分析法によって大きなタンパク質複合体の分析

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

Electrowetting-based Digital Microfluidics Platform for Automated Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Electrowetting is the effect by which the contact angle of a droplet exposed to a surface charge is modified. Electrowetting-on-dielectric (EWOD) exploits the dielectric properties of thin insulator films to enhance the charge density and hence boost the electrowetting effect. The presence of charges results in an electrically induced spreading of the droplet which permits purposeful manipulation across a hydrophobic surface. Here, we demonstrate EWOD-based protocol for sample processing and detection of four categories of antigens, using an automated surface actuation platform, via two variations of an Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) methods. The ELISA is performed on magnetic beads with immobilized primary antibodies which can be selected to target a specific antigen. An antibody conjugated to HRP binds to the antigen and is mixed with H2O2/Luminol for quantification of the captured pathogens. Assay completion times of between 6 and 10 min were achieved, whilst minuscule volumes of reagents were utilized.

Electrowetting-based digital microfluidic is a technique that utilizes a voltage-driven change in the apparent contact angle of a microliter-volume droplet to facilitate its manipulation. Combining this with functionalized magnetic beads enables the integration of multiple laboratory unit operations for sample preparation and identification of pathogens using Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA).

酵素結合免疫吸着アッセイ用エレクトロウェッティングベースのデジタルマイクロ流体プラットフォーム

Electrowetting is the effect by which the contact angle of a droplet exposed to a surface charge is modified. Electrowetting-on-dielectric (EWOD) exploits ...

Millisecond Hydrogen/Deuterium-Exchange Mass Spectrometry for the Study of Alpha-Synuclein Structural Dynamics Under Physiological Conditions

Alpha-synuclein (aSyn) is an intrinsically disordered protein whose fibrillar aggregates are abundant in Lewy bodies and neurites, which are the hallmarks of Parkinson's disease. Yet, much of its biological activity, as well as its aggregation, centrally involves the soluble monomer form of the protein. Elucidation of the molecular mechanisms of aSyn biology and pathophysiology requires structurally highly resolved methods and is sensitive to biological conditions. Its natively unfolded, meta-stable structures make monomeric aSyn intractable to many structural biology techniques. Here, the application of one such approach is described: hydrogen/deuterium-exchange mass spectrometry (HDX-MS) on the millisecond timescale for the study of proteins with low thermodynamic stability and weak protection factors, such as aSyn. At the millisecond timescale, HDX-MS data contain information on the solvent accessibility and hydrogen-bonded structure of aSyn, which are lost at longer labeling times, ultimately yielding structural resolution up to the amino acid level. Therefore, HDX-MS can provide information at high structural and temporal resolutions on conformational dynamics and thermodynamics, intra- and inter-molecular interactions, and the structural impact of mutations or alterations to environmental conditions. While broadly applicable, it is demonstrated how to acquire, analyze, and interpret millisecond HDX-MS measurements in monomeric aSyn.

The structural ensemble of monomeric alpha-synuclein affects its physiological function and physicochemical properties. The present protocol describes how to perform millisecond hydrogen/deuterium-exchange mass spectrometry and subsequent data analyses to determine conformational information on the monomer of this intrinsically disordered protein under physiological conditions.

生理学的条件下でのα-シヌクレイン構造ダイナミクスの研究のためのミリ秒水素/重水素交換質量分析

Alpha-synuclein (aSyn) is an intrinsically disordered protein whose fibrillar aggregates are abundant in Lewy bodies and neurites, which are the hallmarks ...

フロースルーマイクロリアクターとMS検出のためのタンパク質の高速酵素処理

要約

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時間分解エレクトロスプレーイオン化水素 - 重水素交換質量分析タンパク質の構造とダイナミクスを学ぶために

シンプルで堅牢、かつ高スループットの単一分子 DNA 分子の輸送を研究するためのストレッチ法の実装を流れ

タンパク質の折り畳みを研究するためのマイクロ流体ミキサー

動的タンパク質複合体の分析の組み立てし、質量分析法と電子顕微鏡を用いた Biolayer 干渉法によるバイオセンサーから解放

膜上消化技術を用いてのタンパク質・タンパク質相互作用の評価

可動XYステージを用いてプラットフォームインキュベーター:タンパク質の細胞内高速光化学酸化を実装するための新しいプラットフォーム

自動プロテオーム処理のためのデジタルマイクロ流体

構造質量分析法によって大きなタンパク質複合体の分析

酵素結合免疫吸着アッセイ用エレクトロウェッティングベースのデジタルマイクロ流体プラットフォーム

生理学的条件下でのα-シヌクレイン構造ダイナミクスの研究のためのミリ秒水素/重水素交換質量分析

フロースルーマイクロリアクターとMS検出のためのタンパク質の高速酵素処理

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時間分解エレクトロスプレーイオン化水素 - 重水素交換質量分析タンパク質の構造とダイナミクスを学ぶために

シンプルで堅牢、かつ高スループットの単一分子 DNA 分子の輸送を研究するためのストレッチ法の実装を流れ

タンパク質の折り畳みを研究するためのマイクロ流体ミキサー

動的タンパク質複合体の分析の組み立てし、質量分析法と電子顕微鏡を用いた Biolayer 干渉法によるバイオ センサーから解放

膜上消化技術を用いてのタンパク質・タンパク質相互作用の評価

可動XYステージを用いてプラットフォームインキュベーター:タンパク質の細胞内高速光化学酸化を実装するための新しいプラットフォーム

自動プロテオーム処理のためのデジタルマイクロ流体

構造質量分析法によって大きなタンパク質複合体の分析

酵素結合免疫吸着アッセイ用エレクトロウェッティングベースのデジタルマイクロ流体プラットフォーム

生理学的条件下でのα-シヌクレイン構造ダイナミクスの研究のためのミリ秒水素/重水素交換質量分析

動的タンパク質複合体の分析の組み立てし、質量分析法と電子顕微鏡を用いた Biolayer 干渉法によるバイオセンサーから解放